Summary
レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。
Abstract
神経膠腫は、その侵襲性および不均一性を特徴とする原発性脳腫瘍である。例えば、偽官麻痺、微小血管増殖、間葉形転換および壊死などの特定の組織学的パターンは、高級神経膠腫の組織学的不均一性を特徴付ける。我々の研究室は、オンコストリームと名付けられた間葉細胞の高密度の存在が腫瘍悪性腫瘍と相関することを実証した。私たちは、グリオーマの成長と侵略の根本となるメカニズムを理解するためのユニークなアプローチを開発しました。ここでは、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)およびRNAシーケンシングを利用して、腫瘍内の異種多細胞構造(すなわち、間葉領域または腫瘍浸潤領域)の微分mRNA発現を解析する包括的なプロトコルについて説明する。この方法は、良好な組織組織組織学およびRNA完全性を維持する。灌流、凍結、埋め込み、切り離し、染色は、形態を保存し、高品質のレーザーマイクロ解剖サンプルを得るために最適化されました。結果は、30%スクロースを使用するグリオーマを担うマウスの灌流が良好な形態およびRNAの質を提供することを示している。さらに、4%クレシルバイオレットと0.5%のエオシンで腫瘍切片を染色すると、RNAの完全性を維持しながら、良好な核染色および細胞染色が行われます。記載された方法は、感受性と高度に再現性が高く、様々な腫瘍モデルにおける腫瘍形態学を研究するために利用することができる。要約すると、固体腫瘍内の異種多細胞構造の分子的特徴を研究するために、シーケンシングのための形態およびRNAの質を維持するLMDを行う完全な方法を説明する。
Introduction
神経膠腫は中枢神経系の最も積極的な原発腫瘍である。彼らは非常に侵襲的で異質な1です。腫瘍の細胞および分子成分の分析は、新たな治療標的を明らかにする。
現在利用可能なさまざまな方法の中で、凍結脳腫瘍組織のレーザー捕捉マイクロ解剖(LMD)は、腫瘍組織からの離散解剖学的領域または特異的細胞集団の単離を可能にする費用対効果の高い、信頼性の高い技術であり、その分子プロファイル22,33を研究する。LMDは、選択した単一細胞または多細胞構造のmRNA遺伝子発現プロファイルの解析を可能にする4,5。54LMDは、腫瘍進行中に起こる分子事象に関する深い機械的な知識を得るために利用することができる。腫瘍組織の処理の改善は、組織形態およびRNA品質6の最適な光学分解能を得るために必要である。パラホルムアルデヒド固定は形態学的解析に最適な選択肢ですが、これらの条件下でRNAの品質が影響を受けて分解されるため、RNA-seq解析のRNA品質が低下します。凍結組織切片の使用は、細胞膜を破壊し、細胞内に穴を生成する可能性のある氷の結晶形成を回避し、RNA-Seq分析7のための最良の選択肢であり続ける。
ここでは、LMD用の凍結マウス脳腫瘍組織を処理するための最適化されたセクション固定および染色方法について述べている。氷の結晶が組織に形成されるのを防ぐために、我々は30%スクロースの溶液をマウスに浸透させた。この溶液は、極性水分子間の相互作用を破壊し、氷の結晶の形成を防ぎ、組織形態を維持します。組織染色は、腫瘍内の細胞または解剖学的に異なる領域の特定の集団を分化し、得るために必要である。RNAの完全性を維持するために、無害な染料で組織を固定し、染色することが不可欠です。以前に示されているヘマトキシリン/エオシン(H&E)を用いた組織の染色は、RNAの完全性を低下させる 8.エタノール、クレシルバイオレット4%、エオシンY 0.5%溶液で目的の組織を固定し、染色しました。クレシルバイオレットは、細胞核を濃い青色で染色する酸性の色素です。エオシンYは、細胞の基本的な成分を染色する好塩基性染料であり、細胞質と他の細胞構造8との区別を提供する。どちらの色素もエタノールに溶け、RNAの品質を低下させない。組織の損傷を避け、細胞構造の高い光学解像度を維持するために、我々はLMD9の前に組織切片を取り付けた。
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Protocol
実験動物を使用するここで説明するすべての方法は、ミシガン大学の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注:GEMMまたは安定したラインから発生する神経球は、マウス10における頭蓋内腫瘍生着に使用し、LMDおよびRNAシーケンシングのために処理することができる。これらの細胞はホタルルシメラーゼとGFPタンパク質を構成的に発現し、腫瘍増殖解析および局在化にさらなる利用が見込まれる。
遺伝子組み換えグリオーマモデル由来の神経球から頭蓋内マウスグリオーマモデルの生成
- 遺伝子操作マウス(GEMM)モデルから神経球細胞の一次培養を生成するには、前述のプロトコル10,11,11を用いる。
- 記載されているように神経圏培地を調製する:ダルベックコの修飾イーグル培地F-12(DMEM/F12)の500mLは、50x B-27の10mLおよび100x N-2ニューロン培養サプリメントの5mL、100x抗生物質抗ミキサイトの5 mL、ノルモシンの1mLを補った。神経球をめっきする前に、20 ng/mLヒト組換えEGFおよびFGFを培地に添加する。
- 37°Cで組織培養インキュベーター中の神経球を培養し、頭蓋内腫瘍の生着前に2〜3日間のCO2を5%とした。
- 手術当日、神経圏の神経膠腫を採取し、550xgで室温x gで5分間回転させます。細胞ペレットを邪魔することなく上清を慎重に除去する。
- 神経球を解離するには、細胞ペレットを1mLの細胞剥離液で再懸濁し、37°Cで5%CO2で2〜4分間インキュ2ベートする。インキュベーション期間後、1 mLマイクロピペットで上下の神経球をピペットし、単一の細胞懸濁液を確保する。
- 非補充DMEM/F12培地の10 mLで神経球懸濁液を希釈することにより、細胞剥離液を不活性化する。550 x gで、室温で 5 分間回転させます。上清を慎重に取り除きます。
- セルペレットを、サプリメントなしでDMEM/F12培地の100 μLに再懸濁します。細胞懸濁液を1:50希釈し、50 μLのトリパンブルーを加え、生存細胞を数えます。セルの濃度を決定するには、次の式を使用します。
セル/mL = [((平方あたり数えられる)/数が数えられる四角形の数] x 50 x 10,000 セル/mL] - 細胞数を決定した後、100 μL体積で30,000細胞/μLの目標濃度を達成し、神経球をスピンダウンし、サプリメントを含み DMEM/F12の適切な体積で再中断します。
- あらかじめラベル付けされた0.6 mLチューブに神経球を氷の上に置きます。
- 移植前に麻酔、鎮痛薬、麻酔逆転の作業溶液を準備する:ケタミン/デクスメデトミジン麻酔のために、100 mg/mLケタミン塩酸塩の0.6 mLと0.5mg/mLデックスメデトミジン塩酸塩を0.6mLを加えるブプレノルフィン鎮痛薬の場合は、バイアルを含む0.9%NaClの9 mLに0.3 mg/mLブプレノルフィンの1 mLを加えます。アティパメゾール麻酔逆転の場合は、バイアルを含む0.9%NaClの9 mLに5mg/mLアティパメゾールの1 mLを加える。
- 頭蓋内腫瘍の生着のために6-8週齢のC57BL/6J雌マウスを使用する。
- げっ歯類の生存手術のために承認された部屋で、頭蓋内腫瘍の生着のための無菌供給を設定する。取り外し可能な33G針と殺菌された10 μLハミルトンの注射器が装備されているげっ歯類の立体質フレームの手術を行う。ビーズの殺菌器を利用して、手術の間に工具を殺菌する。
- ステップ1.11で調製した麻酔液の単一の腹腔内注射(すなわち.p.)でマウスを麻酔する(ケタミン:75.0 mg/kgおよびデクスメデトミジン:0.5mg/kg)。約250μLの麻酔液がマウスの重さ20gに送られます。
- マウスが深く麻酔状態になったら、滅菌ガソリンを眼に塗布して乾燥を防ぎます。マウスの頭蓋骨に毛皮を剃ります。殺菌するために10%ポビドネ-ヨウ素局所溶液を剃り領域に塗布する。
- マウスの頭蓋骨を定位フレームに固定します。まず、口を鉗子で慎重に開き、舌をそっと引っ張り、口の片側に動かして窒息を防ぎます。鉗子で口を開いたままにして、立体性フレームの歯棒の鍵穴に上部切歯を置きます。
- マウスヘッドを耳にかざし、眼窩後の骨に耳棒を置き、固定します。マウスの頭蓋骨が外科用卓上と同じレベルであることを確認します。耳の棒は慎重に頭蓋骨に圧力をかけないで固定します。次に、慎重にノーズバーを固定します。
- サイズ15メスの刃を使用して、マウスヘッドに沿って切開を行い、頭蓋骨を露出させる。コリリリトラクターを使用して切開部位の皮膚を引き込む。滅菌アプリケーターを使用して、すべての腹蓋組織を除去します。
- ブレグマを特定し、その上に直接ハミルトン注射器の針を下げます。フレームを使用して、針をブレグマの1mm前に、1.5mm側面に置きます。26G針を使用して、頭蓋骨を採点してこのスポットをマークします。
- 0.45 mm ドリル ビットを装備したコードレスパワードリルを使用して、ターゲットサイトにバリ穴を作成します。基礎となる硬膜に到達するまでドリル。26G針でバリ穴の残りの骨を慎重に抽出します。
- ピペットを使用して、細胞を十分に均質化し、7 μLの神経球懸濁液をシリンジに引き出します。シリンジが正常に動作していることを確認するには、70%アルコール浸しパッドに懸濁液の1 μLを分配します。
- 針を硬膜の表面まで下げます。シリンジを3.5mmの腹側に下げ、0.5mm引き込む。これは、注入時に神経球が沈着するために脳内に0.5ミリメートルの空間を作成します。
- 圧力平衡のために針を2分間所定の位置に置いておきます。ゆっくりとスムーズに1分間に1μLの細胞を送り出し、細胞が6分間落ち着くことを可能にします。
- 滅菌生理液を使用して、頭蓋骨の表面を3回洗浄する。70%アルコールパッドに注射器の余分な細胞を分配し、別の70%のアルコールパッドで針をきれいに拭きます。注射器を滅菌PBSでリンスし、針の詰まりを避けます。
- リトラクタを取り外し、慎重にステレオチックフレームからマウスを取り出します。3-0ナイロン縫合糸、鉗子、およびニードルドライバを使用して切開を閉じます。
- 20gマウスに対して約100μLのアティパメゾール(1.0mg/kg)を投与する。ブプレノルフィン(0.1mg/kg皮下)を皮下に投与し、20gマウスで約70μLを投与する。術後マウスを清潔な回復ケージに入れ、警告とアクティブになるまで監視します。
2. 動物の灌流と脳の保存
- 腫瘍の進行を監視するために、動物が腫瘍の負担の徴候を示すまで生体内イメージングシステムを使用して生体発光を決定する。マウスは10 6~107光6子/sの間の信号に達すると安楽死させる。
- ケタミン(75.0mg/kg)およびデクスメデトミジン(0.5mg/kg)溶液の腹腔内注射(i.p.)で腫瘍負担の徴候を示すマウスを麻酔する。約250μLを20gのマウスに送ります。その後、ペダル反射に反応しないマウスであることを確認します。
- 鉗子を使用して、腹腔の上の皮膚を保持し、解剖はさみの大きなペアを使用して、腹膜壁を貫通することによって「Y」切開を行い、横隔膜を穿刺し、リブケージを切断する。
- 鈍い20Gカニューレをマウスの心臓の左心室に挿入します。その後、心臓の右心房を切り取り、排泄を可能にする。
- 酸素化タイロードの溶液(0.8%NaCl、0.0264%CaCl 2、0.005%NaH2PO4、0.1%グルコース、0.1%NaHCO3、0.02%KCl)が、肝臓と肺が除去(5分)のために完全にクリアされるまでマウス循環系を流れるようにします。2
- さらに15分間タイロードの溶液に溶解した30%スクロース溶液を動物に浸透させ続けます。灌流の成功を評価するために、首、尾および脚が硬いポスト30%スクロース循環であることを確認する。
- 解剖はさみの小さなペアを使用して、正中線で頭皮をカットします。後頭部骨から始まり、スナに向かって前進する。これは、頭蓋骨を露出します。
- 一対の回転器を使用して、後頭部の骨から始まる頭蓋骨を突破し、脳の表面を完全に露出させるために前方に進み続ける。その後、頭の側を上に回し、頭蓋骨からそれを解放するために脳の基部の神経を解剖します。
- RNaseフリー水で30%スクロース溶液を調製し、40 μmのナイロンメッシュフィルターでフィルター処理してRNAの分解を低減します。
- スクロース溶液の浸潤を最大化するには、解剖した脳を30%スクロース溶液に入れ、一晩4°Cで保存します。さらに処理する前に、脳がスクロース溶液を含むチューブの底に達することを確認します。
3. 神経膠腫腫瘍を抱える脳の凍結保存
- 脳を凍結保存する前に、冷たいイソペンタン/2-メチルブタンで満たされた瓶を準備し、液体窒素で満たされた容器に瓶を入れます。溶剤を冷まします。
- 30%スクロース溶液から脳を取り除き、濾紙で乾燥させます。
- クリオムオールに永久的なマーカーを付けます。気泡を避けて、約5mLのOCT(最適な切削温度化合物)をクライオムオールの中央に加えます。
- 所望の向きでOCTを含むクリオマールに脳を置きます.脳が完全に水没するまで、OCTで金型を埋めます。きれいな鉗子を使用して、すぐに冷たいイソペンタン/2-メチルブタンにOCTと脳とのクリオムオールを置きます。
- OCTが固まったら(30~40s)、脳と共にクリオムオールを取り除き、ドライアイスに入れます。2-メチルブタンに脳を含む型を2分過ぎて放置しないでください。
4. 凍結脳腫瘍組織の切除
- ラベル 2 μm ポリエチレンナフタレート (PEN) スライドをサンプル情報と共に示します。組織切片は、断面後のこれらのスライドに直接配置される。
- クライオスタットチャンバの温度を-20~-24 °Cの範囲に設定します。切り離す前に、サンプルブロックをクライオスタットチャンバーに入れ、チャンバー内の温度に平衡させて30〜60分間下さい。
- 100%エタノールでクライオスタットチャンバーとナイフホルダーを洗浄し、RNase洗浄液と一緒に使用するブラシをスプレーします。クライオスタットチャンバー内で作業し、金型を取り外し、脳を含むOCTブロックをOCTと共にクライオスタット標本ディスクに取り付けます。
- 使い捨てのブレードを切り離しホルダーに取り付けます。
- 脳の厚さ10μmで切り離します。組織に筋や傷の線がないことを確認してください。ペイントブラシを使用して、慎重に平らにし、切断面に組織をアンカールします。
- 脳の切片を含む組織をRNaseフリーPENガラススライドに慎重に取り付けます。正の荷電ガラススライドを指で組織の方向に反転させ、ガラススライドを組織セクションに向かって滑らかに押し下げます。
注:手の温度は、組織がガラスに取り付けに役立ちます。 - 脳の切片をスライドに取り付けた後、クライオスタットチャンバー内の箱にスライドを保管し、-80°Cで保管します。スライドを室温に保ちないでください。
注:組織の折り畳み、および引き裂きが一般的です。正確な後分析のためには、これらのアーティファクトを最小限に抑えることが重要です。
5. 凍結保存脳組織切片の固定と染色
- RNAの完全性を保つために、RNase洗浄液と使用するすべての器具をクリーニングしてください。ヒュームフード内の固定と染色プロトコルを進めます。
- 記載された固定溶液をクリーンRNaseフリー50 mLチューブで準備します。染色の日にRNaseの自由な水ですべての解決を作る。
- 同日、レーザーマイクロディシスが行われ、100%、95%、70%、50%のエタノール溶液を調製する。ソリューションを室温で密閉チューブに保管してください。
- 75%エタノール溶液に4%クレシルバイオレットと0.5%のエオシンYを調製します。溶液を1分間激しく渦し、0.45 μmのナイロンフィルターで濾過し、未溶解粉末の痕跡を除去します。
- 組織スライドを30sの95%エタノールで容器に入れ、75%エタノールを含むチューブにスライドを移す。スライドを30sのためにそこに残します。
- 50%エタノールにスライドを移し、25 sのためにそこに残します。この時点で、OCT はディゾルブされます。スライドを20sの4%クレシルバイオレット溶液に移し、5sの場合は0.5%のエオシンY溶液に移します。
- 染料溶液からスライドを取り出し、フィルターペーパーでスライドを乾かします。その後、スライドを25sの50%エタノールに入れ、スライドを25sの75%エタノールに移し、スライドを30sの95%エタノールに移し、スライドを60の100%エタノールに移します。
- スライドをキシレンですすります。エキシレン付きの容器に移し、3分待ちます。
- RNaseフリーの水に取り付け媒体(例えば、ピンポイントガム)を準備します。マウスの脳の切片を取り付けるには、RNaseフリー水中の取り付け媒体を1:10の割合で希釈します。
- RNaseフリーの表面のスライドを室温で10 s乾かします。キシレンが乾く前に、組織切片でスライドを取り付けるに進みます。
- 滅菌およびRNaseフリーの薄い絵筆でスライド上のティッシュの上に取付け液を穏やかに分散させる。10〜20 sを待ってから、すぐに組織スライドを顕微鏡顕微鏡解剖プラットフォームに移します。
注:取り付けに使用されるRNaseフリー水に対する取り付け媒体の比率は、目的の組織によって異なります。取り付け媒体/水の比率はRNAの完全性に影響を与えずにレーザーの微小解剖のためのグリオーマ組織形態を維持する。
6. レーザーキャプチャマイクロディシブ
注:レーザーキャプチャマイクロディスセクション顕微鏡は、腫瘍組織内の特定の関心領域をレーザーマイクロディセックするために利用する必要があります。組織レーザーマイクロ解剖の時間を最小限に抑えるために、固定および染色の前にLMD顕微鏡を用意してください。
- システムを起動するには、まず電源ストリップをオンにし、次にレーザーをオンにします。次に、顕微鏡コントローラとコンピュータの電源を入れます。LMD ソフトウェアを起動します。
- [顕微鏡コントロール] で、[10 倍の倍率] を選択します。レーザー制御の下で、組織解剖のためのレーザーパラメータを設定します。最良の切断結果を得るには、レーザー周波数を120 Hzに設定します。必ずレーザー電流を100%に設定してください。
- 正確なレーザーマイクロディセクショを得るためには、速度を10に、開口設定を2.0~10.0 μmに設定します。レーザーパワーを高い設定で持つことは、ガラスエッチングを引き起こす可能性があります。
- 解剖後の組織を捕獲する組織コレクタをロードする。2 番目のアンロード ボタンをクリックします。空のコレクタを取り外し、30 μLのリシスバッファーを含むDNase/RNaseフリーの0.5 mL PCRフラットヘッドチューブをコレクターに配置します。コレクターをマシンに戻し、ソフトウェアの「続行」をクリックして続行します。
- 加工した(固定され染色された)標本を顕微鏡に積み込みます。まず、LMD ソフトウェアの[アンロード]をクリックします。次に、スライドホルダーにサンプルを取り付け、スライドホルダーをステージに置きます。続行するには、ソフトウェアの[続行] をクリックします。
- [シェイプ の切り取り] ウィンドウで、[描画 + 切り取り]を選択します。顕微鏡コントロールを使用して、対象領域を見つけます。対象領域(ROI)を描画し、デスティネーション コレクター チューブを選択します。複数のROIを描画して、1つのスライドから異なる領域を同時にマイクロ解剖することが可能です。
- [切り取り開始]をクリックして、組織マイクロ解剖に進みます。関心のある領域を切り離した後、ホルダーからコレクターチューブを取り外し、ドライアイスの上にチューブを置きます。収集したRNA組織サンプルを-80°Cに移し、長期保存します。
7. 微小解剖グリオーマ組織のRNA分離
- LMD からの RNA 抽出では、小さなサンプルと低い RNA 収量に最適化された RNA 分離キットを使用します (材料表を参照)。製造手順に従います。全ての分離ステップを室温(25°C)で行います。RNAの品質を維持するために、迅速に働きます。製造元の指示に従って、すべてのソリューションを準備します。
- 1%β-メルカプトエタノールを使用して、サンプルの体積を 350 μL に調整し、リシス バッファーを使用します。40sの試料をボルテックスして、サンプルの粘度を低下させ、RNA溶出スピンカラム効率を高める。
- サンプル全体を2mLのコレクションチューブに入れたgDNAエリミネータースピンカラムに移します。8,000 x gで30 sのチューブを遠心分離.フロースルーを保存し、遠心分離後のカラムに液体が残らないようにします。
- フロースルーに350μLの70%エタノールを加え、上下にピペットを入れ、よく混ぜます。サンプルを、2 mLのコレクションチューブに入れたRNA溶出スピンカラムに移します。ふたをそっと閉め、遠心分離機は8,000 x gで15 s.フロースルーを破棄し、列を保存します。
- RNA溶出スピンカラムに700 μLのRNA洗浄バッファー1(エタノール20%、900 mM GITC、10 mM Tris-HCl pH 7.5)を加えます。蓋をそっと閉め、8,000 x gで15sの遠心分離機をしてスピンカラム膜を洗浄します。フロースルーを破棄します。
- 遠心分離後、RNA溶出スピンカラムを回収管から慎重に取り出して、カラムがフロースルーに接触しないようにします。
- スピンカラムに第2RNA洗浄バッファー(エタノール80%、NaCl 100 mM、トリス-HCl 10 mM pH 7.5)の500 μLを加えます。柱の蓋を閉じ、8,000 x gを20 s回転してカラム膜を洗浄します。フロースルーを破棄します。
- RNA溶出カラムを洗浄するには、80%エタノールの500 μLを加え、8000 x gで8000 x gの遠心分離機の蓋を閉じ、溶出液でチューブを投げ出します。
- 新しいコレクションチューブを使用し、スピンカラムと遠心分離機の蓋を8000 x gで開け、5分間乾燥させます。溶出管を捨てる。
- RNA溶出スピンカラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに入れる。スピンカラム膜の中心に37°Cで直接加温したRNaseフリー水12μLを加えます。4分間、遠心分離機をフルスピードで1分間待ってRNAを溶出させます。
8. RNAの品質管理、ライブラリーの調製およびRNA-Seq分析
- RNAの抽出と精製に続いて、RNAを増幅し、メーカーの指示に従ってピコモル濃度でのRNA分離に適した特別なキットを使用してcDNAライブラリを作成します(材料表を参照)。製造元の指示に従ってください。他のPCR製品との汚染やサンプルのヌクレアーゼ分解を避けるためにワークステーションを清掃してください。
- RNAが4より大きいRIN値を有する場合、RNAは良好な品質または部分的にしか分解されない、断片化ステップを進める。氷の上のすべてのアイテムを準備します。
- マスターミックスを作成します(表 1)。ヌクレアーゼを含まない薄壁0.2 mL PCRチューブで反応混合物を作成します。熱蓋サーマルサイクラーで94°Cのチューブをインキュベートします。断片化インキュベーション時間は、RNAの品質に依存します。リン≥ 7:4分、リン5-6:3分、リン4-5:2分。
- インキュベーションに続いて、以前に-20°Cで冷却したPCRチラーラックにチューブを置き、2分間座らせます。
- RNAサンプルの各チューブについて、最初のストランド合成反応マスターミックスを準備する(表2)。表3に記載の条件下で、ホット蓋サーマルサイクラーでチューブをインキュベートする。cDNA製品は、次のステップに進む前に2週間まで-20°Cで凍結することができます。
- 表 4に示すように、PCR マスター ミックスを作成します。熱い蓋サーマルサイクラーにチューブを入れ、表5に示す設定でPCR反応を実行します。
- DNAを精製するために使用されるビーズを室温まで温めます。温めたら、各サンプルにビーズを40μL加えます。チューブを回転させ、チューブの底部に液体を集めるために短時間混ぜてスピンダウンします。DNAがビーズに結合できるように、チューブを室温で8分間インキュベートします。
- チューブを磁気分離装置に置き、約5分間、または溶液が完全に透明になるまで座らせます。分離装置上のチューブを維持し、ビーズを邪魔することなく慎重に上清を除去するためにピペットを使用しています。
- チューブを分離装置に保管し、200 μLの作りたての80%エタノールをビーズに加え、ビーズを邪魔することなく洗浄します。80%エタノールを取り除く前に30 sを待ちます。この手順を繰り返します。
- チューブを簡単に回転させ、分離装置にチューブを戻します。ビーズを邪魔することなく残存80%エタノールを除去します。
- キャップを5分間開けてチューブを乾燥させます。ビーズが乾燥するので、長く座らせないでください。
- チューブを分離装置に保管し、52 μLのヌクレアーゼを含まない水を加えてビーズを覆います。分離装置からチューブを取り出し、すべてのビーズが再懸濁されるまでピペットを上下に取り外します。室温で5分でインキュベートします。
- 溶液が明らかになるまでチューブを分離装置に戻し、約1分で得られた上清の50 μLを8ウェルストリップのウェルに移します。各サンプルに40μLの新しいビーズを加えます。渦を徹底的に混ぜる。室温で8分間インキュベートすることでビーズをDNAに結合させます。
- このインキュベーション期間中に、サンプル中に存在する任意のrRNAに使用する成分の解凍を開始します。解凍したら、氷の上に置きます。また、サーマルサイクラーを72°Cに予熱する。
- 溶液がクリアされるまで(約5分)磁気分離装置上にサンプルを置きます。アリコート 1.5 μL のプローブを、冷却 PCR チューブにサンプルあたり。チューブを72°Cの設定で2分間、4°Cの予熱サーサイクラーに入れます。
- サンプルチューブを磁気分離装置に入れておき、ビーズを邪魔することなくピペットで上清を取り除きます。その後、ビーズを邪魔することなく洗浄するために、ビーズに作りたての80%エタノールの200 μLを加えます。80%エタノールを取り除く前に30s待ちます。この手順を繰り返します。
- チューブを簡単に回転させ、分離装置にチューブを戻します。ビーズを邪魔することなく残存80%エタノールを除去します。キャップを2分間開けてチューブを乾燥させます。ビーズが乾燥するので、長く座らせないでください。
- 以下のコンポーネントを記載されている順序で組み合わせることにより、すべてのサンプルのマスターミックスを準備します (表 6)。
- ボルテックスでマスターミックスを混合し、各サンプルの乾燥ビーズにミックスの22 μLを追加し、再中断するために完全に混合します。室温で5分間インキュベートします。
- チューブを回転させ、磁気分離装置に1分間、またはサンプルが明らかになるまで置きます。新しいPCRチューブにビーズを邪魔することなく、上清の20 μLを移します。チューブを事前加熱サーマルサイクラーに入れ、表7の設定を下に置きます。
- 各サンプルの反応に十分な PCR マスター ミックスを準備します。示された表 8のマスター ミックスに次のコンポーネントを追加します。ステップ8.20から各サンプルチューブに80μLのPCRマスターミックスを加え、サーマルサイクラーに次の設定を置きます(表9)。
- DNAを精製するために使用されるビーズを室温まで温めます。温めたら、各サンプルに100 μLのビーズを加えます。DNAがビーズに結合できるように、チューブを室温で8分間インキュベートします。
- チューブを磁気分離装置に置き、約5分間、または溶液が完全に透明になるまで座らせます。
- 分離装置上のチューブを維持し、ビーズを邪魔することなく慎重に上清を除去するためにピペットを使用しています。
- チューブを分離装置に保管し、200 μLの作りたての80%エタノールをビーズに加え、ビーズを邪魔することなく洗浄します。80%エタノールを取り除く前に30 sを待ちます。この手順を繰り返します。
- 簡単に言えば、チューブを回転させ、分離装置にチューブを戻します。ビーズを邪魔することなく残存80%エタノールを除去します。
- キャップを5分間開けてチューブを乾燥させます。ビーズが乾燥し過ぎるように長く座らせないでください。ピペット20μLのトリスバッファーを乾燥ペレットにする。分離装置からチューブを取り外し、ピペットと十分に混ぜてビーズを再中断します。室温で5分間インキュベートします。
- チューブを分離装置に2分間置くか、溶液が明確になるまで置きます。上清を獲得し、新しいチューブに移します。その後、収集した溶液を-20°Cに保存します。
- 品質と量の制御のための最終的なライブラリの必要を確認してください。製造元の推奨プロトコルに従って、サンプルをクラスター化し、組み合わせエンド 50 nt 読み取りとしてシーケンスします。
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Representative Results
当研究室では、睡眠美容トランスポザーゼシステムを用いて遺伝子操作マウスモデル(GEMM)を生成しました(図1A)。このシステムは、新生児マウスの神経前駆細胞のゲノムに特異的な遺伝的変化を組み込む。これらの変化した前駆細胞は内因性グリオーマ腫瘍を形成する。腫瘍を発生させるために使用されたプラスミド配列は次の例: (1) 睡眠美容トランスポゾン用 pT2C-LucPGK-SB100X ルシメラーゼ発現、(2)NRAS発現に対するpT2-NRASSV12、(3)p53ノックダウンおよびGFPタンパク質発現のためのpT2-shp53-GFP4、および(4)ATRXノックダウンのためのpT2-shATRx-GFP4。プラスミドを、前に説明した11日齢の新生児の前室に注入した。プラスミド取り込みおよび腫瘍形成をインビボ生物発光イメージングシステムを介してモニタリングした。腫瘍を持つマウスが腫瘍の負担の徴候を示すと、彼らは犠牲にされた。腫瘍は、神経圏培養を生成するために使用されるか、またはLMD処理のために直接凍結保存された(図1A)。
GEMMから始まった細胞培養物を、翻訳可能なグリオーマモデルを生成するために使用した(図1B)。GEMM腫瘍に由来する神経球を培養し、免疫に優れたマウスの線条体にクラニタルで移植した。神経球培養から得られた単一細胞懸濁液を用いて、我々の研究室10,11,12,11で前に述べたように頭蓋内移植によってグリオーマ腫瘍を12発生させた。この方法論により、マウス1個(30,000個の細胞/1 μL/マウス)に移植する細胞数を慎重に定量化することができます。このプロトコルは異なった実験の注入間の結果の再現性を可能にする。しかし、神経球の移植は、マウスグリオーマ腫瘍とその後のLMDおよびRNA-Seq分析を生成する代替オプションとなり得る。しかし、この方法はより正確であると考えられます。腫瘍の進行は生体発光スペクトル画像化システムによってモニタリングされた。腫瘍の負担の徴候を示すマウスは、脳を脳内に透過的に浸透させ、脳をLMD処理のために凍結保存した(図1C)。
組織切片を、神経膠腫内の多細胞構造の転写体を特徴付けるためにレーザーマイクロ分離した。記載の灌流、凍結および埋め込み手順は、組織形態を保存し、レーザーマイクロ解剖後に良質のRNAを得るために最適化されました。異なる灌流アプローチは、優れた形態およびRNA完全性を有する組織を獲得するために評価された(表10)。目的の領域を解剖するには、RNA用の無害な色素で組織を染色する必要があった(図2)。我々は、タイロードの溶液を腫瘍軸マウスに5分間浸透させ、その後30%スクロースを15分間浸透させ、続いて解剖された脳を30%スクロースに一晩貯蔵すると腫瘍組織の形態とRNA完全性を維持することを観察した(図3D)。30%スクロース溶液を灌流すると、組織内の氷結晶形成が妨げられた。しかし、パラホルムアルデヒド組織固定は、高品質の組織形態をもたらしたが、RNA完全性は悪影響を受けた(図3B)。タイロードの5分間の溶液やタイローデの溶液(5分間+30%スクロース溶液)を15分間(図3AおよびC)のような他のアプローチはRNAの品質に影響を与えませんでした。これらの条件下では、脳は一晩30%スクロースに保存されませんでした。我々は組織形態の分解能の低下を観察した。
様々な染色技術を行い、その後RNAの完全性の品質管理分析を行いました。我々は、4%クレシルバイオレットおよび0.5%のエオシンY染色が、多細胞構造の多細胞構造を同定し、RNAの完全性を維持するのに十分であることを観察した。クレシルバイオレットは、濃い青色で細胞の核を染色する酸性の色素です。エオシンYは、細胞の基本的な成分を染色する好塩基性染料である。
この組織が実装媒体で装着されていないと、切片が脱水状態になり、形態が悪化することを観察した(図4A)。高品質の組織形態を維持するために、我々は取り付け媒体と組織を取り付けた。我々は、15%の取り付け培地(水の30μLの30μL)が高品質の組織形態を維持することを観察した(図4B)。
図5AAでは、異質性の神経膠腫の領域が示されている。画像は、解剖前のレーザーキャプチャマイクロ解離顕微鏡を用いて取得した。赤い線は、長葉細胞(細長い細胞)が豊富な領域を示しています。青い線は、間葉系細胞のない領域(丸みを帯びた細胞)を示しています(図5A、中央の画像)。図5BBは、レーザーマイクロ解剖腫瘍領域(赤線)および正常な脳組織領域(青線)の画像を示す。ROI の選択は、対象領域を解剖するために行われます (図 5AおよびB、下の画像)。これらの画像では、選択した領域の解剖における成功を観察することができます。
RNA抽出は、市販キットを用いて行った。解剖組織の全面積は、2.5 x10~7 x 106 μm2の間で、mRNA抽出およびcDNAライブラリー調製に必要と判断された。RNAの品質管理は、レーザーマイクロ切断後にグリオーマ組織の6〜7の間のRINを決定した。RIN 6はcDNAライブラリ調製に適していると判断した。RNA抽出後、ピコモラー濃度でのRNA単離用キットを利用して、次世代シーケンシングに適したcDNAライブラリを生成しました。
| 0.25 ng - 10 ng (1-8 μL) の RNA |
| 5xファーストストランドバッファの4 μL |
| オリゴミックスV2の1 μL |
| ヌクレアーゼフリー水から最終体積13μL |
表1:RNAの品質管理およびライブラリー調製:ステップ8.3のためのマスターミックス調製。
| 4.5 μL ミックス V2 |
| 0.5 μL RNase阻害剤 |
| 2 μL逆転写酵素 |
| 最終容積は7 μL |
| RNAサンプルチューブに7μLを加える |
表2:RNAの品質管理およびライブラリー調製:ステップ8.5のためのマスターミックス調製。
| 42°C 90分間 |
| 70°C 10分間 |
| 4°Cホールド |
表3:RNAの品質管理およびライブラリー調製:ステップ8.5のサーモサイクラー条件。
| ヌクレアーゼフリー水 2 μL |
| 25 μL 2x PCR バッファー |
| 各反応に対する1 μL DNAポリメラーゼ |
| 穏やかに混ぜて、短くスピンダウン |
| 各サンプルチューブに28 μLのマスターミックスを加える |
| 各チューブに5'および3'プライマーの1 μLを加える |
| 反応を穏やかに混ぜて、短くスピンダウンする |
表4:RNAの品質管理およびライブラリー調製:ステップ8.6のためのマスターミックス調製。
| 1サイクル |
| 94 °C 1分間 |
| 5サイクル |
| 98°C 15s |
| 55°C 15s |
| 30 s のための 68 °C |
| 1サイクル |
| 68°C 2分間、4°Cホールド |
表5:RNAの品質管理およびライブラリー調製:ステップ8.6のサーモサイクラー条件。
| 16.8 μL ヌクレアーゼフリー水 |
| 2.2 μL 10x R バッファ |
| 1.5 μL R v2 |
| 1.5 μL R-プローブ v2 |
表6:RNAの品質管理およびライブラリー調製:ステップ8.18のためのマスターミックス調製。
| 37°C 60分 |
| 72 °C 10分 |
| 4°Cホールド |
表7:RNAの品質管理およびライブラリー調製:ステップ8.20のサーモサイクラー条件。
| 26 μL ヌクレアーゼフリー水 |
| 50 μL CB PCR バッファー |
| 2 μL PCR2 プライマー v2 |
| 2 μL DNA ポリメラーゼ |
表8:RNAの品質管理およびライブラリー調製:ステップ8.21のためのマスターミックス調製。
| 1サイクル |
| 94 °C 1分間 |
| Xサイクル |
| 98°C 15s |
| 55°C 15s |
| 30 s のための 68 °C |
| 1サイクル |
| 68°C 2分間、4°Cホールド |
表9:RNAの品質管理およびライブラリー調製:ステップ8.21のサーモサイクラー条件。
| ステップ 1 | ステップ 2 | ステップ 3 | |
| 方法 1 | タイロードの15' | -- | -- |
| 方法 2 | タイロードの5' | スクロース 30% 15' | -- |
| 方法 3 | タイロードの5' | 4% PFA 10' | -- |
| 方法 4 | タイロードの5' | 30% スクロース 15' | 30%スクロース一晩の脳 |
表10:異なる灌流アプローチの方法。
図1:レーザー微小解剖に使用されるマウスのグリオーマモデル(A) 眠れる美女 GEMM がデノボ神経膠腫を発症するために使用されます。画像は腫瘍の進行を示す:(i)新生物の側心室へのプラスミド注入、(ii)腫瘍負担。(B)グリオーマ細胞培養を用いた移植可能なグリオーマモデルの生成GEMMから培養した神経球細胞は、線条体にクラニアに埋め込まれる。(C) 灌流後のコロナ配向に埋め込まれた脳のクライオ断面の描写この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:クレシルバイオレットとエオシンを用いて凍結保存組織切片を染色するために用いられる方法の模式的表現。染色に使用するスライドは、RNaseフリーの水で洗浄された工具で取り扱った。すべてのソリューションは、染色の日にRNase / DNaseフリーウォーターで調製されました。クレシルバイオレット染色は、ビレミア核とエオシンY染色細胞質ピンク。70%エタノールに溶解した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:組織形態とRNAの完全性を維持するための様々な灌流アプローチの比較。H&E画像は、異なる方法で灌流を受けた脳組織の比較形態を表す:(A)15分間のタイローデの溶液、(B)タイロードの溶液を5分間、4%PFAを10分間、(C)タイローデの溶液を5分間、30%スクロースを15分間、そしてC(D)タイローデの溶液を5分間、30%スクロースを15分間、30%スクロースを30%スクロースに浸した。各灌流法についてRNA品質評価が表示されます。プロットは、18および28s rRNAピークと初期マーカーピークを描いています。18sおよび28s rRNAの比は、RNAの品質を決定するために使用されます。RNA断片のゲル画像がプロットの右側に表示されます。RNAの品質は、RIN値を用いて評価した。RNAの品質は、方法A、C、およびD.組織形態がCおよびDの方法において優れていたが、この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
図4:実装された、非実装のグリオーマ組織の代表的な画像。(A) H&E で染色された組織の代表的な画像。この組織はアンマウントされたまま放置され、組織の壊れで貧弱な形態を示す脱水状態になった。(B)H&Eで染色され、取り付け媒体で取り付けられた組織の代表的な画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:レーザー顕微鏡解剖に用いられるグリオーマ組織の代表的な画像。(A-B)H&Eで染色された組織の代表的な画像と、LMD用に選択された多細胞構造の領域。(A) 左には、細長い細胞(赤)と制御領域(青)の領域がLMD用に選択されました。(B)右側には、集団侵入領域(赤)と制御領域(青)がLMDに選択された。(C)レーザーマイクロディスカテッド領域の代表的なRNA品質管理。合計面積は6.5 x 106 μm2でマイクロディセクテッドした。この分析は、2,346 pg/μLのRNA濃度とRNA完全性数(RIN)を示しています:6.8。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
神経膠腫の不均一性と侵略の根底にある分子メカニズムを理解することは、新しい治療標的13を発見するために非常に重要である。本稿では、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)に続いて、微小化解析を行い、それに続いて神経膠腫の不均質性と浸潤の分子景観を解析するための詳細かつ最適化された方法を説明する。
レーザー捕捉マイクロディション(LMD)は、腫瘍内の異なる領域または単一細胞を同定するために使用することができ、腫瘍14の空間的文脈を維持する分子パターンをさらに分析する特定のサンプルを提供する。この技術は、固形腫瘍15における空間転写体を分析するために用いられる他の方法と比較して、信頼性が高く、低価格である。遺伝子組み換えマウス腫瘍モデルまたは頭蓋内埋め込み型モデルの神経膠腫の不均一性と浸潤をLMDを用いて分析した。これらのモデルは、ヒトグリオーマの顕著な特徴を再現し、神経膠腫の不均一性および浸潤10,12,12の研究を可能にする。
良質の腫瘍組織形態とRNAの完全性を維持することは、LMDの限界の1つである。組織形態を改善するために、マウスにタイロードの溶液を5分間浸透させ、続いて30%のスクロースを同じ溶液に溶解させた。脳を解剖すると、一晩RNase/DNaseフリーの水に溶解した30%のスクロースに、または脳が貯蔵容器の底に達するまで保存しました。これらのステップは、組織の形態を有意に改善し、凍結保存中の組織中の氷結晶の形成を減少させた。ヒトグリオーマ組織はこのプロトコルには使用されなかったが、一晩の30%スクロース溶液中のヒトサンプルのインキュベーションは、凍結切片形態を改善するための実現可能な方法論となり得る。LMDのもう一つの可能な制限は、染色後のRNA完全性の保存である。他の研究チームは、グリオーマ組織にレーザー顕微鏡切除術を行い、その後RNA-seq分析を行ったが、RNAおよび/または形態学を示すものではなく、形態学的質、またはグリオーマ凍結セクション16の特定の制御についてコメントしていない。このプロトコルでは、正確な形態学的同定は、神経膠腫内の正確なマクロ細胞構造をレーザーマイクロディス分数するために不可欠であった。我々は、グリオーマ組織をエタノール溶液で固定し、4%クレシルバイオレットと0.5%のエオシンYをエタノール維持RNA品質に溶解して染色し、単一細胞および多細胞構造の顕微鏡同定を可能にすることを観察した。我々は、取り付け溶液を用いたグリオーマ切片の取り付けが、組織の亀裂や裂け目の形成を防ぐ重要なステップであることを実証した。エタノールに溶解した取り付け媒体を使用すると組織形態が悪くなるので、取り付け媒体は水に準備する必要があることに注意してください。レーザーマイクロディシケートは、RNaseフリー環境でできるだけ速く行う必要があります。RNAの品質管理と転写分析の両方に適切な量のRNAを得るために、最大2.5 x 106 μm2の腫瘍/組織面積を切除することをお勧めします。
LMDは、グリオーマの不均一性と浸潤を調節する分子シグナル伝達経路の解析を可能にする。この分析は、前臨床神経膠腫モデルにおける診断、予後および将来の翻訳発達のための新しい潜在的標的を明らかにすることができる。
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Disclosures
この論文の著者は、すべての潜在的な利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
研究は国立衛生研究所(NIH/NINDS)助成金によってサポートされました:R37-NS094804、R01-NS105556、R21-NS107894からM.G.C.;(NIH/ニンズ)P.R.L.に R01-NS076991、R01-NS096756、R01-NS082311 を付与します。(NIH/NIBI): R01-EB022563;(NIH/NCI)U01CA224160;ミシガン大学ローゲルがんセンター、チャドタフ財団、リアのハッピーハーツ財団、M.G.C.とP.R.L.生物医学グラントF046166、M.G.C.国立衛生研究所、UL1 TR002240ミシガン臨床健康研究所(MICHR)、博士後期翻訳学者プログラム(PTSP) ミシガン大学フォーベがん研究所へのプロジェクトF049768、失明防止研究研究から医師科学者賞(RPB)、NIH(AK)のNEIからR01 EY022633を付与し、RPBから眼科と視覚科学科への無制限の助成金。本研究では、ビジョン研究コア(P30 EY007003)とがんセンター研究コア(P30 CA046592)を活用しました。AKは、A.アルフレッド・タウブマン医学研究所のウィリアム・デビッドソン夫人・エマージング・スカラー賞の支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Corning PCR Tubes | Sigma Aldrich | CLS6530 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco | 11330057 | |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | |
| HiSeq 4000 | Illumina | N/A | |
| Laser Microdissection (LMD) System | Leica | LMD7000 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| Normocin - Antimicrobial Reagent | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Peel Away Disposable Embedding Molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| PEN Membrane Glass Slide (2 µm) | Lieca | 1150518 | |
| Pinpoint Solution | Zymo Research | D3001-1 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B-1MG | |
| Research Cryostat | Leica | CM3050s | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian | Takara Bio | 634411 | |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 |
References
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