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Methodenartikel

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

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DOI:

10.3791/60925

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2. März 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Regenerative Medicine and Stem Cell (RMSC) Research Center, Ben-Gurion University of the Negev, 3The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, 4The Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Division of Micro and Nanosystems, KTH Royal Institute of Technology, 6AIMES, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine multizelluläre neurovaskuläre Einheit, die die Homöostase des Gehirns streng reguliert. Durch die Kombination menschlicher iPSCs und Organ-on-Chip-Technologien haben wir einen personalisierten BBB-Chip entwickelt, der für die Krankheitsmodellierung und Diedurchlässigkeitsvorhersagen von CNS-Medikamenten geeignet ist. Für die Erzeugung und den Betrieb des BBB-Chips wird ein detailliertes Protokoll beschrieben.

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) wird durch neurovaskuläre Einheiten (NVUs) gebildet, die das zentrale Nervensystem (ZNS) vor einer Reihe von Faktoren im Blut abschirmen, die die empfindliche Gehirnfunktion stören können. Daher stellt die BBB ein großes Hindernis für die Abgabe von Therapeutika an das ZNS dar. Die sich anhäufenden Beweise deuten darauf hin, dass die BBB eine Schlüsselrolle beim Beginn und Fortschreiten neurologischer Erkrankungen spielt. Daher besteht ein enormer Bedarf an einem BBB-Modell, das die Penetration von CNS-gezielten Medikamenten vorhersagen und die Rolle des BBB bei Gesundheit und Krankheit aufklären kann.

Wir haben vor kurzem Organ-on-Chip und induzierte pluripotente Stammzell -Technologien (iPSC) kombiniert, um einen BBB-Chip zu erzeugen, der vollständig für den Menschen personalisiert ist. Diese neuartige Plattform zeigt zelluläre, molekulare und physiologische Eigenschaften, die für die Vorhersage des Arzneimittel- und Molekültransports über den menschlichen BBB geeignet sind. Darüber hinaus haben wir mit patientenspezifischen BBB-Chips Modelle neurologischer Erkrankungen generiert und das Potenzial für personalisierte Prädiktive Medizinanwendungen demonstriert. Hier ist ein detailliertes Protokoll, das zeigt, wie iPSC-abgeleitete BBB-Chips erzeugt werden können, beginnend mit der Differenzierung von iPSC-abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen (iBMECs) im Gehirn und der Daraus resultierenden gemischten neuronalen Kulturen, die neuronale Vorläufer enthalten, differenzierte Neuronen und Astrozyten. Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zur Aussaat von Zellen in den Organchip und zur Kultivierung der BBB-Chips unter kontrolliertem laminaren Fluss. Schließlich werden detaillierte Beschreibungen der BBB-Chipanalysen bereitgestellt, einschließlich parazellulärer Permeabilitätstests zur Beurteilung der Wirkstoff- und Moleküldurchlässigkeit sowie immunzytochemische Methoden zur Bestimmung der Zusammensetzung von Zelltypen innerhalb des Chips.

Einleitung

Die BBB ist eine hochselektive Barriere, die das ZNS vom zirkulierenden Blut trennt. Es schützt kritische Gehirnfunktionen vor potenziell störenden Substanzen, Faktoren und Xenobiotika und ermöglicht gleichzeitig den Zustrom von Nährstoffen und anderen Metaboliten, die zur Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns erforderlich sind1. Die BBB ist eine multizelluläre NVU, in der Pericyte, Astrozytenendfüße und neuronale Prozesse direkt mit mikrovaskulären Endothelzellen (BMECs) im Gehirn in Kontakt treten. Diese Interaktionen ermöglichen es BMECs, spezielle Barriereeigenschaften zu bilden, die durch enge und haftetende Knoten unterstützt werden2,3. Die Bildung dieser Barriere begrenzt den parazellulären Durchgang von Molekülen, aber es enthält polarisierte Transporter, um Moleküle aktiv in das ZNS oder zurück ins Blut zu transportieren1. Aufgrund dieser einzigartigen Barriereeigenschaften stellt die BBB ein großes Hindernis für die Lieferung von Biopharmazeutika in das Gehirn dar, und es wird geschätzt, dass weniger als 5% der von der FDA zugelassenen kleinen Moleküle das ZNS4erreichen können.

Tiermodelle wurden häufig verwendet, um BBB-Penetranz und die molekularen Mechanismen der BBB-Entwicklung zu untersuchen5. Während Tiermodelle die komplexe multizelluläre In-vivo-Umgebung getreu darstellen, schließen Unterschiede in Expression und Aktivität von BBB-Transportern sowie die speziesspezifitätsspezifisch oft eine genaue Extrapolation von Tierdaten auf den Menschenaus 6. Daher sind humanbasierte Modelle entscheidend für die Untersuchung des menschlichen BBB und für den Einsatz bei der Entwicklung von Medikamenten, die auf das ZNS abzielen. Diese Notwendigkeit wird durch die zunehmende Dominanz biologischer, humanspezifischer Arzneimittel im Bereich der pharmazeutischen Entwicklung noch deutlicher. Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass ein kompromittierter BBB mit einer Reihe von schweren ZNS-Erkrankungen verbunden ist, einschließlich Hirntumoren und neurologischen Erkrankungen7,8,9. Menschliche Modelle, die diese Krankheiten getreu widerspiegeln, haben das Potenzial, sowohl 1) neue Wege zu identifizieren, die für die Arzneimittelentwicklung gezielt werden könnten, als auch 2) Die Penetranz von ZNS vorherzusagen, wodurch Zeit und Ressourcen in präklinischen Studien reduziert und möglicherweise die Ausfallrate in klinischen Studien verringert wird.

In-vitro-Modelle wurden weit verbreitet, um Wechselwirkungen zwischen BMECs und anderen Zellen der NVU zu untersuchen und Bildschirme für prospektive BBB-durchlässige Medikamente10durchzuführen. Um Schlüsselaspekte des menschlichen BBB nachzubilden, müssen In-vitro-Modelle physiologisch relevante Eigenschaften aufweisen (d. h. geringe parazelluläre Durchlässigkeit und physiologisch relevanter transendotheliale elektrischer Widerstand [TEER] über die endotheliale Monoschicht). Darüber hinaus muss das molekulare Profil eines In-vitro-Systems die Expression repräsentativer funktioneller Transportsysteme umfassen. Typischerweise bestehen In-vitro-Modelle aus Endothelzellen, die auf einer semipermeablen Membran mit Kombinationen anderer NVU-Zellen kokultiviert werden, um die BBB-Eigenschaften zu verbessern11. Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache und relativ schnelle Beurteilung der Barrierefunktionalität und der Moleküldurchlässigkeit. Solche zellbasierten BBB-Modelle können mit tierischen oder menschlichen Zellquellen hergestellt werden, einschließlich Zellen, die aus chirurgischen Exzisionen oder verewigten BMEC-Linien isoliert sind.

Kürzlich wurden Protokolle zur Unterscheidung menschlicher pluripotenter Zellen in BMECs als attraktive Quelle für in vitro humane BBB-Modelle12,13eingeführt. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete BMECs (iBMECs) sind hochgradig skalierbar, zeigen entscheidende morphologische und funktionelle Eigenschaften des menschlichen BBB und tragen die Genetik des Patienten. In der Kultur bilden iBMECs eine Monoschicht, die enge Anschlussmarkierungen ausdrückt und in vivo-ähnlichen engen Kreuzungskomplexen anzeigt. Diese Zellen exprimieren auch BBB-Marker, einschließlich des BBB-Glukosetransporters, Glukosetransporter 1 (GLUT1). Wichtig ist, und im Gegensatz zu anderen alternativen Zellquellen für menschliche BMECs erfassen iBMECs Barriereeigenschaften mit Werten, die so hoch sind wie die in vivo14gemessenen, polarisieren entlang der basolateralen Achse und drücken funktionale Effluxpumpen aus. Darüber hinaus begrüßt die Verwendung von iPSCs aus verschiedenen Fächern beide 1) die Möglichkeit, Aspekte der BBB in einer personalisierten Medizin-Manier zu testen und 2) bietet eine flexible Quelle für die Erzeugung zusätzlicher Zelltypen der NVU. Die Erzeugung dieser Zellen aus einer isogenen Zellquelle zur Erstellung personalisierter BBB-Chips würde auch helfen, interindividuelle Unterschiede in den Arzneimittelreaktionen zu verstehen, was eine Hauptursache für Resistenzen oder eine kompromittierte Reaktion auf die in klinischen Studien beobachtete Behandlung ist.

Die Verwendung von iBMECs als Monolayer in einer Schale oder auf einem halbdurchlässigen Transwell-Einsatz stellt einen leistungsstarken Ansatz für die BBB-Modellierung dar. Diese Systeme sind in der Regel robust, reproduzierbar und kostengünstig. Darüber hinaus sind Funktionsanalysen wie TEER und Permeabilität relativ einfach durchzuführen. Zweidimensionale (2D) Systeme können jedoch die 3D-Natur des In-vivo-Gewebes nicht rekapitulieren, und ihnen fehlen die physiologischen Scherstresskräfte, die durch zirkulierende Blut- und Blutzellen bereitgestellt werden. Dies schränkt die Fähigkeit des vaskulären Endothels in diesen Modellen ein, intrinsische BBB-Eigenschaften und -Funktionen zu entwickeln und zu erhalten.

Mikrotechnische Systeme, die von lebenden Zellen gesäumt sind, wurden implementiert, um verschiedene Organfunktionen in einem Konzept zu modellieren, das Organ-on-Chips genannt wird. Durch die Nachbildung in vivo-ähnlicher multizellulärer Architektur, Gewebe-Gewebe-Schnittstellen, physikalisch-chemischer Mikroumgebungen und vaskulärer Perfusion erzeugen diese mikrotechnischen Plattformen ein Maß an Gewebe- und Organfunktionalität, das mit konventionellen 2D-Kultursystemen. Sie ermöglichen auch hochauflösende, Echtzeit-Bildgebung und Analyse von biochemischen, genetischen und metabolischen Profilen ähnlich wie lebende Zellen im in vivo Gewebe- und Organkontext. Eine besondere Herausforderung des Organ-on-Chip besteht jedoch darin, dass das Design, die Herstellung und die Anwendung dieser mikrotechnischen Chips spezielles technisches Know-how erfordert, das in biologisch orientierten akademischen Labors normalerweise fehlt.

Wir haben vor kurzem iPSC und Organ-on-Chip-Technologien kombiniert, um ein personalisiertes BBB-Chipmodell15,16zu generieren. Um die beschriebenen technologischen Herausforderungen zu meistern, wird der handelsübliche Chip-S1 zusammen mit dem Kulturmodul verwendet, einem Instrument, das die Wartung der Chips auf einfache und robuste Weise automatisieren soll (Emulate Inc.). Der BBB-Chip erzeugt Wechselwirkungen zwischen neuronalen und endotheliaalen Zellen und erreicht physiologisch relevante TEER-Werte, die durch maßgeschneiderte Organchips mit integrierten Goldelektroden17gemessen werden. Darüber hinaus zeigt der BBB-Chip eine geringe parazelluläre Durchlässigkeit, reagiert auf entzündliche Hinweise auf Organebene, drückt aktive Efflux-Pumpen aus und zeigt einen prädiktiven Transport von löslichen Biomarkern und Biopharmazeutika. Bemerkenswert ist, BBB-Chips von mehreren Personen erzeugt erfasst die erwarteten funktionellen Unterschiede zwischen gesunden Personen und Patienten mit neurologischen Erkrankungen15.

Das unten beschriebene Protokoll beschreibt eine zuverlässige, effiziente und reproduzierbare Methode zur Erzeugung menschlicher iPSC-basierter BBB-Chips unter dynamischen Strömungsbedingungen. Es werden Leitlinien für die Art der Assays und Endpunktanalysen bereitgestellt, die direkt im BBB-Chip oder aus Probenahmeabwässern durchgeführt werden können. So zeigt das Protokoll das Spektrum der Techniken, die zur Bewertung biologischer und funktioneller Eigenschaften und Reaktionen in einem humanrelevanten Modell eingesetzt werden können.

Eine kurze Beschreibung des iPSC-basierten BBB-Chips finden Sie hier. Humane iPSCs werden zunächst in Gewebekulturkolben als frei schwebende Aggregate neuronaler Vorläufer, sogenannteEZ-Kugeln, unterschieden und vermehrt. Der obere Kanal des Chip-S116,18,19 ist mit dissoziierten EZ-Kugeln gesät, die die "Gehirnseite" des Chips bilden, da sich Zellen über 7 Tage in eine gemischte Kultur von neuronalen Vorläuferzellen (iNPCs), iAstrozyten und iNeuronen differenzieren. Humane iPSCs werden auch in Gewebekulturplatten in iBMECs unterschieden. Der untere Kanal des Chips wird mit iBMECs gesät, um die "Blutseite" zu bilden, während sie sich zu einem Endothelrohr entwickeln (Abbildung 1). Die poröse extrazelluläre Matrix (ECM)-beschichtete Membran, die den oberen und unteren Kanal trennt 1) ermöglicht die Bildung von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zwischen Kanälen und 2) ermöglicht es dem Benutzer, Permeabilitätstests und Bildzellen in beiden Kanälen mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop auszuführen.

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Protokoll

1. Generierung von iPSC-abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen (iNPCs)

  1. Produziere EZ-Kugeln aus iPSC-Kolonien, wie unten beschrieben und wie zuvor veröffentlicht20,21,22.
    1. Kultur iPSC Kolonien zu konfluency auf Keller Membran Matrix-beschichtet 6 Brunnenplatten (0,5 mg/Platte) in mTESR1 oder anderen kommerziellen Medien (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Entfernen Sie iPSC Medium und ersetzen Sie durch 2 ml EZ-Kugelmedium [ESM; DMEM:F12 7:3 ergänzt durch 100 ng/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 100 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor, 5 g/ml Heparin und 2% B27-Ergänzung].
    3. Den Boden jedes Konfluents gut mit der Rückseite einer sterilen 1000-L-Pipettespitze oder einem Zellschaber verschrotten.
    4. Sammeln Sie alle Zellen und legen Sie in einem ultra-niedrigen Befestigungskolben T25 Kolben, um die spontane Bildung von frei schwebenden Kugeln zu ermöglichen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
    5. Füttern Sie die Kugeln alle 2 bis 3 Tage, wenn das Medium gelb wird, indem Sie die Hälfte des Mediums durch frischen ESM ersetzen. Dadurch können Kugeln in konditioniertem Medium verbleiben, was für ihr Wachstum und ihre Wartung sehr wichtig ist.
      1. Lehnen Sie den Kolben auf einem Rohrträger und lassen Sie die Kugeln durch Schwerkraft für 1-2 min bis zur Ecke des Kolbens zu setzen.
      2. Nach der Setzung die Hälfte des Überstandes mit einer 5 ml oder 10 ml serologischen Pipette aspirieren und durch frischen, vorgewärmten ESM ersetzen.
    6. Passage EZ-Kugeln wöchentlich durch Schneiden von Kugeln bis 200 m Durchmesser, wie zuvor beschrieben23,20,21. EZ-Kugeln können für bis zu 25 Passagen beibehalten werden und sind ideal, wenn sie zwischen den Durchgängen 8–25 verwendet werden.
  2. Vorbereiten der einzelzelligen Suspension von iNPCs:
    1. Um eine neuronale Differenzierung zu induzieren, dissoziieren Sie die EZ-Kugel in einzelne Zellen.
    2. Sammeln Sie Kugeln 3-4 Tage nach dem Hacken aus einem T75-Kolben und übertragen Sie in eine 15 ml konische, dann lassen Sie es für 2 min stehen oder bis alle Kugeln am Boden abgerechnet sind.
    3. Entfernen Sie ESM langsam mit einer 5 ml Pipette, ohne die besiedelten Kugeln zu stören. 1 ml Dissoziationslösung hinzufügen (siehe Materialtabelle) und 10 min bei 37 °C brüten.
    4. Wirbeln Sie die Dissoziationslösung und die Kugeln nach 5 min Inkubation, um sicherzustellen, dass alle besiedelten Kugeln behandelt werden.
    5. Entfernen Sie die Dissoziationslösung langsam. Fügen Sie 1 ml neuronales Differenzierungsmedium hinzu [NDM; DMEM: F12 mit 2% B27 minus Vitamin A, 1% N2-Ergänzung und neurotrophen Faktor des menschlichen Gehirns (hBDNF, 20 ng/ml)].
    6. Trituieren Sie die Kugeln in einzelne Zellen, indem Sie mit einer 1 ml Pipette gefolgt von einer 200-L-Pipette pipetieren, bis sich alle Kugeln getrennt haben. Vermeiden Sie Blasenbildung während des Triturierungsvorgangs.
    7. Zählen Sie dissoziierte Zellen mit einem Hämozytometer und verdünnn Sie Zellen bis zu einer Enddichte von 1 x 106 Zellen/ml. Es ist möglich, die Dichte je nach Anwendung zu ändern.
      HINWEIS: Höhere Dichten (bis zu 6 x 106 Zellen/ml) werden für kurzfristige Kulturen von bis zu 3 Tagen empfohlen, und niedrigere Dichten werden für langzeitige Anwendungen von bis zu 3 Wochen empfohlen.
      HINWEIS: Zellen sind nun bereit, in den oberen Kanal des Chips zu säen, um die "Gehirnseite" zu bilden.

2. Differenzierung von iPSCs in iBMECs

  1. Durchfahrt iPSCs aus einem einzigen Konfluentbrunnen einer 6-Well-Platte im Verhältnis 1:6 in eine 6-Well-Kellermembran-Matrix-beschichtete Platte. Lassen Sie Zellen für 24 h haften. Ändern Sie iPSC Medium täglich.
  2. Zählen Sie Zellen täglich mit einem Hämozytometer.
  3. Wenn Zellen eine Dichte von 1,5–3,0 x 105 Zellen/Well erreichen, ersetzen Sie iPSC-Medium durch 3 ml unkonditioniertes Medium ohne bFGF [DMEM:F12 1:1, mit 10% Knockout-Serumersatz (KOSR), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 0,5% Glutamin-Ergänzung (Materialtabelle) und 100 M.-Mercaptoethanol]. Ersetzen Sie Medium täglich für 6 Tage24.
  4. Ersetzen Sie an Tag 6 medium durch Endothelzell(EC) Medium [human esdotheliale serumfreies Medium (hESFM) ergänzt durch 1% Thrombozytenarmes Plasma-abgeleitetes Rinderserum, 20 ng/mL bFGF und 10 'M Alltrans-Retinoinsäure (RA)]. Lassen Sie Medium für 2 Tage.
  5. Entfernen Sie das EC-Medium und fügen Sie 1 ml Dissoziationslösung pro Bohrgut hinzu. 35 min bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: Während dies als eine lange Inkubationszeit in der hier verwendeten Dissoziationslösung gilt, können iBMECs diese Behandlung mit Zelllebensfähigkeit von mehr als 90 % ertragen.
  6. Lösen Sie die Zellen vom Brunnen, indem Sie die Zellsuspension sanft pipetieren und alle Zellen in ein 15 ml konisches Rohr sammeln.
    HINWEIS: Vermeiden Sie harte Pipetten. Wenn sich die Zellen nicht leicht lösen, brüten Sie für zusätzliche 5 min.
  7. Fügen Sie 1 Volumen EC-Medium in das 15 ml konische, um Accutase zu inaktivieren, Zentrifuge bei 200 x g für 5 min, entfernen Medium, und ersetzen sie mit 1 ml EC-Medium (ohne bFGF und RA).
  8. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zelldichte auf 14–20 x 106 Zellen/ml an.
    HINWEIS: Zellen sind nun bereit, in den unteren Kanal des Chips gesät zu werden, um die "Blutseite" zu bilden.

3. Mikrofertigung des Organchips

  1. Verwenden Sie einen Orgelchip für das BBB-Chipmodell und seine Produktion wie bisher16,18,19. Der Hochkanal-Orgelchip (siehe Materialtabelle) wird aus einem hochflexiblen Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomer hergestellt, das zwei überlagerte und parallele Mikrokanäle enthält, die durch eine flexible poröse Membran getrennt sind. Die oberen und unteren Mikrokanalgrößen sind 1 mm x 1 mm bzw. 1,0 mm x 0,2 mm. Die beiden Kanäle sind durch eine 50 m dicke, von PDMS hergestellte flexible poröse Membran getrennt, die Poren mit einem Durchmesser von 7 m mit einem Abstand von 40 m enthält. Die Oberfläche der porösen Membran, die die Kanäle trennt, beträgt 0,171 cm2.

4. Chip-Vorbereitung

  1. Organchips werden im Chipträger vorverpackt geliefert, sodass die Spanausrichtung während der Handhabung nicht gestört oder verzerrt werden muss. Darüber hinaus verbindet sich der Chipträger sicher mit einem tragbaren Modul ("Pod"), das als Schnittstelle zwischen Kulturmodul und Chip fungiert.
    1. Die Verpackung der Chips mit 70% Ethanol besprühen und in den Biosicherheitsschrank (BSC) bringen.
    2. Öffnen Sie die Verpackung und legen Sie den Organchip in einer sterilen Petrischale aus. Behandeln Sie den Chipträger nur seitlich, um direkten Kontakt mit dem Chip zu vermeiden.
    3. Stellen Sie sicher, dass die Registerkarte des Trägers nach rechts ausgerichtet ist (Abbildung 2), und richten Sie sie bei Verwendung mehrerer Chips in der gleichen Ausrichtung aus.
    4. Beschriften Sie jeden Chip auf der Trägerregisterkarte (vollständige Chipvorbereitung und -workflow sind in Abbildung 3dargestellt).

5. Oberflächenaktivierung und ECM-Beschichtung

  1. Vorbereitung der Oberflächenaktivierungslösung
    1. Das Emulizien reageimiert 1 (ER-1), das in einer Durchstechflasche mit 5 mg enthalten ist, ist lichtempfindlich. Bereiten Sie eine frische ER-1-Lösung unmittelbar vor der Anwendung vor. DIE Integrität von ER-1 ist entscheidend für die erfolgreiche Vorbereitung der Chips.
    2. Schalten Sie das Licht im BSC aus, wenn Sie MIT ER-1 umgehen.
      HINWEIS: ER-1 ist ein Augenreizungsmittel und muss im BSC mit richtigen Handschuhen und Augenschutz behandelt werden.
    3. Lassen Sie die ER-1- und ER-2-Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (RT) aussetzen.
    4. Schützen Sie die Lösung vor Licht, indem Sie ein leeres steriles 15 ml kegelförmiges Rohr mit Folie umwickeln.
    5. Tippen Sie im BSC kurz auf die ER-1-Durchstechflasche, um das Pulver unten zu begleichen.
    6. Fügen Sie 1 ml ER-2-Puffer in die Durchstechflasche und übertragen Sie ihren Inhalt sofort auf den Boden des 15 ml gewickelten konischen Rohres. Pipette nicht mischen. Die Farbe der Lösung, die auf das konische Rohr übertragen wird, ist rot.
    7. Wiederholen Sie Schritt 5.1.6 3x. In der letzten Runde die ER-1-Durchstechflasche kappen und invertieren, um das restliche Pulver aus dem Deckel zu sammeln, und dann die Lösung auf das konische Rohr übertragen; Dadurch wird das Gesamtvolumen auf 4 ml ER-1-Lösung gebracht.
    8. Fügen Sie der 4 ml ER-1-Lösung in der 15 ml konischen Röhre 6 ml ER-2-Lösung zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml hinzu. ER-1 sollte innerhalb der ER-2-Lösung vollständig aufgelöst werden.
  2. Oberflächenaktivierung
    1. Unter Verwendung einer P200-Pipette und einer sterilen 200-L-gefilterten Pipettenspitze nehmen Sie 200 L ER-1-Gemisch auf.
    2. Legen Sie die Pipette in den unteren Einlass und drücken Sie 20 L ER-1-Mischung durch den unteren Kanal, bis die Mischung beginnt, aus dem unteren Kanalauslass zu fließen.
    3. Fügen Sie ca. 50 l ER-1-Mischung hinzu und legen Sie sie in den oberen Kanaleinlass. Schieben Sie die Mischung durch den oberen Kanal, bis es aus dem oberen Kanalauslass zu fließen beginnt.
    4. Entfernen Sie alle überschüssigen ER-1-Gemisch von der Oberfläche des Chips durch sanfte Aspiration. Stellen Sie sicher, dass die ER-1-Mischung nur von der Spanoberfläche und nicht von den Kanälen entfernt wird.
    5. Stellen Sie sicher, dass die Kanäle vor der UV-Aktivierung frei von Luftblasen sind. Wenn Luftblasen erkannt werden, entfernen Sie Blasen, indem Sie den Kanal mit ER-1-Mischung waschen.
    6. Legen Sie die offene Schale mit den Chips in den UV-Lichtkasten (bereitgestellt von Emulate Inc.).
    7. Stellen Sie den Schalter an der Rückseite des UV-Leuchtkastens auf die Einstellung "Konsistent". Schalten Sie die Stromversorgung ein und initiieren Sie die UV-Aktivierung. Lassen Sie die Chips 20 min unter UV-Licht.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Exposition des Personals gegenüber UV-Licht.
    8. Entfernen Sie die ER-1-Mischung aus beiden Kanälen.
    9. Waschen Sie jeden Kanal mit 200 L ER-2-Lösung.
    10. Entfernen Sie ER-2 von beiden Kanälen.
    11. Waschen Sie jeden Kanal mit 200 l steriler kalter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS).
    12. Lassen Sie kalte DPBS innerhalb der Kanäle, bis Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
  3. Extrazelluläre Matrix (ECM) Vorbereitung und Beschichtung
    1. Bereiten Sie die ECM-Lösung vor, indem Sie die einzelnen ECM-Komponenten mit kaltem DPBS, Wasser oder anderem Lösungsmittel zu den endgültigen Arbeitskonzentrationen kombinieren. Die ECM-Lösung sollte bei jeder Verwendung frisch zubereitet werden.
    2. Mantel sowohl oberen und unteren Kanäledes des Chips mit ECM, mit Zusammensetzung, die durch den Zelltyp bestimmt werden soll. Das ECM-Gemisch muss bis zur Verwendung auf Eis gehalten werden.
    3. Verwenden Sie Laminin (50 g/ml), um die "Gehirnseite" zu beschichten, und Kollagen IV und Fibronectin gemischt im Verhältnis 4:1 (320:80 g/ml), um die "Blutseite" zu beschichten, wie in Abschnitt 5.6 beschrieben.
  4. Vorbereitung von ECM-Aliquots
    1. 1 mg/ml Laminin in kaltem DPBS auf eine Endkonzentration von 50 g/ml verdünnen. Aliquot und lagern Bei -20 °C bis zum Gebrauch.
    2. Kollagen IV in 0,1% Essigsäure in einer Konzentration von 1 mg/ml auflösen. Inkubieren Sie die Lösung bei 2–8 °C über Nacht oder bei RT für 1-3 h oder bis vollständig gelöst.
    3. Bereiten Sie eine 1 ml Mischung aus Kollagen IV:Fibronectin (320 l Kollagen IV, 80 l Fibronectin, 600 l sterile doppeldestillierteH2O) vor. Die Mischung kann bei -20 °C gelagert werden.
  5. Beschichtung der Chips mit ECM
    1. Vollständiges Ansaugen der kalten DPBS von beiden Kanälen. Legen Sie eine P200-Pipette fest, um 100 L Kollagen IV:Fibronectin-Lösung aufzunehmen.
    2. Führen Sie die Lösung durch den unteren Kanaleinlass ein, bis sich ein kleines Tröpfchen am Auslass bildet. Lassen Sie nach dem Entfernen der Pipettenspitze einen kleinen Tröpfchen auf dem Einlass.
    3. Führen Sie die Lamininlösung durch den oberen Kanaleinlass ein, bis sich ein kleiner Tröpfchen am Auslass bildet. Lassen Sie nach dem Entfernen der Pipettenspitze einen kleinen Tröpfchen auf dem Einlass.
    4. Schauen Sie sich die Kanäle genau an, um sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind. Wenn Blasen vorhanden sind, waschen Sie den Kanal mit der entsprechenden ECM-Lösung, bis alle Blasen entfernt sind.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 5.5.1–5.5.4 für jeden Chip.
    6. Fügen Sie 1,5 ml DPBS auf die Kappe eines 15 ml konischen Rohres. Legen Sie die DPBS-Kappe in die 150-mm-Kulturschale mit den Chips, um zusätzliche Feuchtigkeit zu bieten und versiegeln Sie die Schale mit Parafilm. Um beste Ergebnisse zu erzielen, inkubieren Sie die Chips bei 4 °C über Nacht.
      HINWEIS: Auf Wunsch können Zellen am selben Tag wie Diechip-Aktivierung und ECM-Beschichtung gesät werden, obwohl die Inkubation über Nacht bevorzugt wird. Chips können nach Zugabe des ECM und inkubierenden Chips bei 37 °C für die Aussaat von 4 h bereit sein.

6. Aussaat des "Gehirnseite"-Kanals und Differenzieren von EZ-Kugeln in gemischte neuronale Kulturen

  1. Bringen Sie das Gericht mit den vorbereiteten Chips zum BSC. Waschen Sie beide Kanäle vorsichtig mit 200 l NDM.
  2. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Anschlüssen, saugen Sie sorgfältig überschüssige Medientröpfchen von der Oberfläche des Chips. Sanft rühren Zellsuspension vor der Aussaat jeder Chip, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten
  3. Seeding der iNPCs in den oberen Kanal, um die "Gehirnseite" zu generieren
    1. Säen Sie die Zellen (1 x 106 Zellen/ml) in den oberen Kanal des Chips. Fügen Sie dem oberen Kanaleinlass eine P200-Spitze mit einer Suspension von 30–100 l Zellen hinzu und lassen Sie die Spitze vorsichtig von der Pipette los. Nehmen Sie eine leere P200 Pipette, drücken Sie den Kolben, setzen Sie in den oberen Kanal aus und ziehen Sie vorsichtig die einzelne Zellen Suspension durch den Chip.
    2. Bedecken Sie die Schale und übertragen Sie sie in das Mikroskop, um die Sädichte und homogene Verteilung der Zellen innerhalb des oberen Kanals zu überprüfen. Entfernen Sie die Pipettenspitze vorsichtig von den Spanein- und Auslassöffnungen.
    3. Die Saatdichte sollte als 20%ige Abdeckung erscheinen. Wenn die Saatdichte höher oder niedriger als erwartet oder ungleichmäßig ist, geben Sie die Chips an den BSC zurück, waschen Sie den Kanal 2x mit 200 l frischem Medium und wiederholen Sie Schritt 6.3.1.
    4. Nach Bestätigung der korrekten Zelldichte die Chips nach dem Aussaat jeder Chippartie sofort 2 h bei 37 °C in den Inkubator legen. Waschen Sie die Zellen weg, die nicht mit frischem NDM befestigen.
    5. Halten Sie Zellen unter statischen Bedingungen bei 37 °C mit einem täglichen NDM-Ersatz für mindestens 48 h vor Beginn des Durchflusses. iBMECs können nach dem Anhängen von iNPCs oder an einem darauffolgenden Tag nach dem iNPC-Seeding gesät werden.

7. IBMECs in den unteren Kanal säen, um die "Blutseite" zu erzeugen

  1. Bringen Sie das Gericht mit den vorbereiteten Chips zum BSC. Waschen Sie den unteren Kanal vorsichtig mit 200 L EC-Medium.
  2. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Anschlüssen, saugen Sie sorgfältig Tröpfchen von überschüssigem EC-Medium von der Oberfläche des Chips, um sicherzustellen, dass Medium in beiden Kanälen zu verlassen. Rühren Sie die Zellsuspension vor dem Aussaat jedes Chips sanft, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten.
  3. Mit einer P200-Pipette 30–100 l der iBMEC-Zellsuspension (14–20 x 106 Zellen/ml) aufstellen und die Spitze in den unteren Kanaleinlass legen. Trennen Sie die Spitze vorsichtig von der Pipette, sodass die zellhaltige Spitze im Einlassanschluss bleibt.
  4. Drücken Sie den Kolben auf einer P200 Pipette mit einer leeren Spitze, setzen Sie ihn in den unteren Kanalauslass ein und ziehen Sie vorsichtig die Einzelzellenaufhängung durch den unteren Kanal, indem Sie den Pipettenkolben langsam loslassen.
  5. Aspirieren Sie überschüssige Zellsuspension von der Oberfläche des Chips. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Ein- und Auslassanschlüssen, um sicherzustellen, dass keine Zellsuspension aus den Kanälen abgesaugt wird.
  6. Bedecken Sie den Chip und übertragen Sie ihn an das Mikroskop, um die Sädichte zu beobachten. Der untere Kanal sollte ohne beobachtbare Lücken zwischen den Zellen gefüllt werden, wenn er bei 4x oder 10x unter dem Mikroskop beobachtet wird (Abbildung 4).
  7. Wenn die Aussaatdichte unter 90 % Abdeckung liegt oder ungleichmäßig verteilt ist, passen Sie die Zelldichte entsprechend an und wiederholen Sie die Schritte 7.2–7.6, bis die richtige Dichte innerhalb des Kanals erreicht ist. Nach Bestätigung der korrekten Zelldichte (Abbildung 4), Samenzellen in den verbleibenden Chips. Um Zellen an die poröse Membran zu befestigen, die sich oben auf dem unteren Kanal befindet, invertieren Sie jeden Chip und ruhen Sie in einer Span-Wiege.
  8. Legen Sie ein kleines Reservoir (15 ml konische Rohrkappe mit sterilem DPBS) in die 150-mm-Schale, um Feuchtigkeit für die Zellen zu gewährleisten. Inkubieren Sie Chips bei 37 °C für ca. 3 h, oder bis Zellen im unteren Kanal befestigt sind. Sobald iBMECs angebracht wurden (3 h Nachsaat), kippen Sie die Chips wieder in eine aufrechte Position, um eine Zellbefestigung am unteren Teil des unteren Kanals zu ermöglichen.

8. Einleitung des Durchflusses

  1. Flow wird in der Regel 48 h Nachsaat von iBMECs initiiert. Diese Zeit ist erforderlich, damit die iBMECs fest am Chip befestigt werden können.
  2. Um den laminaren Fluss durch den Chip aufrechtzuerhalten, ist es wichtig, die Temperatur des Mediums zu entgasen und auszugrenzen. Medium muss in einem 37 °C-Wasserbad für 1 h vorgewärmt werden.
  3. Bis zu 50 ml erwärmtes Medium können durch Inkubation unter einem vakuumgetriebenen Filtersystem für 15 min entgast werden.
  4. Grundierung von tragbaren Modulen
    1. Reinigen Sie das Äußere der tragbaren Modulverpackungen und Trays mit 70% Ethanol, wischen und übertragen Sie es zum BSC. Öffnen Sie das Paket und legen Sie die Module in das Fach. Richten Sie sie mit den Reservoirs an der Rückseite des Tabletts aus.
    2. Pipette 3 ml vorausgeglichene, warme Medien zu jedem Einlassreservoir. Fügen Sie das EC-Kulturmedium zum Einlassreservoir des unteren Kanals und NDM zum oberen Kanaleinlassreservoir des oberen Kanals hinzu (Abbildung 5).
    3. Pipette 300 l vorausgeglichene, warme Medien zu jedem Auslassbehälter, direkt über jedem Auslassanschluss (Abbildung 5).
    4. Legen Sie bis zu sechs tragbare Module auf jedes Tablett. Tragen Sie Schalen zum Inkubator und gleiten Sie vollständig in das Kulturmodul mit dem tray griff nach außen gerichtet.
    5. Wählen Sie den Zyklus "Prime" aus und führen Sie ihn auf dem Kulturmodul aus. Schließen Sie die Inkubatortür und lassen Sie das Kulturmodul die tragbaren Module grundieren (dauert 1 min). Der Grundierungszyklus wird abgeschlossen, wenn die Statusleiste "Bereit" lautet. Entfernen Sie das Fach aus dem Kulturmodul, und bringen Sie es zum BSC.
    6. Stellen Sie sicher, dass die tragbaren Module erfolgreich grundiert wurden, indem Sie die Unterseite jedes tragbaren Moduls im BSC überprüfen. Achten Sie auf das Vorhandensein von kleinen Tröpfchen an allen vier Ports.
      1. Wenn ein tragbares Modul keine Tröpfchen anzeigt, führen Sie den Prime-Zyklus auf diesen Modulen erneut aus. Wenn Medien auf das Tablett tropften (dies kann häufiger durch die Auslassöffnungen auftreten), reinigen Sie das Fach mit 70 % Ethanol.
  5. Anschluss von Chips an tragbare Module, Regulierung und Einleitung des Durchflusses
    1. Waschen Sie vorsichtig beide Kanäle jedes Chips mit einem warmen, gleichförmigen zellspezifischen Kulturmedium, um mögliche Blasen im Kanal zu entfernen und kleine Tröpfchen von Medien (entsprechend den Medien im Kanal) auf die Oberseite jedes Ein- und Auslassanschlusses zu legen.
    2. Setzen Sie Chips mit Trägern in die tragbaren Module ein und legen Sie bis zu sechs auf jedes Tablett. Legen Sie Schalen in das Kulturmodul ein. Programmieren Sie die entsprechenden Organchipkulturbedingungen (Durchfluss rate und Stretch) auf dem Kulturmodul.
    3. Die programmierten Bedingungen beginnen, sobald der Zyklus "Regulierung" abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Die Durchflussraten für jeden Kanal können unabhängig voneinander gesteuert und auf Raten von 0–1.000 l/h eingestellt werden. Der BBB-Chip ist in der Regel mit 30 l/h kultiviert. Bei fließenden Medien wie EC-Medien oder ESM bei 30 l/h bzw. 1000 l/h betragen die Scherkräfte 0,01 Dyn/cm2 bzw. 0,33 dyn/cm2.
    4. Führen Sie den Zyklus "Regulieren", der etwa 2 h dauert, nach dem das Kulturmodul den Fluss bei den voreingestellten Organchip-Kulturbedingungen beginnt.

9. Blut-Hirn-Parazelluläre Permeabilitätsbewertung

  1. Bereiten Sie NDM ergänzt mit 10 g/mL dextran-FITC (4 kDa) vor. Diese Lösung wird als Eingabe für den Kanal "Blutseite" verwendet.
  2. Füllen Sie die unteren Kanalbehälter der tragbaren Module mit NDM, ergänzt durch dextran-FITC. Füllen Sie die oberen Kanalbehälter mit NDM ohne Tracer.
  3. Durchdringen Sie sowohl den oberen als auch den unteren Kanal mit einer Durchflussrate von 30 l/h für mindestens 4 h, bis sich genügend Medien ansammeln, um für die Beurteilung der Fluoreszenz in einem Plattenleser (typischerweise 100 l) gesammelt zu werden.
  4. Sammeln Sie Medienproben aus den Ein- und Ausgangsreservoirs des oberen und unteren Kanals. Schützen Sie die Proben vor Licht.
  5. Das NDM, ergänzt durch 10 g/ml dextran-FITC 1:1, mit NDM ohne Tracer, um eine 10–12-Punkt-Kalibrierungskurve zu erzeugen, wird seriell verdünnt.
  6. Nehmen Sie 100 l jeder Probe, einschließlich der Kalibrierkurve, in eine schwarze 96-Well-Platte und lesen Sie fluoreszenz mit einem Plattenleser (485 nm Anregung, 530 nm Emission).
  7. Verwenden Sie die Messwerte, umP-App-Werte wie folgt zu berechnen:

figure-protocol-1

  1. Nehmen Sie tägliche Messungen vor, um die Barriereeigenschaften zu bewerten und zu bestätigen, dass der BBB-Chip noch funktionsfähig ist.

10. Immunzytochemie

  1. Bringen Sie Chips zu einer chemischen Rauchhaube. Mit einer P200-Pipette können Sie Zellen fixieren, indem Sie beide Kanäle mit 200 l 4% Paraformaldehyd (PFA) in DPBS durchdringen und 10 min bei RT inkubieren.
  2. Nach der Fixierung, durchdringen Sie jeden Kanal mit 200 l DPBS und inkubieren für 5 min. Wiederholen Sie DPBS Waschen 2x.
  3. Blockieren und permeabilisieren Sie Zellen auf dem Chip durch perfusing primäre Blockierlösung (PBS, ergänzt mit 5% normalen Eselsserum und 0,1% Triton X-100). Bei RT für 1 h inkubieren.
  4. Primäre Antikörper in primärer Blockierlösung verdünnen und über Nacht bei 4 °C inkubieren. BMECs-Marker sind GLUT-1 (1:100 Verdünnung), ZO-1 (1:300), PECAM-1 (1:250; CD31) und VE-Cadherin (1:200). Neurale Marker sind III-Tubulin (1:1000; Tuj1, S100 (1:500), Nestin (1:1000) und GFAP (1:1000).
  5. Waschen Sie die Chips 3x mit kaltem DPBS.
  6. Sekundärantikörper in sekundärer Blocklösung verdünnen (DPBS mit 5% normalem Eselsserum ohne Triton-X).
  7. Durchdringen Sie die sekundäre Antikörperlösung über beide Kanäle. Typischerweise werden fluoreszierende sekundäre Antikörper 1:1000 verdünnt. Inkubieren Sie für 1 h bei RT vor Licht geschützt.
  8. Waschen Sie die Chips 3x mit DPBS.
  9. Stain Zellkerne durch durchperdien chip mit 100 l DAPI-Lösung. Inkubieren Bei RT für 5 min.
  10. Waschen Sie die Chips 3x mit DPBS.
  11. Der Chip ist bereit für die Bildgebung mit einem aufrechten oder einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. Die PDMS-Transparenz ermöglicht die Bildgebung im intakten Organchip. Vergrößerungen über dem 10-fachen können aufgrund der Dicke des Organchips lange Arbeitswegziele erfordern.

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Ergebnisse

Abbildung 6A,B,C stellt einen BBB-Chip dar, der mit EZ-Kugeln auf dem oberen Kanal "Gehirnseite" und iBMECs auf dem "Blutseite"-Bodenkanal gesät ist. iBMECs wurden zuerst gesät und durften über Nacht anbringen, danach wurden EZ-Kugeln gesät. Chips wurden dann unter statischen Bedingungen mit täglichem Medienaustausch für sieben Tage kultiviert. Der BBB-Chip wurde dann mit 4% PFA bei RT für 10 min fixiert und 3x mit DPBS gewaschen. Die Immunzytochemie wurde auf dem BBB-Chip m...

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Diskussion

Die Kombination von Organ-on-Chip-Technologie und iPSC-abgeleiteten Zellen in der NVU verspricht eine genaue Modellierung des menschlichen BBB. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die einfache und robuste Anwendung des kürzlich veröffentlichten iPSC-basierten BBB-Chips16. Eine Übersicht und das Timing des Seeding-Paradigmas sind in Abbildung 3dargestellt. Um Barrierefunktionen zu erhalten und zu erhalten, die für die BBB-Modellierung geeignet sind, ist die...

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Offenlegungen

Cedars-Sinai besitzt eine Minderheitsbeteiligung an Emulate, dem Unternehmen, das die mikrofluidischen Organchips der Studie herstellt. Ein Offizier von Cedars-Sinai ist ebenfalls Mitglied des Verwaltungsrats von Emulate. Emulate stellte keine finanzielle Unterstützung für diese Forschung zur Verfügung. Cedars-Sinai und Emulate haben Patente im Zusammenhang mit dieser Arbeit eingereicht.

Danksagungen

Wir danken Dr. Soshana Svendsen für die kritische Bearbeitung. Diese Arbeit wurde unterstützt von der Israel Science Foundation Stipendium 1621/18, das Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST), Israel 3-15647, das California Institute for Regenerative Medicine Grant ID DISC1-08800, die Sherman Family Foundation, NIH-NINDS Grant 1UG3NS105703, und The ALS Association Grant 18-SI-389. Die AH wurde von der Wallenberg Foundation (Fördernummer 2015.0178) gefördert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AccutaseEMD MilliporeSCR005Dissoziationslösung
B27Gibco12587010
BfgfPeprotech100-18B
Chip-S1Emulate IncChip-S1Organ-Chip
Kollagen IVSigmaC5533
DAPIInvitrogenD3571
Dextran-FITCSigma46944
DMEM: F12Thermo Fisher Scientific31330038
EselsserumSigmaD9663
Emulieren von Reagenz 1 (ER-1)Emulieren von IncER-1
Emulieren von Reagenz 2 (ER-2)Emulieren von IncER-2
FibronektinSigmaF1141
Gliazellen Fibrilläres saures Protein (GFAP)DakoZ0334
GLUT-1InvitrogenMA5-11315
GlutamaxLife Technologies35050038Glutamin-Ergänzung
hBDNFPeprotech450-02
KOSRThermo Fisher Scientific10828028
LamininSigmaL2020
MatrigelCorning354234Basalmembran-Matrix
mTeSR1StemCell Technologies, Inc.85851
NEAABiologische Industrie01-340-1B
NestinMilliporeMAB353
NutriStemBiologische Industrie05-100-1AAlternative Medien
PECAM-1Thermo Fisher Scientific10333
Rinderserum (PPP) aus plättchenarmem PlasmaBiomedicalTechnologiesJ64483AB
Retinsäure (RA)SigmaR2625
S100βAbcamab6602
Steriflip-GP sterile Zentrifugen-Filtereinheit mit RöhrchenaufsatzMilliporeSCGP00525
Triton X-100SigmaX100
ZO-1 monoklonaler AntikörperInvitrogen33-9100
β III-Tubulin (Tuj1α)SigmaT8660
β-MercaptoethanolLife Technologies31350010

Referenzen

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