Durchführen von colonoscopic-Guided Pinch Biopsien bei Mäusen und Bewertung nachfolgender Gewebeveränderungen

Zusammenfassung

Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens zur Induzieren von kolonoskopisch geführten Pinch-Biopsien bei Mäusen und verfolgen Denkwunden in Echtzeit. Zusätzlich werden Methoden zur Herstellung von Geweben für histologische, immunhistochemische und molekulare Analysen des Wundbettes bereitgestellt.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Gewebe- und Zellveränderungen, die sowohl bei der akuten Verletzungsreaktion als auch während des Wundheilungsprozesses auftreten, ist von größter Bedeutung bei der Untersuchung von Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes (GI). Das murine Kolosonnenbiopsiemodell ist ein nützliches Werkzeug, um diese Prozesse zu definieren. Zusätzlich kann das Zusammenspiel zwischen Darm-Luminal-Gehalt (z.B. Mikroben) und dem Dickdarm untersucht werden. Die Wundinduktion und die Fähigkeit, den Wundverschluss im Laufe der Zeit zuverlässig zu verfolgen, können jedoch eine Herausforderung darstellen. Darüber hinaus muss die Gewebevorbereitung und -orientierung standardisiert erfolgen, um histologische und molekulare Veränderungen optimal abzuhören. Hier stellen wir eine detaillierte Methode vor, die biopsieinduzierte Verletzungen und die Überwachung des Wundverschlusses durch wiederholte Koloskopien beschreibt. Es wird ein Ansatz beschrieben, der konsistente und reproduzierbare Messungen der Wundgröße, die Fähigkeit, das Wundbett für molekulare Analysen zu sammeln sowie das Wundbett beim Schnitt von Geweben zu visualisieren, sicherstellt. Die Fähigkeit, diese Techniken erfolgreich durchzuführen, ermöglicht Studien über die akute Verletzungsreaktion, Wundheilung und Luminal-Host-Wechselwirkungen innerhalb des Dickdarms.

Einleitung

Der Magen-Darm-Trakt (GI) ist ein komplexes Organsystem mit seinen vielfältigen Funktionen, Wirtszelltypen (z.B. Epithel, Immun, Stromal, etc.) sowie Billionen von Mikroben. Angesichts dieser Komplexität beinhalten Krankheiten des GI-Traktes oft das Zusammenspiel all dieser Faktoren. Zum Beispiel, entzündliche Darmerkrankungen (IBD) sind mit Zyklen der Entzündung und Remission im GI-Trakt verbunden, mit der Aktivierung von entzündlichen Zellen, Dysbiose, und epitheliale Reparatur^{1,2,3,4,5,6,7}. Geeignete Modellsysteme zur Untersuchung von IBD und anderen entzündlichen Erkrankungen des GI-Traktes ist entscheidend für die Aufklärung der Pathogenese von Krankheiten. Es gibt mehrere Modelle zur Untersuchung der IBD-Pathogenese, einschließlich gentechnisch veränderter Mäuse und der Verwendung von Chemikalien wie Dextran-Natriumsulfat (DSS) bei Nagetieren^8,9,10. Zu den Einschränkungen dieser Modelle gehören die Unfähigkeit, die Induktion von Entzündungen genau zu kontrollieren, sowie Schwierigkeiten bei der Beurteilung der Wundheilung. Alternative Methoden zur Nachahmung von Aspekten der IBD-Pathogenese könnten sich als nützlich für die Entwicklung von Therapien erweisen.

Kolonoskopisch geführte Pinch-Biopsien bei Mäusen bieten ein nützliches Modellsystem, um die Pathogenese der Entzündungsreaktion, Wundheilung sowie Wirt-Mikroben-Wechselwirkungen im Dickdarm zu untersuchen. Dieser Ansatz wurde erstmals als experimentelles Werkzeug im Jahr 2009 verwendet, das seine Nützlichkeit für die Untersuchung der akuten Entzündungsreaktion und Wundheilung im Darm¹¹demonstrierte. Nachfolgende Studien nutzten diese Technik, um die Rollen der verschiedenen Signalwege sowie der Darmmikrobiota, in der Darmwundheilung^{11,12,13,14,15,16,17,18}. In jüngerer Zeit nutzte unsere Gruppe dieses Modell, um die Bedeutung von Sphingosin-1-Phosphat-Signalisierung und Bakterien in der akuten Reaktion auf Darmverletzungen zu untersuchen¹⁹. Obwohl nützlich, kann die Durchführung von kolonoskopisch geführten Pinch-Biopsien bei Mäusen und die Bewertung nachfolgender Gewebeveränderungen technisch eine Herausforderung darstellen. Zum Beispiel kann die Perforation des Darms bei der Induktion von Verletzungen auftreten und die Sicherstellung konsistenter Messungen des Wundbettes durch serielle Koloskopien kann schwierig sein. Darüber hinaus kann es schwierig sein, das Kolosgewebe richtig zu orientieren, um das Wundbett für histologische oder immunhistochemische Analysen zu visualisieren. Obwohl einige Informationen über diese Methoden existieren^18,20, eine präzise schrittweise Beschreibung dieser Techniken entlang wird visuelle Hilfsmittel verspricht, die Zuverlässigkeit und breiteren Nutzen dieses Modells zu verbessern. Hier stellen wir eine detaillierte Methode zur Durchführung von kolonoskopisch geführten Pinch-Biopsien bei Mäusen vor, verfolgen den Wundverschluss im Laufe der Zeit und bereiten das Gewebe so vor, dass histologische und molekulare Analysen des Wundbettes möglich sind. Die Erstellung einer Standardmethode zur Durchführung dieser Techniken kann die Verwendung dieses Modells erweitern, um zuvor nicht untersuchte Mediatoren zu untersuchen, die potenziell wichtig für GI-Entzündungen und Wundreparaturen sind.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Weill Cornell Medicine genehmigt." Zu: "Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der Weill Cornell Medicine und der Stony Brook University genehmigt.

1. Koloskopie und Wundinduktion

1. Montieren Sie die Komponenten des Endoskops vor, indem Sie zunächst das 1,9 mm lange Endoskop in den Mantel einsetzen (Abbildung 1A-B). Befestigen Sie die Luftpumpe (um eine Koloninsufflation zu gewährleisten) mit dem mitgelieferten Schlauch an das Gasventil auf der linken Seite des Mantels neben dem Arbeitskanal(Abbildung 1C).
   HINWEIS: Obwohl die hier beschriebene Linse 0° ist, kann auch eine 30°-Linse für diesen Zweck verwendet werden.
2. Stellen Sie sicher, dass sich der Arbeitskanal in der offenen Position befindet, und setzen Sie 3 Fr-Biopsiezangen durch den Arbeitskanal ein und leiten Sie ihn bis zum Ende des Mantels (wobei sichergestellt wird, dass er nicht aus dem Mantel herausragt) (Abbildung 1C). Befestigen Sie das montierte Endoskop gemäß den Anweisungen des Herstellers an der Lichtquelle und dem Videobildgerät.
3. Anästhesisieren Sie die Maus mit 5% Isofluran mit Sauerstoff in einer Induktionskammer. Dann bewegen Sie die Maus zu einer endoskopischen Staging-Plattform, die ein Heizsystem (zur Vorbeugung von Unterkühlung) auf seiner ventralen Seite enthält und unter Anästhesie mit einem Nasenkegel mit 2% Isofluran mit Sauerstoff pflegen. Fügen Sie den Augen eine Tierarztsalbe hinzu, um Trockenheit unter Anästhesie zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig beästhetisiert ist, indem Sie den hinteren Fuß vorsichtig kneifen, um auf einen Reflex zu testen.
   HINWEIS: Jede Sorte oder jedes Geschlecht von Mäusen kann mit dieser Technik verwendet werden; Es ist jedoch vorzuziehen, dass Mäuse mindestens 8 Wochen alt sind, so dass sie groß genug für das Verfahren sind.
   1. Fügen Sie den Augen eine Tierarztsalbe hinzu, um Trockenheit unter Anästhesie zu verhindern.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig beästhetisiert ist, indem Sie den hinteren Fuß vorsichtig kneifen, um auf einen Reflex zu testen.
4. Füllen Sie eine 3 ml Spritze mit einer angebrachten Rattengavagenadel mit Raumtemperatur Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Fügen Sie die Nadel ca. 1 cm in den Anus der Maus ein und infundieren Sie PBS vorsichtig, um Fäkalienmaterial zu löschen. Mehrere Fäkalienpellets sollten die Maus zusammen mit dem PBS verlassen, das infundiert wurde.
   HINWEIS: Die Instillation eines übermäßigen PBS-Volumens kann zu Schaumbildung im Lumen führen, die die Sicht des Lumens verschleiern könnte.
5. Setzen Sie das montierte Endoskop 0,5 cm in den Anus der Maus ein. Fördern Sie die Biopsieinzange in das Lumen des Rektums, bis die vollen "Kiefer" (einschließlich Scharnier) der Zange über das Ende des Mantels hinausgehen (wie auf dem Videomonitor beobachtet) (Ergänzendes Video 1). Drehen Sie die Zange um 90°, so dass sich die Backen in Ost-West-Ausrichtung öffnen (Zusatzvideo 1).
6. Zur Biopsie, öffnen Sie die Zange und bewegen Sie ca. 1 cm, schließen Sie die Zange und in einer glatten Bewegung schnell zurückziehen auf die Zange, während sie geschlossen lassen (Ergänzendes Video 1).
   1. Vermeiden Sie eine vollständige Aufblähung des Dickdarms bei der Durchführung der Biopsie. Lassen Sie daher die rechte Seite des Gasventils während dieses Schritts offen; obwohl es beachten sollte, dass beim Öffnen der Zange die Gefahr besteht, die Schleimhaut zu beschädigen, wenn sich der Dickdarm in dieser Position befindet.

2. Visualisierung und Messung des Wundbettes

1. Initiieren Sie die Videoaufzeichnung unmittelbar nach der Biopsie, indem Sie das am Kolonoskop angeschlossene Fußpedal drücken. Den Dickdarm vollständig insuffieren, indem man einen Zeigefinger fest gegen die rechte Seite des Gasventils drückt, um die Öffnung vollständig zu bedecken, um die Luft in das Endoskop und damit in den Dickdarm zu zwingen.
   HINWEIS: Obwohl dieses Protokoll den Einsatz einer Luftpumpe beschreibt, in der der Luftstrom manuell gesteuert wird, kann auch eine peristaltische Pumpe mit einer kontrollierten Luftzufuhr verwendet werden.
2. Fördern Sie die Zange zurück aus dem Mantel und in das rektale Lumen, während sie sich in der geschlossenen Position befinden (Zusatzvideo 1). Legen Sie die Zange direkt über der Wunde gegen die rektale Wand, bis die Basis der Backen am oberen Rand des Sichtfeldes ausgerichtet ist (Abbildung 2 & Ergänzendes Video 1). Setzen Sie die vollständige Insufflatierung des Dickdarms fort, bis eine klare Sicht auf die Wunde beobachtet werden kann.
   HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, die Zange weit genug zu verlängern, um nur die Kiefer der Zange bis zur Basis für jede untersuchte Maus zu offenbaren, um einen konsistenten Abstand zwischen der Linse des Endoskops und der Läsion zu gewährleisten (Abbildung 2,weißer Pfeil).
3. Wenn Sie am selben Tag Biopsien an mehreren Mäusen durchführen, entfernen Sie das biopsied Gewebe der vorherigen Maus aus der Zange (mit der mitgelieferten Reinigungsbürste) und wischen Sie die Linsenhülle mit 70 % Ethanol ab, um sie zu reinigen, bevor Sie eine Wunde in der nächsten Maus induzieren.
   HINWEIS: Obwohl dieses Protokoll die Durchführung einer einzigen Biopsie pro Maus beschreibt, können mehrere Biopsien an einer einzigen Maus durchgeführt werden, vorausgesetzt, das Gewebe, das aus der vorherigen Biopsie entnommen wurde, wird aus der Zange entfernt, um sicherzustellen, dass eine vollständige Biopsie auf nachfolgenden Biopsien durchgeführt werden kann.
4. Legen Sie die Maus in einen Käfig, der von anderen Mäusen und auf einem Handtuch leer ist, bis sie sich nach Abschluss des Eingriffs von der Anästhesie erholt. Überwachen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie sich von der Anästhesie erholt, wie durch Wiederherstellung der Aktivität angegeben.
   HINWEIS: Zwei Personen sind verpflichtet, die Wunde zu induzieren und das Wundbett am Tag 0 zu visualisieren (eine, die das Endoskop und die andere die Biopsiezange bedient), aber nur eine Person wird benötigt, um Wunden an den folgenden Tagen zu visualisieren (wie unten beschrieben).
5. Befolgen Sie das gleiche Verfahren zur Vorbereitung der Maus und der Koloskopie für nachfolgende Wundmessungen (in der Regel die Tage 2, 4 und 6 nach der Biopsie), wie oben in den Abschnitten 1.1-1.4 beschrieben, mit Ausnahme der Induktion der Wunde.
6. Suchen Sie das Wundbett auf dem Videomonitor zu diesen Zeitpunkten nach dem Einsetzen des Endoskops, und bringen Sie die Biopsiezangen (in geschlossener Position) auf das Wundbett vor, insuffieren Sie den Dickdarm und initiieren Sie videoaufnahmen, wie in den Abschnitten 2.1 und 2.2 beschrieben (Abbildung 2).
   HINWEIS: Es kann schwierig sein, das Wundbett mehr als 6 Tage nach der Biopsie zu lokalisieren.
7. Bringen Sie die Zange an diesen folgenden Tagen in die gleiche Entfernung wie am Tag 0, um einen konsistenten Abstand zwischen der Linse des Endoskops und der Läsion über Tage hinweg zu gewährleisten. Die Sicherstellung eines konsistenten Abstands zwischen Linse und Läsion erhöht die Genauigkeit der Messungen im Laufe der Zeit.
   HINWEIS: Eine Person kann an diesen Tagen Messungen durchführen (Endoskop wird mit der rechten Hand betrieben und die Biopsiezangen werden mit der linken Hand vorgerückt).
8. Sobald alle Messungen abgeschlossen sind, öffnen Sie die Videoaufzeichnungen der seriellen Koloskopien in der Videobearbeitungssoftware, die die Erstellung von Standbildern aus Video ermöglicht.
9. Fördern Sie das Video zu einem Rahmen, der einen Zeitpunkt zeigt, an dem das Wundbett leicht visualisiert werden kann, die geschlossenen Zangen über dem Wundbett und gegen die Rektalwand und die Wand straff ist. Machen Sie eine Momentaufnahme dieses Rahmens und kodieren Sie den Dateinamen, um sicherzustellen, dass die Messungen der Wundbetten in einer blinden Weise durchgeführt werden.
10. Öffnen Sie die Bilder mit codierten Dateinamen in NIH ImageJ, um die Größe des Wundbettes zu quantifizieren. Wählen Sie auf der Registerkarte Analysieren die Option Messungen festlegen aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bereich.
    1. Wählen Sie das Werkzeug Freihandauswahl aus der Hauptmenüleiste aus, und zeichnen Sie einen Umfang um die Wunde (siehe Abbildung 2). Wählen Sie unter der Registerkarte Analysieren die Option Messen aus, und der Wert dieser Messung wird automatisch im Fenster Ergebnisse angezeigt.
11. Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Kalkulationstabelle, nachdem Sie die Messungen für alle Bilder abgeschlossen haben, indem Sie unter der Registerkarte Datei im Fenster Ergebnisse die Option Speichern unter auswählen und die Erweiterung in eine Tabellenkalkulationsdatei ändern.
12. Berechnen Sie die Größe der Wunde an Tagen nach der Induktion der Wunde (d. h. tage 2, 4 und 6) relativ zur Größe am Tag 0 (unmittelbar nach der Verwundung) in einer Tabelle. Erreichen Sie dies, indem Sie die Größe der Wunde an jedem Tag durch die Größe der Wunde am Tag 0 dividieren und diesen Wert in einen Prozentsatz umwandeln.
    ANMERKUNG: Unter normalen Bedingungen mit dieser Methode der kolonoskopischen Betrachtung wird der größte Verschluss der Wunde nach den ersten 2 Tagen beobachtet (75 % Verkleinerung der Größe) mit einem allmählicheren Verschluss an den Tagen 4 und 6 (80 % bzw. 95 % Verkleinerung der Größe).

3. Sammlung des Wundbettes für die molekulare Analyse

1. Euthanisieren Sie die Maus mit CO2-Erstickung, gefolgt von zervikalen Dislokationen (oder gleichwertiger Technik) am ausgewählten Tag nach der Biopsie.
2. Ernten Sie den distalen Bereich des Dickdarms, indem Sie die Haut und den Bauchmuskel öffnen, um die Körperhöhle freizulegen. Legen Sie geschlossene Scheren unter den Doppelpunkt und heben Sie sie vorsichtig aus dem zugrunde liegenden Mesentery und schneiden Sie dann den Doppelpunkt an seinem Mittelpunkt und am Anus, um ihn von der Maus zu entfernen.
3. Spülen Sie den Fäkaliengehalt mit einer Rattengavagenadel, die an einer 20 ml Spritze befestigt ist, die mit eiskaltem 1x PBS gefüllt ist, und legen Sie dann den Dickdarm auf Filterpapier.
4. Den Doppelpunkt längs auf Filterpapier schneiden, um sicherzustellen, dass die mesenterische Seite mit dem Gesicht nach unten gegen das Filterpapier gerichtet ist. 0,2% Methylenblau auf die Schleimhaut mit einer Squeeze Pipette auftragen, während sich das Gewebe noch auf dem Filterpapier befindet, und dann überschüssiges Methylenblau abtropfen lassen. Sehen Sie sich den Doppelpunkt unter einem Sezieren des Mikroskops an und lokalisieren Sie das Wundbett (Abbildung 3A).
5. Mit 4 Zoll Mikro-Iris-Schere, um den Rand des Wundbettes geschnitten(Abbildung 3A, gestrichelten Kreis) achten darauf, nicht in die Muskelschicht zu schneiden (es sei denn, der Muskel ist gewünscht) und übertragen Sie das sezierte Wundbett auf ein Rohr mit Feiner Punkt Pinzette für Snap-Freezing oder gewünschte Lagerung methode.
   HINWEIS: Die auf diese Weise gesammelte Gewebemenge reicht aus, um RNA für RNA-seq oder eine gleichwertige Analyse zu extrahieren.

4. Vorbereitung von Gewebe für die histologische Analyse

1. Euthanisieren Sie die Maus und ernten Sie den Doppelpunkt, wie in Schritt 3.1-3.2 beschrieben.
2. Den Doppelpunkt längs auf Filterpapier schneiden, um sicherzustellen, dass die mesenterische Seite mit dem Gesicht nach unten gegen das Filterpapier gerichtet ist. 4% Paraformaldehyd (oder Fixiermittel nach Wahl) vorsichtig mit einer Squeeze Pipette auftragen und das Gewebe mit Parafilm bedecken. Lassen Sie flach in einem versiegelten Behälter für 4-6 Stunden.
3. Gewebe zur Lagerung auf 70% Ethanol übertragen. Wenn Sie bereit sind, das Gewebe zu verarbeiten, entfernen Sie Parafilm und tragen Sie 0,2% Methylenblau auf die Schleimhaut auf, indem Sie eine Quetschungspipette verwenden, während sich das Gewebe noch auf Filterpapier befindet. Dann überschüssiges Methylenblau abtropfen lassen.
4. Sehen Sie sich den Doppelpunkt unter einem Sezieren des Mikroskops an und lokalisieren Sie das Wundbett (Abbildung 3A). Mit einem Skalpell mit einer #10 Klinge, schneiden Sie direkt durch die Mitte des Wundbettes und weiter schneiden durch den Rest des Dickdarms in einer geraden Linie, so dass der Doppelpunkt in der Hälfte geschnitten wurde, längenmäßig(Abbildung 3A,schwarze Linie).
5. Verarbeiten Sie den Dickdarm und dann Paraffin einbetten (entweder eine oder beide Seiten, die nach dem Schneiden bleiben), so dass die Seite, die durch das Skalpell geschnitten wurde (die Seite, die die Mitte des Wundbettes vor dem Bisektion war) ist nach unten in der Paraffin. Fahren Sie mit Schnittprofilen und Färbung für gewünschte Flecken oder Hersteller fort.
6. Wenn für eine bestimmte Färbung Kryosections erforderlich sind, ernten Sie den Dickpunkt wie in Schritt 3.1 beschrieben und öffnen Sie längs auf Filterpapier, um sicherzustellen, dass die mesenterische Seite mit dem Gesicht nach unten gegen das Filterpapier gerichtet ist.
7. Bisect das Wundbett innerhalb des frisch geernteten Dickdarms, wie in Schritt 4.5 beschrieben und den Dickdarm (entweder eine oder beide Seiten, die nach dem Schneiden übrig bleiben) so einbetten, dass die Seite, die vom Skalpell geschnitten wurde, in einer Basisform, die halb mit Gewebegefriermedium gefüllt ist, nach unten gerichtet ist.
8. Sichern Sie das Gewebe an Ort und Stelle mit feiner Pinzette und legen Sie die Basisform auf eine Metallplatte auf trockenem Eis, um das Gefriermedium zu härten. Sobald der untere Teil des Mediums eingefroren ist (und das Gewebe an Ort und Stelle gehalten wird), lassen Sie das Gewebe los und füllen Sie das restliche Volumen der Basisform mit Gefriermedium und legen Sie wieder auf Trockeneis.
   1. Nachdem das gesamte Volumen des Gefriermediums eingefroren ist, in einen -80 °C-Gefrierschrank bis zum Schnitt überführen.
9. Für Paraffin- oder gefrorene Abschnitte zusätzliche Abschnitte von H&E schneiden und färben, um sicherzustellen, dass das Wundbett auf dem Abschnitt eingefangen wurde, bevor Sie mit der studienspezifischen Färbung fortfahren. Abbildung 3B zeigt ein Beispiel für einen Abschnitt, in dem das Wundbett deutlich beobachtet werden kann.

Ergebnisse

Die kleinen Gegenstände (Linse, Mantel, Biopsiezange), die für die Durchführung von Biopsien benötigt werden, sind in Abbildung 1 zusammen mit Indikatoren für die ordnungsgemäße Montage dieser Komponenten dargestellt. Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder von akzeptablen Ansichten des Wundbettes, um die Größe des Wundbettes und die Verschlussrate der Wunde genau zu quantifizieren. Ein Beispiel für eine Ex-vivo-Ansicht des Wundbettes ist in

Diskussion

Die Sicherstellung konsistenter und genauer Biopsien sowie Messungen der Wundgröße sind von größter Bedeutung, wenn versucht wird, die Rate des Wundverschlusses in diesem Modell effektiv zu bewerten. Daher sollten mehrere Maßnahmen ergriffen werden, um darauf zu vertrauen, dass die Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt werden. Erstens darf die Tiefe der Biopsie nicht zu flach oder tief sein. Wenn zu flach, wird es nicht genügend Fenster, um Wundverschluss zu bewerten. Abbildung 2 zeigt eine o...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biopsiezange, 3 Fr	Karl Storz	61071ZJ
Coloview Tower-System	Karl Storz	Kontakt Firma
Untersuchungsschleuse, 9 Fr, Kit	Karl Storz	61029DK
Hopkins Teleskop, 0', 1,9 mm x 10 cm	Karl Storz	64301AA
Isofluoran	Covetrus	2905
Methylenblau	Sigma-Aldrich	M9140
Mikro-Irisschere	Integra	18-1619
NIH ImageJ	NIH	N/A	Software zum kostenlosen Download verfügbar unter: https://imagej.nih.gov/ij/
Pawfly MA-60 Aquarienpumpe	Amazon	N/A
Skalpell mit #10 Klinge	Hill-Rom	372610