Laserinduzierte Hirnverletzung im Motor Cortex von Ratten

Weltweit ist Schlaganfall die zweithäufigste Todesursache und die dritthäufigste Ursache für Behinderung¹. Schlaganfall führt auch zu schweren Behinderungen, die oft zusätzliche Betreuung durch medizinisches Personal und Angehörige erfordern. Es besteht daher die Notwendigkeit, die Mit der Störung verbundenen Komplikationen zu verstehen und das Potenzial für positivere Ergebnisse zu verbessern.

Die Verwendung von Tiermodellen ist der erste Schritt zum Verständnis von Krankheiten. Um die besten Forschungsergebnisse zu gewährleisten, würde ein typisches Modell eine einfache Technik, Erschwinglichkeit, hohe Reproduzierbarkeit und minimale Variabilität umfassen. Die Determinanten in ischämischen Schlaganfall-Modellen sind Dasasidemvolumen, Infarktgröße, das Ausmaß des Blut-Hirn-Barrieren-Abbaus (BBB) und funktionelle Beeinträchtigungen, die in der Regel über neurologische^{Schweregrad-Score 2}ausgewertet werden.

Die am weitesten verbreitete Schlaganfall-Induktionstechnik in Nagetiermodellen versperrt die mittlere Hirnschlagader (MCA) vorübergehend oder dauerhaft³. Diese Technik erzeugt ein Schlagmodell ähnlich dem beim Menschen: Es hat einen Penumbra, der den gestrichelten Bereich umgibt, ist hoch reproduzierbar und reguliert Ischämiedauer und Reperfusion⁴. Dennoch hat die MCAO-Methode einige Komplikationen. Die Technik ist anfällig für intrakranielle Blutungen und Verletzungen der ipsilateralen Netzhaut mit einer Dysfunktion des visuellen Kortex und häufige Hyperthermie, die oft zu zusätzlichen Ergebnissen führen^5,6,7. Weitere Einschränkungen sind hohe Variationen des induzierten Schlaganfalls (die sich aus der wahrscheinlichen Ausdehnung der Ischämie auf unbeabsichtigte Regionen, wie die äußere Halsschlagaderregion, eine unzureichende Okklusion des MCA und eine vorzeitige Reperfusion ergeben. Auch Ratten unterschiedlicher Sorten und Größen weisen verschiedene Infarktvolumina^{auf 8}. Zusätzlich zu allen genannten Nachteilen kann das MCAO-Modell keine kleinen isolierten Schlaganfälle in tiefen Hirnbereichen auslösen, da es technisch in Bezug auf seine Anforderung an die mindeste Gefäßgröße für die Katheterisierung begrenzt ist. Umso wichtiger ist die Notwendigkeit eines alternativen Modells. Eine andere Methode, die Photothrombose, bietet eine mögliche Alternative zu MCAO-Verfahren, verbessert aber nicht die Effizienz⁹. Diese Technik zielt auf Schlag mit Licht und bietet einige Verbesserungen gegenüber den vorherigen Modellen. Die Photothrombose erfordert jedoch eine invasive Kraniotomie, die mit sekundären Compications⁹verbunden ist.

Angesichts der umrissenen Mängel bietet das hier vorgestellte Protokoll eine leistungsfähige alternative Lasertechnik zur Induktion von Hirnverletzungen bei Nagetieren. Der Wirkmechanismus der Lasertechnik basiert auf den photothermischen Effekten des Lasers, die auf lebende Gewebe vermittelt werden, was zur Absorption von Lichtstrahlen durch Körpergewebe und deren Umwandlung in Wärme führt. Die Vorteile einer Lasertechnik sind ihre Sicherheit und einfache Manipulation. Die Fähigkeit eines Lasers, Wärme zu erzeugen, um Blutungen zu stoppen, macht ihn in der Medizin sehr wichtig, während seine Fähigkeit, verschiedene Strahlen an einem bestimmten Treffpunkt zu verstärken, sicherstellt, dass Laser die Zerstörung gesunder Gewebe vermeiden, die dem Zielpunkt¹⁰im Weg stehen. Der in diesem Protokoll verwendete Laserstrahl kann ein flüssigkeitsarmes Medium, wie z. B. Knochen, passieren, ohne seine Energie zu emittieren und/oder Zerstörungen zu verursachen. Sobald es ein hohes flüssiges Medium erreicht, wie Gehirngewebe, es verbraucht seine Energie, um das Zielgewebe zu zerstören. Die Technik kann daher nur im entsprechenden Bereich des Gehirns Hirnverletzungen auslösen.

Die hier vorgestellte Technik zeigte eine enorme Fähigkeit, ihre Bestrahlungsniveaus zu regulieren, was die gewählten Variationen von Hirnverletzungen produzierte, die von Anfang an beabsichtigt waren. Im Gegensatz zum ursprünglichen MCAO, das sowohl den Kortex als auch das Striatum beeinflusst, war die Lasertechnik in der Lage, die Auswirkungen von Hirnverletzungen zu regulieren, was verletzungende nur auf den beabsichtigten motorischen Kortex ausführte. Hierin werden das laserinduzierte Hirnverletzungsprotokoll und eine Zusammenfassung der repräsentativen Ergebnisse für das Verfahren an der Großhirnrinde von Ratten bereitgestellt.

Das folgende Verfahren wurde gemäß den Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Die Experimente wurden auch vom Animal Care Committee an der Ben-Gurion Universität des Negev genehmigt.

1. Tierauswahl und -zubereitung

1. Wählen Sie 65 männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 300 bis 350 g ohne unüberteinige Pathologie für dieses Verfahren. Die geringere Größe stellt technische Schwierigkeiten für das MCAO-Verfahren dar.
2. Weisen Sie 3 Ratten pro Käfig zu und lassen Sie sie sich für mindestens 3 Tage anpassen.

2. MCAO-Verfahren

1. Wählen Sie 25 Ratten für MCAO aus, was eine Sterblichkeit von 10 bis 20 % im Zusammenhang mit dem Verfahren¹¹ermöglicht.
2. Führen Sie MCAO mit einer Standardtechnik aus, wie zuvor im Detail^{beschrieben 12}.

3. Laser-induzierte Hirnverletzung experimentelleverfahren

1. Weisen Sie 20 Ratten einer als Lasergruppe markierten Gruppe und 20 Ratten einer anderen Kontrollgruppe zu (scheinbetrieben).
2. Unterziehen Sie die Lasergruppenratten einer Laserbestrahlung um 50J X 10 Punkte in folgender Weise:
   1. Anästhesisieren Sie Dieratmit mit einer Mischung von 2% Isofluran in Sauerstoff, was eine spontane Beatmung ermöglicht. Prüfen Sie die ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie den Schwanz mit Zangen kneifen, um das Fehlen des Rückzugsreflexes zu erkennen.
   2. Halten Sie die Körperkerntemperatur der Ratte während des gesamten Versuchs mit einem rektaltemperaturgeregelten Heizkissen bei 37 °C.
   3. Entfernen Sie lokales Haar mit einem Rasierer und desinfizieren Sie mit 70% Alkohol und 0,5% Chlorhexidingluconat. Wiederholen Sie den Desinfektionsschritt noch zwei Mal.
      HINWEIS: Die Größe des chirurgischen Schnitts sollte ca. 3 cm betragen. Entfernen Sie das Haar mindestens 2 cm um den Schnittbereich.
   4. Legen Sie die Ratte auf einen stereotaxic Kopfhalter in einer anfälligen Position und machen Sie einen 3 cm Schnitt, um die Kopfhaut seitlich zu reflektieren und den Bereich zwischen Bregma und Lambda freizulegen.
   5. Halten Sie die Anästhesie durch den Nasenkegel aufrecht.
   6. Verwenden Sie Neodymium-YAG (Nd-YAG) Laser (Spitzenwellenlänge 1064 nm), um 50J X 10 Punktemit 1 s Pulsdauer auf den exponierten Bereich des Schädels über der rechten Hemisphäre zu verabreichen.
   7. Stellen Sie sicher, dass sich der lasererzeugende Teil des Geräts in einem Abstand von 2 mm vom exponierten Bereich befindet, um einen Laserstrahl zu erzeugen. 50J X 10 Punkte wurden nach sorgfältiger Bewertung verschiedener Energie-Oberflächen-Kombinationen ausgewählt. Diese Kombination ist effizient und verursacht keine Knochenzerstörung des Schädels nach der Verabreichung für weniger als eine Sekunde¹⁰.
      HINWEIS: 2 mm ist der Abstand zwischen der Klemme des Laserstrahls (vom optischen Kabel, durch das er geleitet wird) und dem Schädelknochen. Wenn eine Fokussierlinse verwendet wird, sollte der Abstand unter Berücksichtigung des Neigungswinkels der Linse berechnet werden, um den Strahl im gewünschten Schadensbereich zu fokussieren. Sorgen Sie für die richtige Sicherheit bei der Verwendung eines Lasergeräts, einschließlich entsprechender Schulung und Augenschutz.
   8. Entfernen Sie die Ratte aus dem Gerät und schließen Sie die Kopfhaut mit 3-0 Seide chirurgische Nähte.
   9. Beenden Sie die Anästhesie und bringen Sie die Ratte zur Genesung in ihren Käfig zurück. 0,1 ml 0,25% Bupivacain lokal verabreichen, um die postoperativen Schmerzen unmittelbar nach der Operation zu reduzieren.
      HINWEIS: Die gesamte Prozedur sollte weniger als 5 min dauern, wenn sie korrekt ausgeführt wird.
3. Beobachten Sie die Ratte auf Anzeichen von Not während der Erholung nach der Anästhesie. Vor der Entstehung aus der Anästhesie, geben 0,01mg/kg intramuskuläres Buprenorphin für postoperative Analgesie und weiter mit wiederholten Dosen alle 12 h für mindestens 48 h.
4. Untersien Sie Kontrollratten den gleichen Bedingungen, ohne sie dem Laser zu unterwerfen.

4. Neurologischer Schweregrad (NSS)

1. Bewerten Sie den neurologischen Schweregrad 24 h nach der laserinduzierten Hirnverletzung mit einem 43-Punkte-Score¹³. Testen Sie die Tiere auf neurologische Defizite, Verhaltensstörungen, Strahlausgleichsaufgaben und Reflexe und weisen Sie höhere Werte für schwerere Behinderungen zu, wie zuvor beschrieben¹³.

5. Manipulationen nach der Verletzung

1. Nach der NSS-Evaluierung die Ratten einschläfern, indem sie 20 % Sauerstoff und 80 % CO2 (über Inspiration) aussetzen und die Ratte transkardial mit heparinisierter phosphatgepufferter Saline (PBS, 0,9% NaCl) durchdringen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass CO₂ gemäß den Richtlinien des Institutionellen Tierschutz- und Nutzungsausschusses zu einem vorgegebenen Preis geliefert wird. Dieser Schritt kann auch unter 5% Isoflurananästhesie durchgeführt werden.
2. Gehirne ernten und sich auf weitere Untersuchungen vorbereiten, wie in einem früheren Protokoll¹¹beschrieben.
3. Bewerten Sie für subarachnoide Blutungen (SAH) durch visuelle Untersuchung des gesamten Gehirns nach seiner Isolierung vom Schädel. Gegebenenfalls kann zu diesem Zweck ein Mikroskop oder eine Lupe verwendet werden.

6. Bewertung der Hirnverletzung

1. Bestimmung des Hirninfarktvolumens und des Hirnödems durch TTC-Färbung
   HINWEIS: 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung ist ein bequemes Verfahren für Hirninfarkt-Erkennung¹¹.
   1. Schneiden Sie die geernteten Gehirne in 6 koronale Scheiben, jeweils 2 mm Dicke.
   2. Inkubieren Sie den Satz von Scheiben aus jedem Gehirn für 30 min bei 37 °C in 0.05% TTC.
   3. Scannen Sie die Scheiben nach der Färbung mit einem optischen Scanner mit einer Auflösung von 1600 X 1600 dpi.
   4. Die ungefärbten Bereiche der festen Hirnscheiben werden als infarkt¹²definiert.
   5. Mit Hilfe einer Bildverarbeitungssoftware (z.B. Freeware Image J) messen Sie für jede der 6 koronalen Scheiben den ungefärbten Infarktbereich, ipsi- und kontralaterale Hemisphären.
   6. Berechnen Sie das Infarktvolumen als Prozentsatz des gesamten Gehirns:
      
   7. Berechnen Sie Hirnödem eimt mit Kaplan-Methode:
      
2. Bestimmung des Ausmaßes des Bruchs der Blut-Hirn-Schranke (BBB)
   HINWEIS: Bewerten Sie BBB Bruch 24 h nach der laserinduzierten Hirnverletzung wie folgt:
   1. 2% Evans Blue mit 4 ml/kg Salinelösung intravenös an Ratten über die konnulate Schwanzvene verabreichen und die Lösung 1 h zirkulieren lassen.
   2. Euthanisieren Sie Ratten, indem Sie sie 20% Sauerstoff und 80%_CO2 (über Inspiration) 24 h nach dem letzten NSS aussetzen, wie zuvor beschrieben¹³.
   3. Den intravaskulär lokalisierten Farbstoff wie folgt ernten:
      1. Öffnen Sie die Brust der Ratten mit chirurgischen Pinzetten und chirurgischen Scheren.
      2. Durchnässen Sie die Tiere mit gekühlter 0,9% Saline über die linke Herzkammer mit 110 mmHg, bis sie eine farblose Perfusionsflüssigkeit aus dem rechten Vorhof erhalten.
   4. Die Gehirne ernten und rostrocaudal in 2 mm Scheiben schneiden.
   5. Trennen Sie die linken Gehirnscheiben von den rechten Abschnitten, um verletzte und nicht verletzte Hemisphären getrennt zu bewerten.
   6. Wiegen, homogenisieren mit Mörtel und Stößel, und dann inkubieren sie das Gehirngewebe in 50% Trichloressigsäure für 24 h.
   7. Zentrifugieren Sie die homogenisierten Gehirnscheiben bei 10.000 g für 20 min.
   8. Mischen Sie 1 ml des Überstandes aus dem zentrifugierten Gehirn mit 1,5 ml 96% Ethanol bei 1:3 und bewerten Sie den Bruch der Blut-Hirn-Schranke mit einem Fluoreszenzdetektor bei 620 nm Anregungswellenlänge (10 nm Bandbreite) und 680 nm Emissionswellenlänge (10 nm Bandbreite).
      HINWEIS: Beide Rattengruppen durchlaufen dasselbe Protokoll zur Bestimmung des BBB-Zusammenbruchs.

Weder in den Kontroll- noch in den Versuchsgruppen wurden Todesfälle oder SAH registriert (Tabelle 1). Die MCAO-Gruppe hatte eine Sterblichkeitsrate von 20 % und sah.

Die relativen Veränderungen der Körpertemperatur bei den Ratten beider Gruppen waren ebenfalls ähnlich, trotz eines Unterschieds in der Variabilität beider Gruppen (Tabelle 1).

Sowohl bei den Lasermodellen (16 x 1,1) als auch bei MCAO (20 x 1,5) gab es eine deutlich schlechtere NSS-Regelung im Vergleich zur scheinbetriebenen Kontrollgruppe (1 x 0,3; Tabelle 1; p<0.01).

Die laserinduzierte Hirnverletzung verursachte auch eine signifikante Zunahme des Infarktvolumens auf der Zielhalbkugel im Vergleich zur scheinbetriebenen Kontrollgruppe (2,4 % bei 0,3 vs. 0,5 % bei 0,1; Tabelle 2 und Abbildung 1A; p<0.01), nach dem Mann-Whitney U-Test. Das Infarktvolumen des Lasermodells war jedoch im Vergleich zur MCAO-Technik geringer (2,4 % bei 0,3 vs. 9,9 % bei 2,9).

Hirnödem bestimmt 24 h nach Hirnverletzungen sind in Abbildung 1B und Tabelle 2dargestellt. Es gab keinen Unterschied bei Hirnödemen zwischen dem laserinduzierten Hirnverletzungsmodell und der scheinbetriebenen Kontrollgruppe (3,4 % bei 0,6 vs. 0,7 % bei 1,2). Es gab einen signifikanten Unterschied bei den Hirnödemen zwischen dem Lasermodell und der MCAO-Technik (3,4 x 0,6 vs. 7 x 2,6 %). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt.

Im Vergleich zur scheinbetriebenen Kontrollgruppe verursachten die laserinduzierte Hirnverletzung und die MCAO-Technik einen signifikanten Anstieg des BBB-Bruchs auf der nicht verletzten Hemisphäre (563 ng/g bei 66 bzw. 1176 ng/g bei 168 bzw. 141 ng/g bei 14; Abbildung 2A und Tabelle 2; p<0.01) und Zielhalbkugel (2204 ng/g bei 280 bzw. 2764 ng/g bei 256 bzw. 134 ng/g bei 11; Abbildung 2B und Tabelle 2; p<0.01).

Die histologische Untersuchung des Gehirns von Ratten ist in Abbildung 3dargestellt.

Tabelle 1: Bewertung von NSS, Körpertemperatur, subarachnoider Blutung und Sterblichkeit. * = p < 0,01

Tabelle 2: Bewertung der BBB-Aufschlüsselung, der Infarktzone und des Hirnödems. * = p < 0,01

Abbildung 1: Beurteilung der Hirnverletzung im Lasermodell 24 h nach der Verletzung im Vergleich zum MCAO-Modell und der scheinbetriebenen Steuerung. (A) Beurteilung des Infarktvolumens. Im Vergleich zur scheinbetriebenen Steuerung (*p<0.01) stieg das Infarktvolumen im Lasermodell an. Das Infarktvolumen im Lasermodell war jedoch im Vergleich zum MCAO-Modell (*p<0.01) geringer. (B) Bewertung des gesamten Hirnödems. Im MCAO-Modell gab es eine Zunahme der Hirnödeme im Vergleich zum Lasermodell oder der scheinbetriebenen Steuerung. Es gab keinen Unterschied bei Hirnödemen zwischen dem Lasermodell und der scheingesteuerten Steuerung. Die Daten werden in % der kontralateralen Hemisphäre gemessen und als Mittelwert SEM ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Ausmaß der BBB-Aufschlüsselung im Vergleich zu Scheinkontrollen. (A) Kontralaterale (nicht verletzte) Hemisphäre. Sowohl die Laser- als auch die MCAO-Modelle führten zu einer signifikanten Zunahme des BBB-Bruchs auf der nicht verletzten Hemisphäre im Vergleich zur scheinbetriebenen Kontrollgruppe (*p<0.01). (B) Ipsilaterale (verletzte) Hemisphäre. Es gab einen Unterschied in der ipsilateralen BBB-Aufschlüsselung bei den Laser- und MCAO-Modellen im Vergleich zur scheinbetriebenen Steuerung (*p<0.01). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Histologische Untersuchung der Gehirne von Ratten aus Schein-, Laser- und MCAO-Gruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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