Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

Andrea Comba; Patrick  J. Dunn; Phillip  E. Kish; Padma Kadiyala; Alon Kahana; Maria  G. Castro; Pedro  R. Lowenstein

doi:10.3791/60939

Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

7K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/60939

⸱

12. April 2020

Andrea Comba¹^,²^,⁴ , Patrick J. Dunn¹^,²^,⁴ , Phillip E. Kish¹^,³ , Padma Kadiyala¹^,²^,⁴ , Alon Kahana³ , Maria G. Castro¹^,²^,⁴ , Pedro R. Lowenstein¹^,²^,⁴

¹Dept. of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, ²Dept. of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, ³Dept. of Ophthalmology & Visual Science, University of Michigan Medical School, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Lasermikrodissektion (LMD) ist eine empfindliche und hochreproduzierbare Technik, die verwendet werden kann, um Wege aufzudecken, die Gliomheterogenität und Invasion vermitteln. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Isolierung diskreter Bereiche aus Gliomgewebe mittels Laser LMD, gefolgt von transkriptomischer Analyse.

Zusammenfassung

Gliome sind primäre Hirntumoren, die sich durch ihre Invasivität und Heterogenität auszeichnen. Spezifische histologische Muster wie Pseudopalisaden, mikrovaskuläre Proliferation, mesenchymale Transformation und Nekrose charakterisieren die histologische Heterogenität hochwertiger Gliome. Unser Labor hat gezeigt, dass das Vorhandensein von hohen Dichten von mesenchymalen Zellen, die Oncostreams genannt werden, mit Tumormalignität korreliert. Wir haben einen einzigartigen Ansatz entwickelt, um die Mechanismen zu verstehen, die dem Wachstum und der Invasion von Glioma zugrunde liegen. Hier beschreiben wir ein umfassendes Protokoll, das Lasercapture Microdissection (LMD) und RNA-Sequenzierung nutzt, um die differenzielle mRNA-Expression intratumoraler heterogener multizellulärer Strukturen (d. h. mesenchymale Bereiche oder Bereiche der Tumorinvasion) zu analysieren. Diese Methode bewahrt eine gute Gewebehistologie und RNA-Integrität. Perfusion, Einfrieren, Einbetten, Schnitt und Färbung wurden optimiert, um die Morphologie zu erhalten und hochwertige Lasermikrodissektionsproben zu erhalten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Perfusion von Gliom-tragenden Mäusen mit 30% Saccharose eine gute Morphologie und RNA-Qualität bietet. Darüber hinaus führt die Färbung von Tumorabschnitten mit 4% Cresylviolett und 0,5% Eosin zu einer guten kern- und zellulären Färbung unter Beibehaltung der RNA-Integrität. Die beschriebene Methode ist empfindlich und hochreproduzierbar und kann verwendet werden, um Tumormorphologie in verschiedenen Tumormodellen zu studieren. Zusammenfassend beschreiben wir eine vollständige Methode zur Durchführung von LMD, die Morphologie und RNA-Qualität für die Sequenzierung bewahrt, um die molekularen Merkmale heterogener multizellulärer Strukturen innerhalb solider Tumoren zu untersuchen.

Einleitung

Gliome sind die aggressivsten Primärtumoren des zentralen Nervensystems. Sie sind hochinvasiv und heterogen¹. Die Analyse zellulärer und molekularer Komponenten des Tumors wird neue therapeutische Ziele aufzeigen.

Unter verschiedenen derzeit verfügbaren Methoden ist die Lasercapture-Mikrodissektion (LMD) von gefrorenem Hirntumorgewebe eine kostengünstige, zuverlässige Technik, die die Isolierung diskreter anatomischer Bereiche oder spezifischer Zellpopulationen aus Tumorgeweben ermöglicht, um ihr molekulares Profil zu untersuchen²^,³. LMD ermöglicht die Analys....