Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva

Summary

Präsentiert wird hier eine mikroskopische Multiphotonen-Plattform für die Live-Maus-Augenoberflächenbildgebung. Fluoreszierende transgene Maus ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen, Zellmembranen, Nervenfasern und Kapillaren innerhalb der Augenoberfläche. Nichtlineare Signale der zweiten harmonischen Generation, die von kollagenen Strukturen abgeleitet werden, bieten eine etikettenfreie Bildgebung für stromale Architekturen.

Abstract

Herkömmliche histologische Analysen und Zellkultursysteme reichen nicht aus, um die physiologische und pathologische Dynamik in vivo vollständig zu simulieren. Multiphotonenmikroskopie (MPM) hat sich zu einer der beliebtesten bildgebenden Modalitäten für biomedizinische Studien auf zellulärer Ebene in vivo, Vorteile sind hohe Auflösung, tiefe Gewebepenetration und minimale Phototoxizität. Wir haben eine MPM-Bildgebungsplattform mit einem maßgeschneiderten Maus-Augenhalter und einer stereotaxic-Bühne für die Bildgebung der Augenoberfläche in vivo entwickelt. Dual fluoreszierende Protein-Reportermaus ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen, Zellmembranen, Nervenfasern und Kapillaren innerhalb der Augenoberfläche. Neben Multiphotonenfluoreszenzsignalen ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der zweiten harmonischen Generation (SHG) die Charakterisierung kollagener Stromalarchitektur. Diese Plattform kann für die intravitale Bildgebung mit genauer Positionierung über die gesamte Augenoberfläche, einschließlich Hornhaut und Bindehaut, eingesetzt werden.

Introduction

Die okulären Oberflächenstrukturen, einschließlich der Hornhaut und bindehaut, schützen andere tiefere Augengewebe vor äußeren Störungen. Die Hornhaut, der transparente vordere Teil des Auges, fungiert sowohl als Brechungslinse zur Lichtausweise ins Auge als auch als Schutzbarriere. Das Hornhautepithel ist die äußerste Schicht der Hornhaut und besteht aus unterschiedlichen Schichten von oberflächlichen Zellen, Flügelzellen und Basalzellen. Corneal stroma besteht aus raffiniert verpackten kollagenen Lamellen, die mit Keratozyten eingebettet sind. Hornhautendothel, eine einzige Schicht flacher sechseckigen Zellen, spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Transparenz der Hornhaut, indem Hornhautstroma durch seine Pumpfunktionen in einem relativ dehydrierten Zustand gehalten wird¹. Limbus bildet die Grenze zwischen der Hornhaut und der Bindehaut und ist das Reservoir von Hornhautepithelstammzellen². Die hochgradig vaskularisierte Bindehaut hilft, die Augen zu schmieren, indem sie Schleim und^Tränen3 produziert.

Die Zelldynamik der Hornhautoberflächenstrukturen wird konventionell entweder durch histologische Analyse oder in vitro Zellkultur untersucht, die die In-vivo-Zelldynamik möglicherweise nicht ausreichend simuliert. Ein nicht-invasiver Live-Imaging-Ansatz kann daher eine solche Lücke überbrücken. Aufgrund seiner Vorteile, die hohe Auflösung, minimale Photoschäden und tiefere Bildtiefe umfassen, hat sich MPM zu einer leistungsstarken Modalität in verschiedenen Bereichen der biologischen Forschung^4,5,6,7,8. Für die Hornhautbildgebung liefert MPM zelluläre Informationen aus der intrinsischen Autofluoreszenz, die aus dem intrazellulären NAD(P)H abgeleitet wurde. Die Signale der zweiten harmonischen Generation (SHG), die von den nicht-zentrosymmetrischen Kollagenfasern des Typs I unter Femtosekunden-Laserscanning abgeleitet werden, bieten kollagene Stromalstrukturen ohne zusätzliche Färbeverfahren⁹. Zuvor haben wir und andere Gruppen MPM für die Bildgebung von tierischen und menschlichen Hornhäuten^{9,10,11,12,13,14,15}.

Transgene Mauslinien, die fluoreszierende Proteine in bestimmten Zellpopulationen aufweisen, wurden häufig für verschiedene Studien in der Zellbiologie verwendet, einschließlich Entwicklung, Gewebehomöostase, Geweberegeneration und Karzinogenese. Wir verwendeten transgene Mausstämme, die mit fluoreszierenden Proteinen gekennzeichnet sind, für die In-vivo-Bildgebung von Hornhäuten^9,10, Haarfollikel¹⁰ und Epidermis¹⁰ von MPM. Die doppelfluoreszierende Mausdehnung mit Zellmembran mit tdTomato und Zellkern mit EGFP-Kennzeichnung wird aus zwei Mausstämmen gezüchtet: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sor^tm1Ytchn/J, #021847)¹⁶ und mT-mG (Gt(ROSA26)^{ACTB-tdTomato-EGFP}, #007676)¹⁷. Die transgene Mauslinie R26R-GR enthält ein duales fluoreszierendes Protein-Reporterkonstrukt, einschließlich eines H2B-EGFP-Fusionsgens und eines mCherry-GPI-Ankersignal-Fusionsgens, das in den Gt (ROSA)26Sor-Lokus eingeführt wird. Der transgene MT-mG-Stamm ist eine zellmembranorientierte tdTomato- und EGFP-fluoreszierende Cre-Reporter-Mäuse. Vor der Cre-Rekombination ist Zellmembranprotein mit tdTomato-Fluoreszenzexpression in verschiedenen Zellen weit verbreitet. Dieser transgene Mausstamm ermöglicht es uns, Nuklei-EGFP und Membran mit tdTomato ohne Cre Anregung zu visualisieren. Zwei Weibchen (R26R-GR^+/+) und eine männliche (mT-mG^+/+) transgene Maus wurden zusammen gezüchtet, um genügend Mäuse für Experimente zu produzieren. Ihre Nachkommen mit R26R-GR^+/-;mT-mG^+/- Genotyp, einem dualen fluoreszierenden Mäusestamm, wurden in dieser Studie verwendet. Im Vergleich zu einer fluoreszierenden Reporter-Mauslinie, wie zuvor beschrieben^9,10, bietet uns diese duale fluoreszierende Reporter-Maus-Dehnung eine um 50 % reduzierte Erfassung der Bildzeit.

In dieser Arbeit beschreiben wir ein detailliertes technisches Protokoll für die In-vivo-Bildgebung der Augenoberfläche Schritt für Schritt mit unserer Bildgebungsplattform und zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen.

Protocol

Alle Tierversuche wurden nach den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der National Taiwan University und dem Chang Gung Memorial Hospital genehmigten Verfahren durchgeführt.

1. Multiphotonenmikroskopie-Setup

1. Bauen Sie ein System auf Basis eines aufrechten Mikroskops mit Wassereintauchen 20x 1,00 NA Objektiv (Abbildung 1A).
2. Verwenden Sie Ti: Saphirlaser (mit einstellbarer Wellenlänge) als Anregungsquelle. Stellen Sie die Laserausgangswellenlänge auf 880 nm für EGFP und 940 nm für tdTomato ein (Abbildung 1A).
3. Zur Trennung von SHG/EGFP und EGFP/tdTomato(Abbildung 1A)sind zwei dichroitische Spiegel (495 nm und 580 nm) enthalten. Trennen Sie die SHG-Signale, EGFP und tdTomato durch Bandpassfilter 434/17nm, 510/84nm und 585/40nm (Abbildung 1A).
4. Um die Bildqualität zu optimieren und Photobleichungen und Gewebeschäden zu vermeiden, stellen Sie die Laserleistung auf ca. 35 mW für die Bildqualität der Hornhaut und 50 mW für limbus ein. Messen Sie die Laserleistung, bevor der Laser das optische System passiert. Die genaue Laserleistung an Proben beträgt ca. 8-9 mW. Das komplette mikroskopische Design ist in Abbildung 1Adargestellt.
   HINWEIS: Die obere Grenze der Laserleistung ist auf 70 mW eingestellt, um Fotobleichungen und Gewebeschäden zu vermeiden.

2. Tierpräparation für Live-Bildgebung

1. Verwenden Sie 8-12 Wochen alte Mäuse für das Experiment. Intramuskulär injizieren 50-80 mg/kg Tiletamin HCl und Zolazepam HCl zur Vollnarkose. Überprüfen Sie auf den Mangel an Reaktion auf Entzugsreflex, indem Sie einen Zehen kneifen. Eine ausreichende Anästhesisierung ist wichtig, um eine stabile Überwachung der Atemfrequenz zu ermöglichen.
   HINWEIS: Mäuse im Alter von 8 Wochen oder höher werden empfohlen, weil ihre Augäpfel gereift sind.
2. Legen Sie die Maus unter Anästhesie auf eine beheizte Stufe und legen Sie die Temperaturüberwachungssonde in den Anus ein.
   VORSICHT: Die Sonde muss vollständig in die Analhöhle eingeführt werden, ohne der Luft zu ausgesetzt zu sein, um eine Überhitzung der Heizung und induktion des Hitzeschlags zu vermeiden.

3. Augenhaltung zur Live-Bildgebung der Augenoberfläche

1. Für die Live-Bildgebung der Augenoberfläche verwenden Sie den speziell entwickelten stereotaxic Maushalter, der aus zwei Teilen besteht: einem Kopfhalter, um den Kopf zu stabilisieren, und einem Augenhalter, um die Augenlider zurückzuziehen und die gesamte Augenoberfläche freizulegen (Abbildung 1B-D).
2. Ohrstangen in den externen Hörfleisch einstecken und die Dreipunktfixierung des Kopfhalters beibehalten (Abbildung 1B,D).
3. Topisch eine Lösung von 0,4% Oxybuprocainhydrochlorid in Kochsalzlösung auftragen und 3 min zur Anästhesisierung der Augenoberfläche belassen.
4. Stellen Sie sicher, dass der Augapfel durch die richtige manuelle Augenlid-Retraktion hervorsteht. Andernfalls können Ischämie und Blutungen des Augapfels auftreten.
5. Legen Sie vorsichtig eine Schlaufe des Polyethylenrohrs des Augenhalters entlang des Augenlidrandes, um die Augenoberfläche freizulegen. Stabilisieren Sie den Augapfel mit dem Augenhalter, der aus einer Nr. 5 Dumont Zange besteht, mit seinen Spitzen, die mit der Schleife aus Polyethylenrohr bedeckt sind (Abbildung 1C,D).
6. Schraubzange mit einem Knopf in distalen Zangen des Augenhalters, um den Augapfel stabil zu halten (Abbildung 1D).
7. Tragen Sie ein Augengel mit dem Brechungsindex von 1,338 auf die Hornhautoberfläche als Tauchmedium auf, um die Feuchtigkeit der Augenoberfläche stündlich aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus vermeidet die regelmäßige Anwendung des Augengels stündlich eine Trübung in der Hornhaut während der Bildgebung.
8. Drehen Sie den Augapfel mit dem Halter, der auf der Schritt-Motor-Bühne für die Bildgebung über die gesamte Hornhautoberfläche von der zentralen Hornhaut bis zum peripheren Bereich gesperrt ist (Abbildung 1C,D).
   VORSICHT: Sowohl überschüssige als auch unzureichende Mengen an Augengel können die Bildqualität während der Bildgebung beeinflussen. Daher ist die stündliche Ergänzung des Augengels wichtig, um die Oberfläche regelmäßig feucht zu halten.

4. Z-serielle Bildaufnahme

HINWEIS: Legen Sie die erste und letzte Folie in jedem Stapel fest, um die abtropfenden Bewegungsartefakte zu reduzieren.

1. Bevor Sie die Bilder aufnehmen, stellen Sie das Zielfeld mit einer Quecksilberlichtquelle ab.
2. Klicken Sie auf das Symbol der Mikroskopsoftware, um die Software einzuschalten.
3. Wählen Sie die richtige PMT-Verstärkung und digitale Verstärkung, um die Zellstruktur in der Augenoberfläche zu visualisieren.
4. Legen Sie die erste Folie und die letzte Folie fest, um einen Stapel zu erhalten.
5. Geben Sie numerische Werte für Bildauflösung und Z-Schritt ein, z.B. 512 x 512 und 1 m als Z-Schritt.
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um Z-Seriellbilder zu sammeln.
7. Erfassen Sie Live-Bilder zweimal im selben Bereich, zuerst bei 880 nm Anregung für die SHG/EGFP-Signalsammlung und zweitens bei 940 nm Anregung für die EGFP/tdTomato-Signalerfassung.
   HINWEIS: Die Kombination aus zwei Stapeln bietet 3 Kanäle Bilder. Die Bildauflösung und das Scanformat betrugen 512 x 512 Pixel bzw. 157 x 157 x 157 x 157 x 157 x 157 m.

5. Bildverarbeitung und 3D-Rekonstruktion

1. Laden Sie die z-seriellen Bilder in Fidschi-Software¹⁸.
2. Wählen Sie das Plugin Median 3D-Filter in Fidschi, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren.
3. Wählen Sie den Filter Paket unscharfe Maske in Fidschi aus, um die Bilder zu schärfen.
4. Klicken Sie auf"Auto" in Helligkeit/Kontrast, um die Bildqualität automatisch zu optimieren.
5. Speichern Sie die Bilder als Bildsequenzen, um die Z-Seriellbilder exportieren zu können.
6. Laden Sie z-serielle Bilder in kommerzielle Software (z.B. Avizo lite) für die 3D-Rekonstruktion mit Volume-Rendering.
7. In allen MPM-Bildern werden EGFP-, tdTomato- und SHG-Signale in Pseudo-Grün-, Rot- und Cyanfarbe dargestellt.
8. Erfassen Sie 3D-Strukturbilder durch den Snapshot.

Results

Mit dieser Live-Bildgebungsplattform kann die Maus-Augenoberfläche auf zellulärer Ebene visualisiert werden. Um einzelne Einzelzellen in der Augenoberfläche zu visualisieren, verwendeten wir die zwei fluoreszierenden transgenen Mäuse mit EGFP, ausgedrückt im Kern und tdTomato in der Zellmembran. Die kollagenreiche Hornhautstroma wurde durch SHG-Signale hervorgehoben.

In Hornhautepithel wurden oberflächliche Zellen, Flügelzellen und Basalzellen (Abbildung 2) visual...

Discussion

Diese maßgeschneiderte MPM-Bildgebungsplattform mit einer Steuerungssoftware wurde für die intravitale Bildgebung von Mausepithelorganen, einschließlich Haut¹⁰, Haarfollikel¹⁰ und Augenoberfläche^9,10 (Abbildung 1A) verwendet. Das kundenspezifische System wurde seit Beginn unseres Projekts für seine Flexibilität beim Wechsel der optischen Komponenten für verschiedene Experimente eingeset...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AVIZO Lite Software	Thermo Fisher Scientific		Version: 2019.3.0
Bandpassfilter	Semrock	FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40
Dichroitische Spiegel	Semrock	FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36
Galvano	Thorlabs	GVS002
Jade BIO Steuerungssoftware	SouthPort Corporation	Jade BIO
Oxybuprocainhydrochlorid	Sigma	O0270000
PMT	Hamamatsu	H7422A-40
Polyesthylen-Röhre	BECTON DICKINSON	427401
Stereotaktischer Maushalter	Step Technology Co., Ltd	000111
Ti: Saphirlaser	Spectra-Physics	Mai-Tai DeepSee
Upright Microscopy	Olympus	BX51WI
Vidisic Gel	Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH	D13581
Zoletil	Virbac	VR-2831