Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva
May 17th, 2020
Präsentiert wird hier eine mikroskopische Multiphotonen-Plattform für die Live-Maus-Augenoberflächenbildgebung. Fluoreszierende transgene Maus ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen, Zellmembranen, Nervenfasern und Kapillaren innerhalb der Augenoberfläche. Nichtlineare Signale der zweiten harmonischen Generation, die von kollagenen Strukturen abgeleitet werden, bieten eine etikettenfreie Bildgebung für stromale Architekturen.
Dieses Protokoll verwendet ein Multifiltermikroskop zur Live-Bildgebung der gesamten Struktur der Maus-Augenoberfläche im dualen fluoreszierenden transgenen Mausmodell. Die Kombination aus einer benutzerdefinierten mikroskopischen Multiphotonen-Plattform und zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Augenoberfläche und-Struktur. Um das Multiphotonenmikroskop einzurichten, wählen Sie das Wassertauchtsion 20X, 1.00 NA Objektiv und setzen Sie den Titan Sapphire Laser als Anregungsquelle auf einem aufrechten Mikroskop.
Stellen Sie die Laserausgangswellenlänge auf 880 Nanometer für EGFP und 940 Nanometer für tdTomato ein. Schließen Sie zwei dichroitische Spiegel für die Trennung von SHG EGFP und EGFP tdTomato ein und verwenden Sie 434-17, 510-84 und 585-40 Nanometer Bandpassfilter, um die SHG EGFP- und tdTomato-Signale spektral zu trennen. Um den Augenhalter einzurichten, nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflex eisern in einer anästhesierten 8-12 Wochen alten Maus bestätigt haben, legen Sie die Maus auf die beheizte Mikroskopstufe und setzen Sie eine Temperaturüberwachungssonde ein.
Legen Sie die Maus in einen benutzerdefinierten stereotaxic Maushalter und legen Sie Ohrstangen in die externe auditive Fleisch. Verwenden Sie Dreipunktfixierung, um den Kopfhalter zu sichern und eine 0,4%Oxybuprocain-Hydrochlorid- und Salzlösung auf die Augenoberfläche aufzutragen. Bedecken Sie die Spitzen eines Paares von Nummer fünf Dumont Zangen mit der PE-Rohrschleife.
Führen Sie nach drei Minuten eine manuelle Augenlid-Retraktion durch, um den Augapfelvorsprung zu bestätigen, und legen Sie vorsichtig eine PE-Halterrohrschlaufe am Augenlidrand entlang, um die Augenoberfläche freizulegen. Und verwenden Sie den Knopf des Halters, um den Augapfel mit der Zange zu stabilisieren. Bedecken Sie dann die Hornhautoberfläche mit einem Augengel mit einem Brechungsindex von 1,338.
Verwenden Sie für die serielle Z-Bildgebung der Hornhautoberfläche eine Quecksilberlichtquelle, um das Zielfeld abzubilden und die Mikroskopsoftware zu öffnen. Wählen Sie den passenden Fotomultiplikator und die digitalen Gewinne für die Visualisierung der Zellstruktur in der Augenoberfläche aus, und legen Sie die erste und letzte Folie fest, um die Erfassung eines Bildstapels zu ermöglichen. Stellen Sie die Bildauflösung auf 512 x 512 Pixel und der Z-Schritt auf ein Mikrometer ein.
Klicken Sie dann auf Starten, um Z-Serienbilder zu sammeln, die ein Live-Bild mit einer 880-Nanometer-Erregung für die SHG EGFP-Signalsammlung und ein Livebild bei einer 940-Nanometer-Erregung für die EGFP tdTomato-Signalsammlung in jedem Bereich aufnehmen. Verwenden Sie im gesamten Bild den motorisierten Schritthalter, um den Augapfel zu drehen, um eine Bildgebung über die gesamte Hornhautoberfläche zu ermöglichen. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, laden Sie die seriellen Z-Bilder in Fidschi und wählen Sie das Median 3D-Filter-Plugin.
Nachdem Sie das Hintergrundrauschen entfernt haben, wählen Sie das unscharfe Maskenfilterpaket Fidschi aus, um die Bilder zu schärfen, und klicken Sie auf den automatischen Helligkeitskontrast, um die Bildqualität automatisch zu optimieren. Speichern Sie die Bilder nach der Verarbeitung als serielle Bildsequenz und exportieren Sie die Bildsequenz in ein entsprechendes 3D-Rekonstruktionssoftwareprogramm. Präsentieren Sie in allen Multiphotonenmikroskopiebildern die EGFP tdTomato- und SHG-Signale in Pseudogrün, Rot und Cyan, bevor Sie die 3D-Strukturbilder per Snapshot erfassen.
Die Multiphotonenmikroskopie ermöglicht die Visualisierung oberflächlicher Flügel- und Basalzellen im Hornhautepithel von zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen. Einzelne Zellen aus der Basalschicht können der oberflächlichen Schicht zugeordnet werden sowie einzelne sechseckige oberflächliche Zellen. Wie sich aus der zytoplasmatischen Expression des tdTomato-Signals ergibt, ist das membranproteinreiche intrazelluläre vesikuläre System, einschließlich des Golgi-Apparates und endoplasmatisches Retikulum, in den Flügelzellen verstreut.
Innerhalb des kollagenen Stroms werden die stellatenförmigen Korateriten durch die Membran skizziert, die auf EGFP-Leuchtstoffröhren bei diesen Mäusen abzielt. Die in den Collegen stroma eingebetteten Coratesites sind lockerer als innerhalb der Endothelzellen. Darüber hinaus können dünne Verzweigungsnerven innerhalb des Hornhautstroms auch durch Membran-Targeting von tdTomato-Signalen visualisiert werden und horneale Endothelzellmonolayer zeigen eine relativ homogene sechseckige Form, die in einem Wabenmuster verbunden ist.
Das Limbalepithel besteht aus ein bis zwei Schichten epitheliale Zellen. Der doppelfluoreszierende Reporter-Transgenstamm ermöglicht auch die Abbildung von Kapillaren innerhalb der Bindehaut und erleichtert die Rekonstruktion der 3D-Architektur der Kapillaren, die das vaskuläre Endothel umreißt. Die Stabilisierung des Augapfels mit mäßigem Druck ohne Verletzungen ist entscheidend für den Erwerb von qualitativ hochwertigen Bildern, da unzureichender oder übermäßiger Druck die Bildqualität beeinträchtigen kann.
Diese NVivo Bildbildplattform kann zur Visualisierung von Strukturen unter der Augenoberfläche modifiziert und auf In-situ-Studien verschiedener ophthalmologischer Erkrankungen angewendet werden.
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Überblick
Dieser Artikel präsentiert eine multiphotonen mikroskopische Plattform für die Live-Bildgebung der Augenoberfläche von Mäusen unter Verwendung eines dualen fluoreszierenden transgenen Mausmodells. Das System ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung verschiedener zellulärer Strukturen innerhalb der Augenoberfläche.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Ophthalmologie
- Mikroskopie
Hintergrund
- Multiphotonenmikroskopie ist eine leistungsstarke Bildgebungstechnik.
- Fluoreszierende transgene Mäuse ermöglichen eine verbesserte Visualisierung zellulärer Komponenten.
- Das Verständnis der Augenoberflächenstruktur ist entscheidend für verschiedene Forschungsanwendungen.
- Label-freie Bildgebungstechniken können fluoreszierende Methoden ergänzen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode für die Live-Bildgebung der Augenoberfläche von Mäusen.
- Nutzung eines kundenspezifischen Multiphotonenmikroskops für verbesserte Visualisierung.
- Demonstration der Fähigkeiten dualer fluoreszierenden transgener Mäuse in der Bildgebung.
Verwendete Methoden
- Einrichtung eines Multiphotonenmikroskops mit spezifischen Objektiven und Lasereinstellungen.
- Verwendung von dichroitischen Spiegeln und Bandpassfiltern zur Signaltrennung.
- Live-Bildgebung von anästhesierten Mäusen auf einer beheizten Mikroskopbühne.
- Echtzeit-Visualisierung von Augenoberflächenstrukturen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Bildgebung von Zellkernen, Membranen und Nervenfasern.
- Label-freie Bildgebung von Stromaarchitekturen mittels zweiter Harmonischer Generation.
- Demonstration der Wirksamkeit der Multiphotonenplattform.
- Echtzeit-Visualisierungsfähigkeiten wurden validiert.
Schlussfolgerungen
- Die multiphotonen mikroskopische Plattform ist effektiv für die Bildgebung der Augen.
- Duale fluoreszierende transgene Mäuse verbessern die Visualisierung von Augenstrukturen.
- Diese Methode kann die Forschung in der Augenbiologie und verwandten Bereichen voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This multiphoton microscopy platform enables live, label-free imaging of mouse ocular surface structures, providing critical insights into corneal and conjunctival biology for ophthalmic drug discovery. By visualizing cellular dynamics, stromal architecture, and vascular networks in vivo, the method supports mechanistic de-risking of therapeutic targets in preclinical models of ocular disease. The platform’s ability to image across the entire ocular surface with accurate positioning enhances predictive confidence in target validation and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing cell nuclei, membranes, nerve fibers, and capillaries in live ocular tissue.
- Operational Value: Supports functional target validation through real-time observation of stromal architecture via second harmonic generation and cellular dynamics in dual fluorescent reporters.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts of structural and cellular changes in disease-relevant ocular models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling high-resolution imaging of epithelial, stromal, endothelial, and vascular compartments.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise Z-stack acquisition, spectral separation of SHG and fluorescent signals, and stabilized eyeball positioning.
- Strategic Value: Highlights screening readiness and platform reuse by allowing imaging across the entire corneal and conjunctival surface with minimal phototoxicity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by enabling reconstruction of 3D capillary architecture in the conjunctiva and visualization of limbal epithelial layers.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by supporting intravital imaging with accurate positioning across ocular surface regions.
- Predictive Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing label-free stromal imaging and cellular mapping that inform mechanistic understanding of ocular pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical imaging, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in ophthalmic research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking by enabling live imaging of cellular and structural dynamics in the ocular surface.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through Z-serial imaging, spectral signal separation, and stabilized imaging conditions.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including SHG for collagen architecture and tdTomato/EGFP for membrane and nuclear localization.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment by enabling 3D reconstruction of capillaries and epithelial layer mapping in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable to various ophthalmic disease models and imaging endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in ocular surface biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through customized eye holder, stereotaxic staging, and controlled imaging parameters.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early visualization of target engagement and tissue response.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions through quantitative, label-free, and fluorescent readouts across corneal and conjunctival compartments.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in multiphoton microscopy, ocular anatomy, and transgenic model handling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including titanium sapphire laser, dichroic mirrors, band pass filters, motorized stage, and 3D reconstruction software.
- Cross-team standardization requirements for imaging protocols, signal detection settings, and image processing pipelines (e.g., Fiji plugins for noise reduction and contrast enhancement).
- Adaptation considerations across model systems, including adjustment of eyelid stabilization, ocular surface coupling gel, and excitation wavelengths for different fluorescent reporters.
- Practical limitations supported by source material: stabilizing the eyeball with moderate pressure without injury is critical, as insufficient or excessive pressure compromises image quality.
