Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Live-Zell-Bildgebung des kortikalen Mikrotubule-Zytoskeletts am triebförmigen Meristem und die Überwachung seiner Reaktion auf Veränderungen der physikalischen Kräfte.
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Methodenartikel
Live Cell Imaging von Microtubule Cytoskeleton und mikromechanische Manipulation der Arabidopsis Schießen apical Meristem
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Verständnis der Regulierung von Wachstum und Morphogenese auf Zell- und Gewebeebene steht seit vielen Jahrzehnten an vorderster Front der biologischen Forschung. Fortschritte in molekularen und bildgebenden Technologien ermöglichten es uns, Einblicke zu gewinnen, wie biochemische Signale morphogenetische Ereignisse beeinflussen. Es wird jedoch immer deutlicher, dass neben biochemischen Signalen auch mechanische Hinweise mehrere Aspekte des Zell- und Gewebewachstums beeinflussen. Der Arabidopsis-Schieß-Apischer Meristem (SAM) ist eine kuppelförmige Struktur, die für die Erzeugung aller oberirdischen Organe verantwortlich ist. Die Organisation des kortikalen Mikrotubuli-Zytoskeletts, das apoplastische Zelluloseablagerungen in Pflanzenzellen vermittelt, ist räumlich unterschiedlich. Die Visualisierung und quantitative Bewertung von Mustern kortikaler Mikrotubuli ist notwendig, um die biophysikalische Natur von Zellen am SAM zu verstehen, da Zellulose die steifste Komponente der Pflanzenzellwand ist. Die stereotype Form der kortikalen Mikrotubuli-Organisation ist auch eine Folge der gewebeweiten physikalischen Kräfte, die am SAM vorhanden sind. Die Störung dieser physikalischen Kräfte und die anschließende Überwachung der kortikalen Mikrotubuli-Organisation ermöglicht die Identifizierung von Kandidatenproteinen, die an der Vermittlung von Mechano-Wahrnehmung und Transduktion beteiligt sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das hilft, solche Prozesse zu untersuchen.
Einleitung
Pflanzenzellen sind von einer extrazellulären Matrix aus Polysacchariden und Glykoproteinen umgeben, die mechanisch einem faserverstärkten Verbundwerkstoff ähnelt, der seine mechanischen Eigenschaften dynamisch verändern kann1. Das Wachstum der Pflanzenzellen wird durch die Aufnahme von Wasser in die Zelle angetrieben, was zu einer gleichzeitigen Ansammlung von Zugkräften an der Zellwand führt. Als Reaktion auf solche Kräfte ermöglichen Modifikationen des physikalischen Zustands der Zellwand eine Zellexpansion. Zellen mit Primärwänden sind in der Lage, im Vergleich zu sekundären Zellwand enthaltenden Zellen ein schnelles Wachstum zu verzeichnen....
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Protokoll
1. Pflanzenwachstum
- Säen Arabidopsis Samen, die Mikrotubuli-Bindungsdomäne mit grünem fluoreszierendem Protein (MBD-GFP)10 auf dem Boden verschmelzen und in langen Tagen (16 h Tag /8 h Nacht), 20 °C/6 °C Bedingungen für 1 Woche für die Keimung halten.
- Nach der Keimung Sämlinge in neue Töpfe mit ausreichend Wachstumsraum übertragen, um ein robustes vegetatives Wachstum zu ermöglichen. Halten Sie die Pflanzen in kurzen Tagen (8 h Tag /16 h Nacht), 20 °C / 16 °C Bedingungen für 3-5 Wochen.
- Pflanzen auf langen Tag (16 h Tag /8 h Nacht), 20 °C/16 °C Bedingungen übertragen und bis zum Pflanzenbolzen (2-3 Wochen)....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt typische Projektionsbilder aus MBD-GFP-Linien mit Zellen in der Mitte der Kuppel, die unorganisierte kortikale Mikrotubuli enthalten, und Zellen an der Peripherie mit einer Umfangsverteilung (Abbildung 1A,B), während die Grenzbereichszellen kortikale Mikrotubuli enthalten, die parallel zur langen Achse der Zelle ausgerichtet sind. Diese Beobachtungen zeigen Unterschiede in der räumlichen Verteil.......
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Diskussion
Die Bewertung mechanischer Signaltransduktionsereignisse ist entscheidend, um molekulare Regulatoren zu identifizieren, die an den Mechano-Wahrnehmungs- und Transduktionswegen beteiligt sind. Das hier beschriebene Protokoll bietet eine quantitative Ansicht solcher Ereignisse, indem die kortikale Mikrotubuli-Antwort als Auslesung für einen solchen Prozess in Arabidopsis-SAMs verwendet wird. Das hier beschriebene Verfahren wird routinemäßig in mehreren Studien an verschiedenen Gewebetypen16.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| FibrilTool | Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014 | ||
| FIJI | Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012 | ||
| glycine | Merck | 1.04201.1000 | |
| Leica SP8 Konfokalmikroskop | Leica | DM6000 CS | |
| MAP4-GFP | Marc, J. et al., Plant Cell 1998 | ||
| Mikroporenband | Leukopor | 02482-00 | |
| MorphographX | Strauss, S. et al., Methoden Mol Biol. 2019 | ||
| Myo-Inositol | Sigma | I5125 | |
| N6-Benzyladenin | Sigma | B3408 | |
| Nikotinsäure | Sigma | N4126 | |
| Kunststoff-Klappkasten | Elektronenmikroskopie | 64312 | |
| PPM (Pflanzenkonservierungsmittelmischung) | Pflanzenzelltechnologie | PPM | |
| Propidiumiodid | Sigma | P4864 | |
| Pyridoxinhydrochlorid | Sigma | P9755 | |
| SURFCUT | Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019 | ||
| Thiaminhydrochlorid | Sigma | T4625 |
Referenzen
- Cosgrove, D. J. Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly. Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).
- McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. The cell biology of cellulose synthesis. Annual Reviews in Plant Biology....
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Nachdrucke und Genehmigungen
