Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva
17. Mai 2020
Präsentiert wird hier eine mikroskopische Multiphotonen-Plattform für die Live-Maus-Augenoberflächenbildgebung. Fluoreszierende transgene Maus ermöglicht die Visualisierung von Zellkernen, Zellmembranen, Nervenfasern und Kapillaren innerhalb der Augenoberfläche. Nichtlineare Signale der zweiten harmonischen Generation, die von kollagenen Strukturen abgeleitet werden, bieten eine etikettenfreie Bildgebung für stromale Architekturen.
Dieses Protokoll verwendet ein Multifiltermikroskop zur Live-Bildgebung der gesamten Struktur der Maus-Augenoberfläche im dualen fluoreszierenden transgenen Mausmodell. Die Kombination aus einer benutzerdefinierten mikroskopischen Multiphotonen-Plattform und zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Augenoberfläche und-Struktur. Um das Multiphotonenmikroskop einzurichten, wählen Sie das Wassertauchtsion 20X, 1.00 NA Objektiv und setzen Sie den Titan Sapphire Laser als Anregungsquelle auf einem aufrechten Mikroskop.
Stellen Sie die Laserausgangswellenlänge auf 880 Nanometer für EGFP und 940 Nanometer für tdTomato ein. Schließen Sie zwei dichroitische Spiegel für die Trennung von SHG EGFP und EGFP tdTomato ein und verwenden Sie 434-17, 510-84 und 585-40 Nanometer Bandpassfilter, um die SHG EGFP- und tdTomato-Signale spektral zu trennen. Um den Augenhalter einzurichten, nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflex eisern in einer anästhesierten 8-12 Wochen alten Maus bestätigt haben, legen Sie die Maus auf die beheizte Mikroskopstufe und setzen Sie eine Temperaturüberwachungssonde ein.
Legen Sie die Maus in einen benutzerdefinierten stereotaxic Maushalter und legen Sie Ohrstangen in die externe auditive Fleisch. Verwenden Sie Dreipunktfixierung, um den Kopfhalter zu sichern und eine 0,4%Oxybuprocain-Hydrochlorid- und Salzlösung auf die Augenoberfläche aufzutragen. Bedecken Sie die Spitzen eines Paares von Nummer fünf Dumont Zangen mit der PE-Rohrschleife.
Führen Sie nach drei Minuten eine manuelle Augenlid-Retraktion durch, um den Augapfelvorsprung zu bestätigen, und legen Sie vorsichtig eine PE-Halterrohrschlaufe am Augenlidrand entlang, um die Augenoberfläche freizulegen. Und verwenden Sie den Knopf des Halters, um den Augapfel mit der Zange zu stabilisieren. Bedecken Sie dann die Hornhautoberfläche mit einem Augengel mit einem Brechungsindex von 1,338.
Verwenden Sie für die serielle Z-Bildgebung der Hornhautoberfläche eine Quecksilberlichtquelle, um das Zielfeld abzubilden und die Mikroskopsoftware zu öffnen. Wählen Sie den passenden Fotomultiplikator und die digitalen Gewinne für die Visualisierung der Zellstruktur in der Augenoberfläche aus, und legen Sie die erste und letzte Folie fest, um die Erfassung eines Bildstapels zu ermöglichen. Stellen Sie die Bildauflösung auf 512 x 512 Pixel und der Z-Schritt auf ein Mikrometer ein.
Klicken Sie dann auf Starten, um Z-Serienbilder zu sammeln, die ein Live-Bild mit einer 880-Nanometer-Erregung für die SHG EGFP-Signalsammlung und ein Livebild bei einer 940-Nanometer-Erregung für die EGFP tdTomato-Signalsammlung in jedem Bereich aufnehmen. Verwenden Sie im gesamten Bild den motorisierten Schritthalter, um den Augapfel zu drehen, um eine Bildgebung über die gesamte Hornhautoberfläche zu ermöglichen. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, laden Sie die seriellen Z-Bilder in Fidschi und wählen Sie das Median 3D-Filter-Plugin.
Nachdem Sie das Hintergrundrauschen entfernt haben, wählen Sie das unscharfe Maskenfilterpaket Fidschi aus, um die Bilder zu schärfen, und klicken Sie auf den automatischen Helligkeitskontrast, um die Bildqualität automatisch zu optimieren. Speichern Sie die Bilder nach der Verarbeitung als serielle Bildsequenz und exportieren Sie die Bildsequenz in ein entsprechendes 3D-Rekonstruktionssoftwareprogramm. Präsentieren Sie in allen Multiphotonenmikroskopiebildern die EGFP tdTomato- und SHG-Signale in Pseudogrün, Rot und Cyan, bevor Sie die 3D-Strukturbilder per Snapshot erfassen.
Die Multiphotonenmikroskopie ermöglicht die Visualisierung oberflächlicher Flügel- und Basalzellen im Hornhautepithel von zwei fluoreszierenden transgenen Mäusen. Einzelne Zellen aus der Basalschicht können der oberflächlichen Schicht zugeordnet werden sowie einzelne sechseckige oberflächliche Zellen. Wie sich aus der zytoplasmatischen Expression des tdTomato-Signals ergibt, ist das membranproteinreiche intrazelluläre vesikuläre System, einschließlich des Golgi-Apparates und endoplasmatisches Retikulum, in den Flügelzellen verstreut.
Innerhalb des kollagenen Stroms werden die stellatenförmigen Korateriten durch die Membran skizziert, die auf EGFP-Leuchtstoffröhren bei diesen Mäusen abzielt. Die in den Collegen stroma eingebetteten Coratesites sind lockerer als innerhalb der Endothelzellen. Darüber hinaus können dünne Verzweigungsnerven innerhalb des Hornhautstroms auch durch Membran-Targeting von tdTomato-Signalen visualisiert werden und horneale Endothelzellmonolayer zeigen eine relativ homogene sechseckige Form, die in einem Wabenmuster verbunden ist.
Das Limbalepithel besteht aus ein bis zwei Schichten epitheliale Zellen. Der doppelfluoreszierende Reporter-Transgenstamm ermöglicht auch die Abbildung von Kapillaren innerhalb der Bindehaut und erleichtert die Rekonstruktion der 3D-Architektur der Kapillaren, die das vaskuläre Endothel umreißt. Die Stabilisierung des Augapfels mit mäßigem Druck ohne Verletzungen ist entscheidend für den Erwerb von qualitativ hochwertigen Bildern, da unzureichender oder übermäßiger Druck die Bildqualität beeinträchtigen kann.
Diese NVivo Bildbildplattform kann zur Visualisierung von Strukturen unter der Augenoberfläche modifiziert und auf In-situ-Studien verschiedener ophthalmologischer Erkrankungen angewendet werden.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Multiphotonen-mikroskopische Plattform zur Live-Bildgebung der okularen Oberfläche der Maus unter Verwendung eines dualen fluoreszenten transgenen Mausmodells vorgestellt. Das System ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung verschiedener zellulärer Strukturen innerhalb der okularen Oberfläche.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaft
- Augenheilkunde
- Mikroskopie
Hintergrund
- Die Multiphotonenmikroskopie ist eine leistungsstarke Bildgebungstechnik.
- Fluoreszierende transgene Mäuse ermöglichen eine verbesserte Visualisierung zellulärer Strukturen.
- Das Verständnis der okularen Oberflächenstruktur ist entscheidend für verschiedene Forschungsanwendungen.
- Markierungsfreie Bildgebungsverfahren können fluoreszierende Methoden ergänzen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Live-Bildgebung der okularen Oberfläche der Maus.
- Nutzung eines speziell angefertigten Multiphotonen-Mikroskops zur verbesserten Visualisierung.
- Aufzeigen der Möglichkeiten doppelt fluoreszenter transgener Mäuse in der Bildgebung.
Verwendete Methoden
- Aufbau eines Multiphotonen-Mikroskops mit spezifischen Objektiven und Laser-Einstellungen.
- Verwendung von dichroitischen Spiegeln und Bandpassfiltern zur Signaltrennung.
- Live-Bildgebung von anästhesierten Mäusen auf einer beheizten Mikroskopbühne.
- Echtzeit-Visualisierung der okularen Oberflächenstrukturen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Abbildung von Zellkernen, Membranen und Nervenfasern.
- Markierungsfreie Darstellung von stromalen Architekturen mittels zweiter Harmonischer Erzeugung.
- Nachweis der Wirksamkeit der Multiphotonen-Plattform.
- Die Echtzeit-Visualisierungsfähigkeiten wurden validiert.
Schlussfolgerungen
- Die Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform eignet sich effektiv für die bildgebende Untersuchung des Auges.
- Duale fluoreszierende transgene Mäuse verbessern die Visualisierung okularer Strukturen.
- Diese Methode kann die Forschung in der Okularbiologie und verwandten Gebieten voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform ermöglicht lebende, markierungsfreie Abbildungen der okularen Oberflächenstrukturen der Maus und liefert entscheidende Einblicke in die Hornhaut- und Konjunktivalbiologie für die entdeckungsbasierte Entwicklung ophthalmologischer Wirkstoffe. Durch die Visualisierung zellulärer Dynamiken, des stromalen Aufbaus und der vaskulären Netzwerke in vivo unterstützt die Methode die mechanistische Risikominimierung therapeutischer Zielstrukturen in präklinischen Modellen okularer Erkrankungen. Die Fähigkeit der Plattform, die gesamte okulare Oberfläche mit genauer Positionierung abzubilden, erhöht das Vorhersagevertrauen in der Zielstrukturvalidierung und in der Entwicklung von Testverfahren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung von Zellkernen, Membranen, Nervenfasern und Kapillaren in lebendem okularem Gewebe.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch Echtzeitbeobachtung der stromalen Architektur mittels zweiter harmonischer Generierung und zellulärer Dynamik in dualen fluoreszierenden Reportern.
- Prädiktiver Wert: Verbessert die Portfolio-Priorisierung durch quantitative, reproduzierbare Messgrößen struktureller und zellulärer Veränderungen in krankheitsrelevanten okularen Modellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem hochauflösende Abbildungen der epithelialen, stromalen, endothelialen und vaskulären Kompartimente ermöglicht werden.
- Operationaler Wert: Trägt durch präzise Z-Stapel-Aufnahme, spektrale Trennung von SHG- und Fluoreszenzsignalen sowie stabilisierte Augapfelpositionierung zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei.
- Strategischer Wert: Unterstreicht die Eignung für die Bildgebung im Hochdurchsatzscreening und die Wiederverwendbarkeit der Plattform, da eine Abbildung über die gesamte Hornhaut- und Bindehautfläche bei minimaler Phototoxizität ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem die Rekonstruktion der dreidimensionalen Kapillararchitektur in der Bindehaut und die Visualisierung der limbalen Epithelschichten ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die intravitale Bildgebung mit genauer Positionierung über verschiedene Bereiche der Augenoberfläche unterstützt wird.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem markierungsfreie Bildgebung des Stroma und zelluläre Kartierung bereitgestellt werden, die zum mechanistischen Verständnis okulärer Pathologien beitragen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in die Entdeckungskette von der frühen Target-Validierung bis hin zur präklinischen Bildgebung und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die mechanistische Ent-Risikobewertung in der Augenforschung.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die Methode Hypothesentests, die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Risikominimierung unterstützt, indem sie die Live-Bildgebung zellulärer und struktureller Dynamiken auf der okularen Oberfläche ermöglicht.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays, seine Reproduzierbarkeit und quantitative Ausgabe mithilfe von Z-Serielle-Bildgebung, spektraler Signalentmischung und stabilisierten Bildgebungsbedingungen.
- Analytik: Betont Messungen, Nachweise oder statistische Ergebnisse, die Teams bei der Vergleichbarkeit von Bedingungen unterstützen, einschließlich SHG für die Kollagenarchitektur sowie tdTomato/EGFP für die Membran- und Kernlokalisation.
- Translationale Forschung: Verknüpft die Methode mit präklinischer Kontinuität oder Biomarkerabstimmung, indem sie die 3D-Rekonstruktion von Kapillaren und die Kartierung der Epithelschicht in krankheitsrelevanten Modellen ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, anstatt als Einmaltechnik, und betont ihre Anpassungsfähigkeit an verschiedene ophthalmologische Krankheitsmodelle und Bildgebungs-Endpunkte.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Unschärfen in der Biologie der Augenoberfläche.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch einen maßgeschneiderten Augenhalter, stereotaktische Positionierung und kontrollierte Bildgebungsparameter.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirtschaftlichkeit und geringeres biologisches Risiko in späteren Stadien durch frühzeitige Visualisierung der Zielinteraktion und des Gewebereaktionen.
- Portfolio-Implikationen: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen anhand quantitativer, markerfreier und fluoreszenter Messgrößen in Hornhaut- und Bindehautkompartimenten.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Expertise in der Multiphotonenmikroskopie, der okularen Anatomie und dem Umgang mit transgenen Modellen.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Titan-Saphir-Laser, dichroischer Spiegel, Bandpassfilter, motorisierter Probentisch und Software für 3D-Rekonstruktion.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich Bildgebungsprotokolle, Signalerfassungseinstellungen und Bildverarbeitungspipelines (z. B. Fiji-Plugins zur Rauschunterdrückung und Kontrastverbesserung).
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, einschließlich Justierung der Augenlidfixierung, des Kopplungsgels auf der Okularoberfläche und der Anregungswellenlängen für unterschiedliche fluoreszierende Reporter.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind: Die Stabilisierung des Augapfels mit mäßigem Druck ohne Verletzung ist entscheidend, da unzureichender oder übermäßiger Druck die Bildqualität beeinträchtigt.
