Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Zusammenfassung

Laserablation ist eine weit verbreitete Technologie zur Untersuchung der Regeneration in biologischen Systemen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz eines Standard-Laserscanning-Konfokalmikroskops zur Laserablation und anschließender Zeitraffer-Bildgebung regenerierender Interneuromastzellen in der Zebrafisch-Seitenlinie.

Zusammenfassung

Haarzellen sind mechanosensorische Zellen, die das Hörgefühl vermitteln. Diese Zellen regenerieren sich nicht nach Schäden beim Menschen, sondern werden natürlich erweise bei nicht-mammalischen Wirbeltieren wie Zebrafischen aufgefüllt. Das Zebrafisch-Seitenliniensystem ist ein nützliches Modell zur Charakterisierung der sensorischen Haarzellregeneration. Die seitliche Linie besteht aus haarzellhaltigen Organen, die Neuromasten genannt werden und durch eine Reihe von Interneuromastzellen (INMCs) miteinander verbunden sind. INMCs fungieren als Vorläuferzellen, die während der Entwicklung neue Neuromasten hervorrufen. INMCs können Lücken im Seitlichleitungssystem reparieren, die durch den Zelltod entstehen. Hier wird ein Verfahren zur selektiven INMC-Ablation mit einem herkömmlichen Laserscanning-Konfokalmikroskop und transgenen Fischen beschrieben, die grünes fluoreszierendes Protein in INMCs ausdrücken. Die Zeitraffermikroskopie wird dann verwendet, um die INMC-Regeneration zu überwachen und die Rate des Lückenschlusses zu bestimmen. Dies stellt ein zugängliches Protokoll für die Zellablation dar, das keine spezielle Ausrüstung erfordert, wie z. B. einen hochbetriebenen, gepulsten ultravioletten Laser. Das Ablationsprotokoll kann breiteren Interessen dienen, da es für die Ablation zusätzlicher Zelltypen nützlich sein könnte, wobei ein Toolsatz verwendet wird, der bereits vielen Benutzern zur Verfügung steht. Diese Technik wird die Charakterisierung der INMC-Regeneration unter verschiedenen Bedingungen und aus unterschiedlichen genetischen Hintergründen weiter ermöglichen, was das Verständnis der sensorischen Regeneration von Vorläuferzellen fördern wird.

Einleitung

Der Kern des progressivsten Hörverlusts liegt in der Zerstörung sensorischer Haarzellen, die extrinsische Hörreize in vom Gehirn nachweisbare Nervenimpulse umleiten. Cochlea-Haarzelltod verursacht dauerhaften Hörverlust, da erwachsene Säugetiere nicht in der Lage sind, diese Zellen nach Schäden zu regenerieren. Umgekehrt können nicht-mammalische Wirbeltiere wie Zebrafische Haarzellen regenerieren, die durch akustische Traumata oder ototoxische Beleidigungen verloren gehen. Die Zebrafisch mechanosensorische Seitenlinie ist ein einfaches und leicht manipuliertes Organsystem, das verwendet werden kann, um Haarzellregeneration^1,2,3.

Die seitliche Linie besteht aus kleinen sensorischen Flecken, neuromasten genannt, die während der Entwicklung durch eine Reihe von länglichen Zellen verbunden sind, die als Interneuromastzellen (INMCs) bekannt sind. Angesichts ihrer proliferativen Fähigkeit als scheinbare Stammzellen, die neue haarzellhaltige Organe hervorrufen, ist das Verhalten von INMCs von großem Interesse für die Gemeinschaft^4,5. Ein Großteil der Forschung im Zusammenhang mit INMCs hat die Unterdrückung ihrer Proliferation durch nahe gelegene Schwann-Zellen charakterisiert, die sich um den Lateralliniennerv wickeln, wahrscheinlich durch einen Inhibitor der Wnt/β-Catenin-Signalisierung. ^6,7,8. Während die Regulierung der INMC-Proliferation und Differenzierung in neue Neuromasten gut beschrieben wurde, wurden die Mechanismen, die das INMC-Nachwachsen nach Ablation regeln, nicht aufgeklärt. Dieses Protokoll dient als Mittel, um einzelne INMCs abzusprechen und ihr nachfolgendes regeneratives Verhalten zu analysieren.

Eine Vielzahl von Methoden zur Zerstörung von Haarzellen, unterstützenden Zellen und ganzen Neuromasten wurden veröffentlicht, zusammen mit Methoden zur Überwachung der Erholung. Chemische Ablation funktioniert gut für Haarzellen, aber Dosen von toxischen Chemikalien wie CuSO₄ müssen deutlich erhöht werden, um andere laterale Linie Zelltypen⁹zu entfernen. Während die Elektroablation unter Fluoreszenzmikroskopie ein wirksames und einfaches Mittel zur Zerstörung von INMCs zur Untersuchung der Regeneration ist, ist es schwierig, eine enge Zielart zu sein und wird daher wahrscheinlich erhebliche Kollateralschäden verursachen. Dadurch können Aspekte von INMC-spezifischen Verhaltensweisen^10,11maskiert werden. Laserablationsprotokolle wurden verwendet, aber sie erfordern den Einsatz von speziellen Geräten, die nicht unbedingt im durchschnittlichen Labor oder in der Bildgebungseinrichtung vorhanden sind (d. h. hochleistungsbetriebene gepulste UV-Laser¹²). Das hier beschriebene Verfahren kann mit jedem Laserscanning-Konfokalmikroskop durchgeführt werden, das mit dem gängigen 405 nm-Laser ausgestattet ist, der normalerweise für die Abbildung von DAPI und anderen blauen Fluorophoren verwendet wird. Ein Vorteil dieser Methode besteht darin, dass konfokale Bildgebung unmittelbar vor und nach einer Zellschädigung durchgeführt werden kann, ohne zusätzliche Lasersteuerungssysteme einzuschalten oder auf ein anderes Mikroskop zu übertragen, das mit einem gepulsten Laser ausgestattet ist.

Eine ähnliche Methode wurde beschrieben, um Neuronen im Zebrafisch Rückenmark¹³abzuleisten. Die vorherige Methode erfordert jedoch ein FRAP-Modul für die Zellablation, was für dieses Protokoll nicht erforderlich ist. Angesichts der unterschiedlichen Eigenschaften verschiedener Zelltypen (d. h. Helligkeit der Transgenfluoreszenz, Tiefe im Körper und Zellform) ist es wahrscheinlich, dass je nach verwendetem Zelltyp erhebliche Änderungen erforderlich sind. Das hier beschriebene Protokoll ist eher für oberflächlichere Zellen wirksam, wie durch eine Demonstration der sensorischen Haarzellablation mit der gleichen Methode unterstützt wird. Ebenfalls skizziert ist ein Regenerationstest zur Beurteilung der INMC-Rückgewinnungsraten nach ablation, der in der oben genannten Studie nicht enthalten war.

Das hier beschriebene laserbasierte Zellablationsprotokoll erfasst die Regenerationsfähigkeit von INMCs durch die Optimierung von Laserbedingungen, Vor- und Nachablationsbildgebung und Zeitraffermikroskopie. Diese Elemente kommen zusammen, um INMC-Nachwachsen und Lückenschluss umfassend darzustellen. Während dieses Protokoll hier verwendet wird, um INMCs zu zerstören, kann es auf andere Arbeiten angewendet werden, die eine zuverlässige und effektive Bewertung der zellulären Ablation erfordern. Es ist auch eine zugängliche Technologie, da es auf jedem konfokalen Mikroskop mit einem 405 nm Laser durchgeführt werden kann.

Protokoll

Alle tierischen Arbeiten wurden vom Pace University Institutional Animal Care and Use Committee gemäß dem Protokoll 2018-1 genehmigt.

1. Herstellung von Zebrafischlarven

1. Richten Sie die Paarung 3-5 Tage vor der Durchführung des Experiments ein, so dass Larven 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) bis 4 dpf im Alter betragen, wenn sie für die Laserablation montiert werden.
   HINWEIS: Die Et(krt4:EGFP)sqEt20 (abgekürzt ET20) Enhancer Trap Line, in der Interneuromastzellen eindeutig mit verbessertem grünen Fluoreszenzprotein (eGFP) gekennzeichnet sind, ermöglicht eine relativ einfache Zellidentifikation und Ablation^11,14. Zur Bestätigung der Laserablationsspezifität und Flexibilität werden ET20-Fische mit Tg(neuroD:tdTomato)Fischen gezüchtet, bei denen der laterale Liniennerv mit rotem fluoreszierendem Protein oder mit Tg(myo6b:'actin-GFP) gekennzeichnet ist, um sensorische Haarzellen mit GFP^15,16zu kennzeichnen.
2. Nach der Embryoentnahme am nächsten Tag Embryonen bei 28,5 °C in E3-Medium mit 0,0001% Methylenblau inkubieren, bis sie zur Anästhesisierung und Montage bereit sind.

2. Herstellung von Niedriggelier-Agarose- und Tricain-Lösungen

1. Zu einem 250 ml Glas-Erlenmeyerkolben 48 ml 1x E3-Medium, 2 ml 15 ml Tricain-Stammlösung und 0,5 g niedrigschmelzende Agarose hinzufügen.
2. Mikrowelle die Lösung auf hoch für 30 s und wirbeln (mit Wärmeschutzhandschuhen), um die Agarose aufzulösen. Wiederholen Sie die 30 s Heizzyklen, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.
3. Bewahren Sie die Agarose in einem auf 42 °C erhitzten Inkubator auf, bis sie einsatzbereit ist.

3. Anästhesisierung von Zebrafischlarven

1. Zu einem 50 ml konischen Rohr 24 ml 1x E3 medium und 1 ml Tricain-Stammlösung (15 mM) zu einer Endkonzentration von 600 m hinzufügen. Wirbel zu mischen.
2. Laden Sie eine der sechs Brunnen einer flachen Zellkulturplatte mit 8 ml E3, die 600 M Tricain enthält.
3. Verwenden Sie eine Transferpipette, um Zebrafischlarven in einen 74 m Maschenboden-Transfereinsatz zu verschieben.
4. Übertragen Sie den Netzbodeneinsatz in den Brunnen der Sechs-Well-Platte, die die E3 + Tricain-Lösung enthält. Lassen Sie die Larven mindestens 3 min im Brunnen bleiben oder bis sie vollständig beästhestisiert sind. Testen Sie die Anästhesie, indem Sie auf den Einsatz tippen. Larven sollten nicht erschreckt und schwimmen als Reaktion auf den Hahn.

4. Fluoreszierendes Screening von anästhesierten Zebrafischlarven

1. Pipette eine betäubte Larve pro Brunnen auf 12 gut hydrophobe Dias zum Screening. Stellen Sie sicher, dass in jedem Bohrgang des Dias eine minimale Krümmung des Meniskus gebildet wird, um optische Verzerrungen beim Screening zu reduzieren. Dies kann durch Entfernen eines kleinen Volumens von E3 aus jedem Brunnen nach dem Platzieren der Larven erfolgen.
2. Unter einem 10-fachen Objektiv auf einem aufrechten Mikroskop (ausgestattet mit einer Quecksilberlichtbogenlampe, Metallhalogenidlampe oder LED-Lichtquelle und einem geeigneten Filterwürfel), Bildschirm für Larven, die eGFP in den Neuromasten und Interneuromastzellen des Lateralliniensystems ausdrücken.
   1. Wählen Sie Larven mit stärkerer Expression, was zu hellerem eGFP führt, die vermutlich homozygot für das Transgen sind.
      HINWEIS: In der ET20-Linie wird eGFP in einem Ring von Mantelzellen ausgedrückt, die jeden Neuromast umgeben, sowie in dem schmalen Streifen von Interneuromastzellen, die diese Organe verbinden. Eine stärkere eGFP-Expression (hellere Fluoreszenz) trägt zu einer effektiveren Ablation bei.
   2. Um die Spezifität der Ablation zu untersuchen, verwenden Sie doppeltransgene Larven sowohl mit den TRANSgenen ET20 als auch mit Tg(neuroD:tdTomato). Wenn Sie das Screening auf Tg(neuroD:tdTomato)-Träger durchführen, verwenden Sie den RFP-Filterwürfelsatz, um einen leuchtend roten Fleck zu identifizieren, der nur hinter dem Ohr steht und das hintere seitliche Linienganglien darstellt.
   3. Um Haarzellen in den Laterallinien-Neuromasten abzuergänzen, verwenden Sie die transgene Linie tg(myo6b:'actin-GFP) für die GFP-Lokalisierung in der Mitte jedes Neuromasts.
3. Wählen Sie Larven mit stereotypen Abständen der Neuromasten. Unterschiede im Abstand zwischen Neuromasten können auf eine abnormale Neuromastablagerung während der Entwicklung hindeuten, was auf ein fehlerhaftes Migrationsverhalten oder eine Zellproliferation in der Seitenlinie primordium¹⁷hindeutet. Solche Defekte können auch das Migrations- oder Regenerative Verhalten der INMCs nach ablation beeinflussen.
   HINWEIS: Häufige Fehler im Abstand sind ein ungewöhnlich großer Abstand zwischen dem vorderen Neuromast, der durch das erste migrierende Primordium (prim1L1) abgelagert wird, und dem zweiten Neuromast, der von demselben Primordium (prim1L2) abgelagert wird, der häufig mit der Verdrängung der hinteren Neuromasten verbunden ist.

5. Montage larven für Laserablation und Bildgebung

1. Pipette 3 - 4 anästhesierte Larven in ein kleines Tröpfchen E3/Tricain-Lösung in der Mitte einer Abdeckung Schlupfbodenschale (35 mm Schale mit einer 14 mm Nummer 1,5 Deckblatt). Entfernen Sie überschüssige Lösung, so dass die Larven in einem kleinen Tröpfchen bleiben, gerade groß genug, um sie zu enthalten.
2. Übertragen Sie die Schale auf die Bühne eines binokularen Stereomikroskops und manipulieren Sie den Zoom und Fokus, so dass alle Larven im Sichtfeld sind.
3. Entfernen Sie den Erlenmeyerkolben, der den niedrigen Schmelzpunkt Agarose enthält, aus dem beheizten Inkubator. Verwenden Sie eine Transferpipette, um Agarose-Lösung auf den Deckschlitten zu übertragen, um eine dünne Schicht zu erzeugen. Ziehen Sie überschüssige Agarose ab, bis die Flüssigkeit nur den Brunnen am Boden der Schale füllt, wobei darauf geachtet wird, keine Larven zu aspirieren.
4. Ordnen Sie die Larven in der Agarose-Lösung schnell mit einem Haarmesser oder einer Haarschlaufe an, so dass sie aufeinander ausgerichtet und mit rostral nach links ausgerichtet sind.
5. Drücken Sie die Larven vorsichtig mit dem Haarmesser gegen das Glas, so dass sie mit ihren rechten Seiten im Profil liegen. Larven, die älter als 3 dpf sind, neigen dazu, aufgrund ihrer aufgeblasenen Schwimmblasen zu schweben, so dass sie möglicherweise wiederholt gegen das Glas gedrückt werden müssen, bis die Agarose zu gelieren beginnt.
6. Nach etwa 60 s beginnt sich die Agarose zu erstarren, und die Larven können nicht neu ausgerichtet werden. Lassen Sie ca. 5 Minuten bei Raumtemperatur für die Agarose auf dem Deckel schlupf, um vollständig zu erstarren. Sobald die Agarose erstarrt ist, verwenden Sie eine Transferpipette, um die Schale auf halbem Weg mit E3 zu füllen, das 1x Tricain enthält.

6. Suche nach prospektiven Zielen und Vorablations-Bildgebung

1. Schalten Sie die Stromversorgung des konfokalen Mikroskopiesystems für Laserscans ein und initialisieren Sie es über die integrierte Bildgebungssoftware. Wählen Sie das 63x Plan-Apochromat Öl Immersion Objektiv (numerische Blende 1.40) oder ähnlich. Tauchöl auftragen und die Schale in einem kreisförmigen Bühneneinsatz so sichern, dass die Larven mit ihrem rostralen Aspekt nach links gesichten.
2. Wählen Sie unter Hellfeld- oder Differentialinterferenzkontrastbeleuchtung eine der montierten Larven für die Bildgebung aus. Stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf so ein, dass die Haut an der Seite des Fisches, die dem Coverslip am nächsten liegt, im Fokus steht, erkennbar am Fingerabdruck-ähnlichen Muster von Peridermzellen.
3. Sobald Sie im Fokus sind, wechseln Sie zur epifluoreszierenden Beleuchtung im GFP-Kanal. Suchen Sie die hintere Seitenlinie durch GFP-Ausdruck entlang des horizontalen Myoseptums. Ringe von fluoreszierenden Zellen zeigen Neuromast-Mantelzellen an, und längsierte Zellstränge sind interneuromast-Zellen.
4. Beginnend mit dem primIL1 Neuromast, in der Regel nur dorsal zum Eigelb, verwenden Sie die Bühnensteuerung Joystick oder andere Bühnenbewegungssteuerung, um visuell kauarisch entlang der horizontalen Myoseptum scannen.
   1. Folgen Sie der Reihe der Interneuromastzellen, bis sie die Region zwischen den Neuromasten primIL3 und primIL4 (L3 und L4) erreichen (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Andere Regionen können ebenfalls gezielt sein, aber dieser Abschnitt des Stammes und des Schwanzes ist dem Deckglas am nächsten und daher am besten ablationsfähig.
   2. Wenn Sie mehrere Larven abbilden, legen Sie die erste Stufenposition fest, und deaktivieren Sie dann die Option für mehrere Stufenpositionen, indem Sie das entsprechende Kontrollkästchen deaktivieren.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 6.4.1–6.4.2. für jede gewünschte Stufenposition (jede Larve).
5. Nachdem Zellkörper im L3-L4-Bereich identifiziert wurden, wechseln Sie in den Erfassungsmodus.
   1. Aktivieren Sie eine GFP-Bildspur mit dem 488 nm oder 491 nm Laser.
   2. Fügen Sie der aktivierten 488 nm Laserspur einen Durchlichtkanal (Transmitted Light Photomultiplier Tube oder T-PMT) hinzu, indem Sie das Kontrollkästchen T-PMT unter dem Dropdown-Menü "Imaging Setup" aktivieren.
   3. Stellen Sie die Laserleistung auf 6 %, die Lochgröße auf 1 Airy-Einheitsäquivalent und den digitalen Gewinn auf 750 für die Bildgebung von ET20-Larven ein. Die genaue Verstärkung und Laserleistung kann für jede larve variieren, je nachdem, wie nah sie am Deckschlupf montiert sind und wie hell die Fluoreszenz ist. Passen Sie die Verstärkung so an, dass Zellkörper gesättigt sind, um ansonsten düstere Projektionen und Filipodia zu erfassen.
   4. Passen Sie die Parameter auf eine Framegröße von 1024 Pixel x 1024 Pixel, einen digitalen Zoom von 0,7 (145,2 x 145,2 m Bildgröße) an. Legen Sie die Mittelung auf 2 fest, um die Bildqualität zu verbessern.
6. Aktivieren Sie die Z-Stack-Box, um das Dropdown-Menü z-Position aufzurufen. Während des schnellen Scannens konzentrieren Sie sich, bis die interneuromast-Zellen gerade aus dem Fokus sind. Stellen Sie das erste Slice ein, und fokussieren Sie dann durch die Probe, bis die interneuromast-Zellen wieder aus dem Fokus sind. Legen Sie das letzte Slice fest. Stellen Sie sicher, dass es einen Z-Stack von ca. 25 m umfasst. Legen Sie das Bildgebungsintervall auf 1 m fest.
7. Starten Sie das Experiment, um einen Pre-Ablation z-stack zu erfassen (Abbildung 1B). Wenn Stufenpositionen hinzugefügt wurden, deaktivieren Sie die Positionsoption, sodass nur die aktuelle Position abgebildet wird. Speichern Sie die Datei, sobald sie erfasst wurde.

7. Laserablation von Zellkörpern

1. Klicken Sie auf "Alle Tools anzeigen". Diese Option befindet sich oben auf der Erfassungsschnittstelle.
2. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü für "Imaging Set Up". Klicken Sie in "Imaging Set up" auf " Einen neuenTitelhinzufügen " (dargestellt als "+").
3. Klicken Sie unter "Imaging Set Up" auf das Dropdown-Menü für "Dye". Wählen Sie DAPI als Farbstoff aus.
4. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü für "Kanäle" und deaktivieren Sie alle anderen Tracks, indem Sie das Klicken auf die entsprechenden Kontrollkästchen deaktivieren. Stellen Sie sicher, dass nur die DAPI-Spur ausgewählt ist.
5. Klicken Sie in der DAPI-Spur auf 405 für die "Lasereinstellung". Erhöhen Sie die Laserleistung auf 75%. Klicken Sie auf den DAPI-Kanal, um den Laser auszuschalten, während Sie nach Kandidatenzellenkörpern zur Ablation suchen.
6. Wenn der Körper einer Interneuromastzelle im Sichtfeld zentriert ist, zoomen Sie den Scanrahmen auf 20x–22x. Die Rahmenposition muss möglicherweise angepasst werden, um den Zellkörper in der Mitte zu halten, während der Zoom angewendet wird. Beenden Sie das Live-Scannen, sobald der Zellkörper das Sichtfeld ausfüllt.
   HINWEIS: Der Zellkörper sollte das gesamte Sichtfeld einnehmen. Bei dieser Zoomstufe bleicht das GFP schnell. Minimieren Sie die Laserbelichtungszeit, indem Sie schnell arbeiten. Verwenden Sie Zoom, anstatt einen Bereich von Interesse auszuwählen, um die Laserleistungsverteilung über einen kleinen Bereich zu erhöhen.
7. Überprüfen Sie die 405 nm Laser-Shutter-Box, um die Spur zu aktivieren. Stellen Sie die Laserleistung auf 75 % ein. Stellen Sie einen Timer für 45 s ein. Aktivieren Sie das kontinuierliche Scannen und starten Sie den Timer. Beenden Sie den Scanvorgang sofort bei 45 s.

8. Nachablation-Bildgebung und Zeitraffermikroskopie zur Untersuchung der Regeneration

1. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü für "Kanäle". Deaktivieren Sie in Kanälen die Spur "DAPI", um den Ablationslaser zu deaktivieren. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü für "Erfassungsmodus".
2. Klicken Sie im Erfassungsmodus auf "Zoom".
3. Verringern Sie den Zoom auf 0,7 entweder mit dem Schieberegler oder durch Eingabe von "0.7."
   1. Um eine erfolgreiche Zellablation zu gewährleisten, erhöhen Sie den Gewinn auf 900 und scannen Sie schnell das Sichtfeld.
      HINWEIS: Innerhalb der Zielzelle oder Zellen sollte kein GFP sichtbar sein. Wenn die Fluoreszenz weiterhin beobachtet wird, kehren Sie zu den Schritten 7.1–7.3 zurück.
   2. Verwenden Sie die gleichen oder ähnliche Einstellungen wie für die Vorabdarstellung, erfassen und speichern Sie ein Bild nach der Ablation (Abbildung 1C). Wenn das Bild Reste von fluoreszierenden Zellen oder zusätzlichen Zellkörpern zeigt, die entfernt werden müssen, wiederholen Sie die Laserablationsschritte, um eine sichtbare Lücke in der Reihe der interneuromast-Zellen zu schaffen.
   3. Prüfen Sie das T-PMT-Kanalbild, um zelluläre Schäden weiter zu bestätigen. Beschädigte Zellen haben ein körniges Aussehen, und häufig werden die Kerne anschwellen oder in ihrer Form unregelmäßig werden (Abbildung 2).
4. Nach der Erfassung eines Vorablationsbildes, dem Ableiten der Zellen bei Bedarf und dem Erfassen eines Post-Ablationsbildes für jede einzelne Bühnenposition richten Sie die Zeitraffermikroskopie ein, indem Sie sowohl die Bühnenposition als auch die Zeitoptionen für die Bildaufnahme aktivieren. Stellen Sie die Zeitparameter auf 24 h oder einen anderen gewünschten Endpunkt und 15 min Intervalle ein. Starten Sie das Experiment, um Bilder zu erfassen, und speichern Sie die resultierende Datei nach Abschluss (am nächsten Tag).
5. Wenn Larven weiter untersucht oder aufgezogen werden sollen, entfernen Sie sie vorsichtig aus der Agarose mit feiner Zange, dann übertragen Sie in E3 Medium ohne Tricain zur Genesung. Wenn sie nicht weiter verwendet werden sollen, müssen Sie nach dem genehmigten Tierprotokoll einschläfern (schnelles und nachhaltiges Eintauchen in ein Eisbad ist eine gängige Methode) und entsorgen Sie sie nach Denitlierungsbedarf.

9. Bildanalyse

1. Öffnen Sie eine Z-Stack-Datei nach der Ablation in der bevorzugten Bildverarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien). Teilen Sie die Kanäle so auf, dass sich jeder Kanal in einem separaten Anzeigebereich befindet.
2. Verwenden Sie im GFP-Kanalfenster das Linienwerkzeug, um eine gerade Linie zwischen den Spitzen der verbleibenden INMCs zu zeichnen. Dies kann durch einen Bildlauf durch den Z-Stack oder durch eine Projektion mit maximaler Intensität vor dem Zeichnen der Linie unterstützt werden.
3. Verwenden Sie das Werkzeug "Messen", um den Abstand zwischen INMC-Enden in der x- und y-Ebene zu erhalten.
4. Führen Sie einen Bildlauf durch die Z-Slices im ursprünglichen Z-Stack durch, um den Abstand zwischen INMCs in der Z-Ebene zu bestimmen.
5. Berechnen Sie den Gesamtabstand zwischen INMC-Enden mit dem Satz des Pythagorean (a² + b² = c²). Die Hypotenuse ist die Gesamtentfernung (oder Spaltgröße).
6. Geben Sie die resultierende Entfernungsmessung zur Datenanalyse in eine Tabellenkalkulationsanwendung ein.
7. Überprüfen Sie die in Schritt 8.2–8.3 gesammelten Zeitraffer-Mikroskopiedateien entweder mit der integrierten Bildverarbeitungssoftware auf dem konfokalen System oder mit der frei verfügbaren Bildanalysesoftware. Identifizieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Lücke zwischen interneuromast-Zellen durch Zellprojektionen gefüllt wurde. Dies kann durch die Untersuchung mehrerer Z-Slices unterstützt werden, um den Lückenschluss in allen Dimensionen zu bestätigen.
8. Um die genaueste Messung der Zeit bis zum Lückenschluss zu erreichen, verwenden Sie den Zeitstempel für das Bild nach der Ablation (sichtbar im Finder oder Datei-Explorer) als Null-Zeitpunkt; Die Messzeit vom Beginn des Zeitraffer-Bildstapels kann zu einer Unterschätzung der Zeit bis zum Verschluss führen, je nachdem, wie viel Zeit beim Ablatten zusätzlicher Bühnenpositionen verstrichen ist usw.
9. Ableiten Sie die Schließrate, indem Sie einfach die ursprüngliche Spaltgröße (m) durch die Stunden oder Minuten dividieren, die für den vollständigen Lückenschluss erforderlich sind.

Ergebnisse

Um INMCs abzuschleifen und die Regeneration aufzuzeichnen, wurden geschirmte GFP-exzessierende Zebrafischlarven der transgenen Linie ET20 bei einer 2- oder 3-tägigen Nachbefruchtung zur Ablation montiert, wie in Schritt 5.4 beschrieben. Mehrere Fische können gleichzeitig montiert werden, so dass mehrere Zeitraffer in einem einzigen Experiment eingefangen werden können. Der Bereich der Seitlichen Linie zwischen primIL3 und primIL4 Neuromasten wurde identifiziert, und Vorablationsbilder wurden wie in den Schritten 6.5-6.7 beschrieben (Abbildung 1A,B) aufgenommen.

Drei Zellkörper wurden für die Laserablation ins Visier genommen, um eine Lücke in der INMC-Zeichenfolge von ca. 40 m zu schaffen. Das Scannen nach der Ablation mit hoher Verstärkung und die anschließende Bildgebung bestätigte, dass keine Zellkörper in der abierten Region verblieben, so dass eine Lücke zwischen den langgestreckten Projektionen der benachbarten INMCs (Abbildung 1C) zurückblieb. Der Zelltod wurde durch die Untersuchung des T-PMT-Kanals nach ablation weiter nachgewiesen. Beschädigte und sterbende Zellen waren durch geschwollene und unregelmäßig geformte Kerne sowie ein körniges Erscheinungsbild gekennzeichnet(Abbildung 2, umrissen). In einigen Fällen ergab die Zeitraffer-Bildgebung auch die Rekrutierung großer Amoedoide-Zellen, die wahrscheinlich Makrophagen waren(Abbildung 2, Sternchen). Dunkle Bereiche, die die abierten INMCs umgeben, deuteten auf Photobleichungen in darüber liegenden Peridermzellen hin. Diese Zellen wurden in diesen Experimenten nicht durch Laserbestrahlung beschädigt oder zerstört; vielmehr wurde ihre Fluoreszenz vorübergehend reduziert. Die Zeitraffermikroskopie zeigt, dass sich diese Zellen normalerweise nach der Ablation erholen und ihre Form nicht ändern oder anderweitig beschädigt erscheinen (unveröffentlichte Ergebnisse, Volpe et al.).

Um die Spezifität der INMC-Zerstörung zu unterstützen, wurden Ablationen bei doppeltransgenen ET20- und Tg(neuroD:tdTomato)-Larven durchgeführt, bei denen der laterale Liniennerv (der nur Mikrometer unter den Interneuromastzellen verläuft) mit rotem fluoreszierendem Protein gekennzeichnet ist. Ablationen mehrerer Zellen, die erhebliche Lücken in der INMC-Zeichenfolge erzeugten, hatten auf der Grundlage roter Fluoreszenz wenig oder gar keine Auswirkungen auf den lateralen Liniennerv (Abbildung 3). Die Flexibilität der Technik zum Ableiten oberflächlich lokalisierter Zellen wurde durch die selektive Zerstörung einzelner sensorischer Haarzellen innerhalb von Neuromasten der Seitenlinie demonstriert. Mit dem im Wesentlichen gleichen Protokoll, das oben beschrieben wurde (Abschnitte 7 und 8), wurden einzelne Haarzellen in transgenen Tg(myo6b:'actin-GFP) Larven ohne offensichtliche Schäden an benachbarten Zellen zerstört (Abbildung 4). Die abierten Haarzellen erholten sich nach der Zeitraffermikroskopie nicht mehr, und ihre Kerne waren nach der Laserbelichtung merklich granular und falsch geformt (Abbildung 4B). Ähnlich wie bei INMC-Ablations wurden häufig scheinbare Makrophagen an die Laser-Belichtungsstelle rekrutiert (unveröffentlichte Ergebnisse, Volpe et al.).

Nach der Laserablation und der Bildaufnahme nach der Ablation wurde die Lückengröße mit einer frei verfügbaren Bildanalysesoftware gemessen. Das Messwerkzeug zeigte Lückengrößen von nur wenigen Mikrometern bis zu 100 Mikrometern, abhängig von der Breite der einzelnen INMCs und wie viele Zellen für die Ablation ausgewählt wurden (Abbildung 5). Die Zeitraffermikroskopie wurde eingesetzt, um INMC-Verhalten während der Regeneration aufzuzeichnen. In 50 Studien, 15 Lücken (30%) wurden durch Regeneration innerhalb eines Zeitraums von 24 h geschlossen. In den meisten Fällen taten INMCs, die sich erholen konnten, dies innerhalb der ersten Stunden nach der Bildgebung. Die Wiederherstellung wurde definiert als der Zeitpunkt, an dem Projektionen von benachbarten Zellen in Kontakt kamen, der 16 h nach Ablation für eine Lücke von ca. 40 m auftrat (Film 1). Z-Stacks wurden sorgfältig untersucht, um sicherzustellen, dass der Zell-Zell-Kontakt innerhalb einer einzelnen Z-Ebene auftrat, wodurch mögliche Artefakte aufgrund von Z-Projektionen vermieden wurden. Die logistische Regressionsanalyse ergab, dass die Wahrscheinlichkeit eines Lückenabschlusses mit der Lückengröße korrelierte (p = 0,0453), wobei kleinere Lücken eher heilen. Eine Lücke von 55,5 m ergab eine Verschlusswahrscheinlichkeit von 50 % (Abbildung 5).

In 70 % der Fälle waren die INMCs nicht in der Lage, die durch ablation entstandene Lücke vollständig zu schließen. Aber auch in diesen Fällen waren wir in der Lage, die Bildung von langen Projektionen von benachbarten INMCs zu überwachen, die in mancher Hinsicht ausweitenden neuronalen Wachstumskegeln ähneln (Film 2). So können diese Experimente auch Einblicke in das Verhalten von INMCs nach Schäden geben.

Abbildung 1: Selektive Ablation von Interneuromastzellen durch Laserbestrahlung. (A) Interneuromastzellen zwischen den Neuromasten primIL3 und primIL4 wurden für die Ablation ausgewählt. Diese Zellen zeigen eine charakteristische Spindelform mit länglich überlappenden Projektionen an, die benachbarte Zellkörper überlappen. (B) Die Vorab-Bildgebung identifizierte Zellkörper, die abaltt werden könnten, um eine Lücke zu schließen. (C) Die Bildgebung nach der Ablation bestätigt eine erfolgreiche Ablation, wie sie durch das Fehlen von Zellkörpern im Lückenbereich angezeigt wird. Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Die Bildgebung nach der Ablation zeigt den Zelltod als Reaktion auf die Laserexposition in GFP-markierten Interneuromastzellen. Die lichtdurchlässige Lichtphotomultiplier-Bildgebung (T-PMT) zeigt das Vorhandensein einer nekrotischen Zelle mit einem körnigen Erscheinungsbild (umschlossen) sowie die Rekrutierung von unregelmäßig geformten Zellen, die wahrscheinlich Makrophagen sind (*). Die Zusammenführung von GFP- und T-PMT-Kanälen bestätigt, dass der Zelltod und die Makrophagenaktivität am Ablationsort aufgetreten sind. Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Spezifität der interneuromastablation. (A) GfP-markierte Interneuromastzellen (grün) und tdTomato-markierte Querliniennerven (rot) in einem doppeltransgenen Tg(ET20; NeuroD:tdTomato) Larve. Zellkörper in unmittelbarer Nähe des Seitlichen Liniennervs wurden zur Ablation ins Visier genommen. (B) Die Bildgebung nach der Ablation zeigt die Ablation von Zielzellkörpern mit einem intakten Lateralliniennerv. Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ablation sensorischer Haarzellen mittels konfokaler Mikroskopie. (A) Die Vorablationsbildgebung identifizierte GFP-gekennzeichnete sensorische Haarzelle (*), die zur Ablation in doppeltransgenen Tg(ET20; myo6b: Éactin-GFP) Zebrafischen bestimmt ist. Die Bildgebung der durchdigen Lichtphotomultiplierröhrchen (T-PMT) offenbart eine normale Haarzellmorphologie mit einem runden Querschnitt. (B) Die Nachablationsbildgebung bestätigt eine erfolgreiche Ablation der Zielhaarzelle. Ein T-PMT-Bild weist auf Unregelmäßigkeiten in der Haarzellform und erhöhte Granularität nach Laserbelichtung hin, was eher auf den Zelltod als auf Photobleichungen hindeutet. Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Die logistische Regression modelliert die Wahrscheinlichkeit eines Lückenabschlusses in Abhängigkeit von der Spaltbreite (in m). Eine Punktzahl von 0 stellt den vollständigen Lückenabschluss dar, während eine Punktzahl von 1 einen unvollständigen Lückenabschluss darstellt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Effekt der Spaltbreite auf die Fähigkeit von Interneuromastzellen, entsprechende Lücken zu schließen, statistisch signifikant ist (p = 0,0453, n = 24 insgesamt; n = 12 geschlossene Lücken, n = 12 unvollständig geschlossene Lücken). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Film 1: Zeitraffermikroskopie, die einen Lückenschluss nach 16 h demonstriert. Alle 15 min wurden Bilder aufgenommen und für alle Zeitpunkte eine maximale Intensitäts-Z-Projektion gemacht. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Film 2: Zeitraffermikroskopie einer INMC-Lücke, die sich nicht geschlossen hat. Die langgestreckten und verzweigten Projektionen der verbleibenden INMCs werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

Das Protokoll beschreibt eine vielseitige Methode zur Laserzellablation, die auf jedem konfokalen Mikroskop durchgeführt werden kann, das mit einem nahezu ultravioletten Laser (405 nm Wellenlänge) ausgestattet ist. Dieses Protokoll befasst sich mit Einschränkungen der zuvor eingesetzten Methoden wie Elektroablation (die weiter verbreitete Schäden verursacht¹¹) und gepulste UV-Laserablation (die zusätzliche Spezialausrüstung erfordert¹²). Die konfokale Bildgebung vor und nach der Ablation gibt ein schnelles Feedback zum Erfolg des Experiments. Die nachfolgende Zeitraffermikroskopie bietet einen einfachen Test zur Regeneration in einem für die sensorische Systementwicklung kritischen Zelltyp.

Es ist von entscheidender Bedeutung, transgene Zebrafische, die GFP stark in Neuromasten und INMCs ausdrücken, vorzusieben. Larven mit heller Fluoreszenz und etwa gleichmäßigem Abstand der primI-abgeleiteten Neuromasten sind ideale Kandidaten für die Laserablation. Selbst bei diesen Fischen gibt es gelegentlich dimmer inMCs, die zunächst der Erkennung entgehen können. Diese Zellen können nach der Laserablation zurückbleiben und die Bildung einer echten Lücke zwischen INMCs verhindern. Der digitale Gain sollte so eingestellt werden, dass diese Dimmerzellen während der Vorablationsbildgebung so sichtbar werden, dass sie auch mit dem 405 nm Laser (Schritt 8.2) gezielt eingesetzt werden können.

In ähnlicher Weise zerstört Laser-Targeting manchmal nicht vollständig eine Zelle; vielmehr wird die Fluoreszenz bleichen, was dazu führt, dass keine wirkliche Lücke entsteht. Diese Zellen werden in der Regel die Fluoreszenz während der Zeitraffermikroskopie erhöhen. Gain-Anpassungen im Schritt der Bildgebung nach der Ablation zusammen mit der T-PMT-Bildgebung (Abbildung 2) tragen dazu bei, dass alle gezielten Zellen effektiv entfernt wurden. Häufig sind zwei oder drei einzelne Zellablationen erforderlich, um eine Lücke in der INMC-Zeichenfolge zu erzeugen. Der Zelltod kann durch Blessur oder ein körniges Aussehen in den Zielzellen nachgewiesen werden; obwohl dies eine kurze Wartezeit nach dem Laser-Targeting erfordern kann (und in einigen Fällen werden kurze Zeit später scheinbare apoptotische oder nekrotische Zahlen beobachtet).

Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass es mehrere experimentelle Versuche erfordern kann, bevor die Laserbedingungen optimiert werden und die INMC-Regeneration erfolgreich ist. Die Laserleistung und die Gesamtverweilzeit des Lasers können jeweils eine leichte Anpassung für verschiedene Proben erfordern. Es wurde festgestellt, dass übermäßige Laseranwendung die Fähigkeit der Seitenlinie beeinträchtigen kann, sich selbst zu reparieren. Dazu gehören sowohl 1) Überbelichtung einzelner Zellen gegenüber Laserbestrahlung, die vermutlich zusätzliche Schäden an umgebenden Geweben verursacht, als auch 2) die Ablation zu vieler Zellen in der Schnur, was zu einer größeren Lücke führt. Die Benutzer müssen ein Gleichgewicht zwischen ausreichend bestrahlenden Zellen erreichen, um ihre Zerstörung zu gewährleisten, und nicht, die Zellen zu überbelichten, was die Regeneration verlangsamen oder verhindern kann. Mit den entsprechenden Einstellungen wurde festgestellt, dass die INMCs ohne sichtbare Beschädigung des hinteren seitlichen Liniennervs entfernt werden können, was darauf hinweist, dass Kollateralschäden mit diesem Protokoll im Gegensatz zur Elektroablation¹¹minimiert werden. In keinem Fall bildeten sich neue Neuromasten in der Lücke, vermutlich weil der Lateralliniennerv intakt bleibt und die zugrunde liegenden Gliazellen erhalten bleiben und die Proliferation von INMCs^6,7,8,11hemmen.

Es wird gezeigt, dass diese Methode der konfokalen Laserablation auch auf andere Zelltypen angewendet werden kann, insbesondere bei solchen, die sich oberflächlich innerhalb des Tieres befinden, einschließlich sensorischer Haarzellen (Abbildung 4). Ein ähnliches Protokoll kann verwendet werden, um Hautzellen abzuergänzen, um Wundreparatur oder Neuronen für axonale Regenerationsstudien zu untersuchen, wie zuvor beschrieben¹³. Es wird erwartet, dass diese Technik eine nützliche Ergänzung zum experimentellen Repertoire von Laboratorien werden wird, die ein konfokales Mikroskop besitzen, aber keine andere spezialisierte Ausrüstung für die Laserablation.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12-Well-PTFE-Druckobjektträger	Elektronenmikroskopie Sciences	63425-05
15 mM Tricain Stammlösung	Sigma	E10521	15 mM Tricain in Umkehrosmosewasser
1X E3 + 600 µ M Tricain			Verdünnung von 15 mM Tricain-Bestand 25X in 1X E3 Medien
1X E3 Medien			Verdünnung von 60X E3 Medien auf 1X in Umkehrosmosewasser (16,7 ml/L)
60 X E3 Medien	Alle von Sigma-Aldrich		34,4 g Nacl, 1,52 g Kcl, 5,8 g CaCl2.2H2O, 9,8 g MgSO4.7H20 in 1 Liter Umkehrosmosewasser
Bx60 Verbundmikroskop mit Quecksilberbogenlampe Fluoreszenzmikroskop	Olympus
LSM 700 konfokales Mikroskop ausgestattet mit 405 nm, 488 nm und 555 oder 561 nm	Lasern Carl Zeiss Microscopy, LLC		Für die Ablation wurde ein 5 mW 405 nm Laser verwendet; Ablationen und Bildgebung wurden durch ein 63x Plan-Apochromat-Objektiv mit einer NA von 1,40
durchgeführt FIJI/ImageJ Bildverarbeitungssoftware	Mehrere Mitwirkende		Herunterladbar unter https://fiji.sc/
Präpariernadel in Haarmesser umgewandelt	Fisher Scientific	19010	Eine Wimper wurde auf das Ende einer Präpariernadel mit Holzgriff geklebt
Microsoft Excel-Software	Microsoft Corp.		Google Sheets ist eine kostenlose Alternative zu Microsoft Excel
35-mm-Schalen mit Glasboden und Deckglas Nr. 1,5, 20 mm	Fenster Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35 mm Petrischale, 20 mm Glasfenster
Immersol 518F Immersionsöl	Fisher Scientific	12-624-66A
Agarose	Sigma Life Science	A9414-256
Corning Netwell Einsatz mit 74 μm Polyesternetz, 24 mm Einsatz	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio Software	Rstudio PBC		Herunterladbar unter https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stereomikroskop	Motic
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN Software	Carl Zeiss Microscopy, LLC