Methodenartikel

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

DOI:

10.3791/60989

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2. April 2020

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1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren ein Protokoll zur Kennzeichnung und Analyse pyramidaler Neuronen, das für die Bewertung potenzieller morphologischer Veränderungen in Neuronen und dendritischen Stacheln, die neurochemischen und verhaltensbedingten Anomalien zugrunde liegen können, entscheidend ist.

Zusammenfassung

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Es wurde berichtet, dass die Größe und Form der dendritischen Stacheln mit ihrer strukturellen Plastizität zusammenhängt. Um die morphologische Struktur von pyramidenförmigen Neuronen und dendritischen Stacheln zu identifizieren, kann eine ballistische Etikettierungstechnik verwendet werden. Im vorliegenden Protokoll werden pyramidale Neuronen mit DilC18(3)-Farbstoff gekennzeichnet und mit neuronaler Rekonstruktionssoftware analysiert, um neuronale Morphologie und dendritische Stacheln zu bewerten. Zur Untersuchung der neuronalen Struktur werden dendritische Verzweigungsanalysen und Sholl-Analysen durchgeführt, die es den Forschern ermöglichen, Rückschlüsse auf die dendritische Verzweigungskomplexität bzw. die neuronale Arbor-Komplexität zu ziehen. Die Auswertung der dendritischen Stacheln erfolgt mit einem automatischen assistierten Klassifizierungsalgorithmus, der zur Rekonstruktionssoftware integriert ist und die Stacheln in vier Kategorien einreibt (d. h. dünn, Pilz, stumpf, filopodia). Darüber hinaus werden weitere drei Parameter (z. B. Länge, Kopfdurchmesser und Volumen) ausgewählt, um Veränderungen in der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie zu bewerten. Um das Potenzial einer breiten Anwendung der ballistischen Etikettierungstechnik zu validieren, wurden pyramidale Neuronen aus der In-vitro-Zellkultur erfolgreich gekennzeichnet. Insgesamt ist die ballistische Etikettierungsmethode einzigartig und nützlich für die Visualisierung von Neuronen in verschiedenen Hirnregionen bei Ratten, was es Forschern ermöglicht, die möglichen Mechanismen zu klären, die neurokognitive Dysfunktion.

Einleitung

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Im Jahr 2000 beschrieben Gan et al. eine schnelle Etikettierungstechnik für einzelne Neuronen und Glia im Nervensystem, die verschiedene lipophile Farbstoffe kombinierte, was die gleichzeitige Kennzeichnung vieler Gehirnzellen mit verschiedenen Farben1,2ermöglichte. In jüngerer Zeit wurde eine ballistische Etikettierungstechnik von Seabold et al.3 beschrieben, die fluoreszierende Farbstoffe (Dil) in die Neuronen von Gehirnscheiben einführte. Eine vielseitige Färbetechnik, ballistische Etikettierung wird für seine Fähigkeit geschätzt, in mehreren Tierarten und über eine breite Palette vo....

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Protokoll

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Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt (Bundesversicherungsnummer: D16-00028).

1. Herstellung von DiI/Tungsten-Perlenschläuchen

  1. 100 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit 10 ml ddH2O. Vortex die PVP-Lösung leicht auflösen.
  2. Füllen Sie den Schlauch mit der PVP-Lösung (siehe Materialtabelle) und lassen Sie ihn 20 min. Dann vertreiben Sie die PVP-Lösung durch das andere Ende des Schlauches mit einer 10 ml Spritze.
  3. Kombinieren Sie 170 mg Wolfram-Mikroträger-Perlen mit 250 l Methylenchlorid. Wirbel die Wolfram-Perle S....

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Ergebnisse

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In Abbildung 2Awurden die typischen pyramidenförmigen Neuronen in der Hippocampusregion in den Hirnabschnitten der Ratte durch ballistische Etikettierungstechnologie identifiziert, die sich durch einen großen apikalen Dendrit und mehrere kleinere Basaldendriten um das Soma auszeichnete. Abbildung 2B zeigt das Neuron in der quantitativen Analysesoftware für die neuronale Rekonstruktion, nachdem das Soma nachgewiesen, dendritische Zweige und Stacheln nachgewiesen .......

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Diskussion

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In diesem Protokoll beschreiben wir eine vielseitige Etikettierungstechnik für Neuronen sowohl aus Rattenhirn als auch für in vitro angebaute. Darüber hinaus berichten wir über die Methodik für die Verwendung von neuronaler Rekonstruktionssoftware und neuronaler Rekonstruktionquantitativer Analysesoftware zur Bewertung der neuronalen Morphologie und dendritischer Stacheln. Die Bewertung der neuronalen Morphologie und dendritischen Stacheln bietet die Möglichkeit, Veränderungen in dendritischer Verzweigungskomplexität, ne.......

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Offenlegungen

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Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch NIH-Stipendien HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
20Gx25mm PrecisionGlide-NadelBD305175
24-Well-ZellkulturplatteCostar3562
35 mm GlasbodenschalenMatTek CorporationP35G-1.5-20-C
Antibiotisch-Antimykotische LösungCellgro30004CI100X
B-27 ErgänzungLife Technologies17504-04450X
ZylinderauskleidungBIO-RAD165-2417
BoraxSigmaB9876
BorsäureSigmaB0252
PatronenhalterBIO-RAD165-2426
Konfokale BildgebungssoftwareNikonEZ-C1Version 3.81b
Konfokales MikroskopNikonTE-2000E
Abdeckung GlasVWR637-137
DilC18(3)Fisher ScientificD282
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Dumont #5 PinzettenWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 PinzettenWorld Precision Instruments14097
F344 Ratte(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
GlukoseVWR101174Y
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
HBSSSigmaH464110X
Helios DiffusionsschirmeBIO-RAD165-2475
Helios Genpistole KitBIO-RAD165-2411
Helios Genpistole SystemBIO-RAD165-2431
HeliumschlauchleitungBIO-RAD165-2412
IriszangeWorld Precision Instruments15914
IrisschereWorld Precision Instruments500216
MethylenchloridFisher ScientificD150-1
NeurobasalmediumLife Technologies21103-049
Neurolucida 360 softwarembf biosciencedendritische Wirbelsäulenanalyse
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldehydSigmaP6148
Poly-L-LysinSigmaP9155
PolyvinylpyrrolidonFisher Scientific5295
ProLong Gold Antifading-ReagenzFisher ScientificP36930Eindeckmedium
Rattenhirnmatrix, 300 - 600 g, koronal, 0,5 mmTed Pella15047
SevofluranMerritt Veterinärbedarf347075
NatriumbicarbonatLife Technologies25080
SuperFrost Plus ObjektträgerFisher Scientific12-550-154%
SpritzensetBIO-RAD165-2421
Tefzel SchlauchBIO-RAD165-2441
Trypsin-EDTALife Technologies15400-054
SchlauchschneiderBIO-RAD165-2422
SchlauchvorbereitungsstationBIO-RAD165-2418
Wolfram M-25 Microcarrier 1.7 & Micro; mBIO-RAD165-2269
Vannas SchereWorld Precision Instruments500086

Referenzen

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  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Dendritische Dornenneuronale RekonstruktionSholl Analysekonfokale MikroskopieDilC18 3 FarbstoffWolfram Mikrocarrier Beads

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