Methodenartikel

Standardisierte histomorphometrische Bewertung von Osteoarthritis in einem chirurgischen Mausmodell

DOI:

10.3791/60991

⸱

6. Mai 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Orthopedic Research and Translational Sciences, Department of Orthopedics and Rehabilitation, Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das aktuelle Protokoll legt eine strenge und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung morphologischer Gelenkveränderungen fest, die mit Arthrose einhergehen. Die Anwendung dieses Protokolls kann bei der Überwachung des Krankheitsverlaufs und der Bewertung therapeutischer Interventionen bei Arthrose von Nutzen sein.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine der häufigsten Gelenkerkrankungen in den Vereinigten Staaten, Arthrose (OA) ist durch fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels gekennzeichnet, vor allem in den Hüft- und Kniegelenken, was zu signifikanten Auswirkungen auf die Mobilität des Patienten und die Lebensqualität führt. Bis heute gibt es keine heilenden Therapien für OA, die in der Lage sind, die Knorpeldegeneration zu verlangsamen oder zu hemmen. Derzeit gibt es eine umfangreiche Reihe von laufenden Forschungen, um OA-Pathologie zu verstehen und neue therapeutische Ansätze oder Wirkstoffe zu entdecken, die OA effizient verlangsamen, stoppen oder sogar umkehren können. Daher ist es entscheidend, einen quantitativen und reproduzierbaren Ansatz zu haben, um OA-assoziierte pathologische Veränderungen im Gelenkknorpel, Synovium und subchondralen Knochen genau zu bewerten. Derzeit, OA Schweregrad und Progression werden in erster Linie mit der Osteoarthritis Research Society International (OARSI) oder Mankin Scoring Systeme bewertet. Trotz der Bedeutung dieser Bewertungssysteme sind sie semiquantitativ und können durch die Subjektivität des Benutzers beeinflusst werden. Noch wichtiger ist, dass sie es nicht schaffen, subtile, aber wichtige Veränderungen im Knorpel während der frühen Krankheitszustände oder frühen Behandlungsphasen genau zu bewerten. Das Protokoll, das wir hier beschreiben, verwendet ein computergestütztes und halbautomatisiertes histomorphometrisches Softwaresystem, um eine standardisierte, strenge und reproduzierbare quantitative Methodik für die Bewertung gemeinsamer Veränderungen in OA zu etablieren. Dieses Protokoll stellt eine leistungsstarke Ergänzung der bestehenden Systeme dar und ermöglicht eine effizientere Erkennung pathologischer Veränderungen im Gelenk.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine der häufigsten Gelenkerkrankungen in den Vereinigten Staaten, OA ist durch fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels gekennzeichnet, vor allem in den Hüft- und Kniegelenken, was zu signifikanten Auswirkungen auf die Patientenmobilität und Lebensqualität1,2,3. Gelenkknorpel ist das spezialisierte Bindegewebe von Diarthrodialgelenken entwickelt, um Reibung zu minimieren, Bewegung zu erleichtern, und Gelenkkompressionaushalten 4. Gelenkknorpel besteht aus zwei Hauptkomponenten: Chondrozyten und extrazelluläre Matrix. Chondrozyten sind spezialisierte, metabolisch aktive Zellen, die eine primäre Rolle bei der Entwicklung, Wartung und Reparatur der extrazellulären Matrix4spielen. Chondrozytenhypertrophie (CH) ist eines der wichtigsten pathologischen Zeichen der OA-Entwicklung. Es zeichnet sich durch erhöhte Zellgröße, verminderte Proteoglykan-Produktion und erhöhte Produktion von Knorpelmatrix-abbauenden Enzymen aus, die schließlich zu Knorpeldegeneration5,6,7führen. Weiterhin spielen pathologische Veränderungen des subchondralen Knochens und des Synoviums des Gelenks eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Progression der OA8,9,10,11,12. Bis heute gibt es keine heilenden Therapien, die Knorpeldegeneration1,2,3,13,14hemmen. So gibt es umfangreiche laufende Forschung, die darauf abzielt, OA Pathologie zu verstehen und neue therapeutische Ansätze zu entdecken, die in der Lage sind, zu verlangsamen oder sogar zu stoppen OA. Dementsprechend besteht ein zunehmender Bedarf an einem quantitativen und reproduzierbaren Ansatz, der eine genaue Bewertung der OA-assoziierten pathologischen Veränderungen im Knorpel, Synovium und subchondralen Knochen des Gelenks ermöglicht.

Derzeit werden OA Schweregrad und Progression in erster Linie mit den OARSI oder Mankin Scoring-Systemen15bewertet. Diese Bewertungssysteme sind jedoch nur semiquantitativ und können durch die Subjektivität des Benutzers beeinflusst werden. Noch wichtiger ist, dass sie es versäumen, subtile Veränderungen, die während der Krankheit oder als Reaktion auf genetische Manipulation oder eine therapeutische Intervention auftreten, genau zu bewerten. Es gibt sporadische Berichte in der Literatur, die histomorphometrische Analysen des Knorpels, Synoviums oder subchondralen Knochens16,17,18,19,20,21beschreiben. Ein detailliertes Protokoll für eine rigorose und reproduzierbare histomorphometrische Analyse all dieser Gelenkkomponenten fehlt jedoch noch, was einen unerfüllten Bedarf vor Ort erzeugt.

Um pathologische Veränderungen in OA mit hilfe histomorphometrischer Analyse zu untersuchen, verwendeten wir ein chirurgisches OA-Mausmodell, um OA durch Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) zu induzieren. Unter den etablierten Modellen der murinen OA, DMM wurde für unsere Studie ausgewählt, weil es einen weniger traumatischen Mechanismus der Verletzung22,23,24,25,26umfasst. Im Vergleich zu Meniskal-Bänderverletzungen (MLI) oder vorderen Kreuzbandverletzungen (ACLI) fördert DMM eine allmählichere Progression von OA, ähnlich der OA-Entwicklung beim Menschen22,24,25,26. Mäuse wurden zwölf Wochen nach der DMM-Operation eingeschläfert, um Veränderungen im Gelenkknorpel, subchondralen Knochen und Synovium zu bewerten.

Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten, strengen und quantitativen Ansatz zur Bewertung gemeinsamer Änderungen zu etablieren, die OA begleiten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwölf Wochen alte männliche C57BL/6 Mäuse wurden von Jax Labs gekauft. Alle Mäuse wurden in Gruppen von 3–5 Mäusen pro Mikroisolatorkäfig in einem Raum mit einem 12 h hell/dunklen Zeitplan untergebracht. Alle tierischen Eingriffe wurden gemäß dem Leitfaden des National Institute of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der Pennsylvania State University genehmigt.

1. Posttraumatisches Arthrose (PTOA) chirurgisches Modell

  1. Anästhesisieren Sie Mäuse mit einer Ketamin (100 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) Kombination über intraperitoneale Injektion, verabreichen Sie Buprenorphin (1 mg/kg) über intraperitoneale Injektion zur Schmerzlinderung und rasieren Sie das Haar über dem Knie. Prüfen Sie, ob ein Pedalreflex fehlt, bevor Sie mit der Operation beginnen.
  2. Führen Sie eine Destabilisierung der medialen Meniskusoperation (DMM) durch, wie zuvor beschrieben22,23.
    HINWEIS: Bitte beachten Sie Glasson et al. und Singh et al. Referenzen für detailliertere chirurgische Protokollinformationen22,23.
    1. Machen Sie einen 3 mm Längsschnitt von der distalen Patella zum proximalen Tibialplateau des rechten Kniegelenks. Verwenden Sie eine Naht, um die Patellasehne zu verdrängen.
    2. Öffnen Sie die Gelenkkapsel medial zur Sehne und bewegen Sie das infrapatellare Fettpolster, um die interkondylarRegion, den medialen Meniskus und das Meniskotibialband23zu visualisieren.
    3. Transect das mediale Meniskotibialband, um DMM zu vervollständigen und das Gelenk zu destabilisieren22,23. Schließen Sie die Einschnittstelle mit Heftklammern oder Nähten.
  3. Führen Sie Scheinoperationen nach einem ähnlichen Verfahren durch, jedoch ohne Transektion des medialen Meniskotibialbandes.
    HINWEIS: Mäuse wurden randomisiert, um entweder DMM oder Scheinchirurgie zu erhalten. Nach der zuvor veröffentlichten Literatur entwickeln Mäuse signifikante PTOA 12 Wochen nach der DMM-Operation22,23,24.

2. Maus-Euthanasie und Probensammlung

  1. Maus-Euthanasie
    1. Zwölf Wochen nach DMM, anästhesieren Mäuse mit einem Ketamin (100 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) Kombination durch intraperitoneale Injektion.
    2. Machen Sie einen Mittellinienschnitt durch die Haut entlang des Thorax und ziehen Sie den Rippenkäfig zurück, um das Herz für perfusionsfixierungfreizulegen 27.
      HINWEIS: Weitere Informationen zum Protokoll zur korrekten Nagetierfixierung sowie zur Videodarstellung der richtigen Geräteanordnung und der Verfahren finden Sie in der Gage et al.-Referenz27.
    3. Richten Sie das Perfusionsgerät gemäß dem Herstellerprotokoll ein.
    4. Euthanisieren Sie die Maus, indem Sie heparinisierte Saline durch die linke Herzkammer durchdringen, bis das Blut ausgelöscht wird und die Leber blass wird. Durchdringen Sie die Maus mit 10% neutral gepuffertem Formalin, bis eine vollständige Mausfixierung erreicht ist.
      HINWEIS: Eine erfolgreich durchfundierte Maus wird steif. Die durchschnittliche Durchblutungszeit mit dem automatisierten Pumpensystem beträgt 5–7 min.
  2. Probenentnahme und -zubereitung
    1. Isolieren Sie die Knie, indem Sie den Knochen bei Mid-Femur und Mid-Tibia schneiden und sezieren Sie das umgebende Muskelgewebe.
    2. Setzen Sie die Fixierung fort, indem Sie kniegelenke in 10% neutral gepuffertem Formalin bei Raumtemperatur für 24 h und dann bei 4 °C für 6 Tage lagern.
    3. Entkalken Sie den Knochen, indem Sie die Probe in EDTA Entkalkungspuffer für 1 Woche bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln28lagern. Ändern Sie die Entkalkungspufferlösung alle 3 Tage.
      HINWEIS: Der Entkalkungspuffer wurde durch Lösen von 140 g reinem EDTA-Tetranatrium in einer Lösung von 850 ml destilliertem Wasser plus 15 ml Eisessigsäure hergestellt. Der Puffer wurde durch tropfenweise Zugabe von Eisessigsäure zur Lösung auf 7,6 ausgeglichen. Bei Erreichen des pH=7,6 wurde der Puffer mit destilliertem Wasser auf 1 L Gesamtvolumen gebracht. Der Entkalkungspuffer wurde frisch zubereitet und innerhalb von 1 Woche nach der Zubereitung verwendet.
    4. Waschen Sie die Knie mit 50% Ethanol, dann 70% Ethanol für je 15 min, dann Prozess für die Einbettung.
      HINWEIS: Die Flüssigkeitstransferverarbeitung wurde vom Molecular and Histopathology Core am Penn State Milton S. Hershey Medical Center durchgeführt. Den Histologie-Kern der Institution finden Sie im Histologie-Kern der Institution, um Empfehlungen für eine optimale Probenverarbeitung zu erhalten.
    5. Die Mausknie in Paraffin mit dem medialen Aspekt des Gelenks mit Blick auf die untere Oberfläche des Paraffinblocks einbetten. Tragen Sie während der Einbettung leichten Druck auf die tibiale Seite des Gelenks auf, um sicherzustellen, dass die tibialen und femoralen Oberflächen so nah wie möglich an derselben Ebene sind.

3. Mikrotome Schnitt- und Diaauswahl

  1. Mikrotome-Sektionierung
    1. Verwenden Sie die Ebenenverstellknöpfe am Blockhalter des Mikrotomes, um die richtige Verkleidung des Probenblocks zu gewährleisten.
    2. Stellen Sie sich dem Paraffinblock, so dass der distale Aspekt des Oberschenkelknochens, die proximale Region der Tibia und die vorderen und hinteren Hörner des medialen Meniskus in derselben Ebene für die Schnittsammlung erscheinen (Ergänzende Abbildung 1A). Beginnen Sie mit dem Sammeln von Abschnitten auf Dias, wenn sich die vorderen und hinteren Hörner des medialen Meniskus voneinander zu trennen beginnen.
    3. Stellen Sie sicher, dass Tibia, Oberschenkelknochen und Meniszien in derselben Ebene erscheinen, indem Sie Die Strukturgrößen vergleichen. Die Tibia und der Oberschenkelknochen sollten von vergleichbarer Größe sein, wobei beide Meniskalhörner in Größe und Form ähnlich sind(Zusatzabbildung 1A). Wenn eine Struktur im Vergleich zu ihrem Gegenstück zu groß erscheint, bedeutet dies, dass zusätzliche Verkleidungerforderlicher erforderlich sind. Wichtig ist, bestätigen, dass der Gelenkraum intakt bleibt.
    4. Nehmen Sie sagittale Abschnitte der paraffin-eingebetteten Mausknie durch das mediale Gelenkfach in 5 m Abschnitten und sammeln Sie die Abschnitte auf Dias. Sammeln Sie etwa 30 Abschnitte pro Paraffinblock.
  2. Folienauswahl
    1. Wählen Sie für jede Probe ab dem fünften Abschnitt (d. h. die Folien 5, 15 und 25) drei repräsentative Abschnitte im Abstand von 50 m aus. Ausgewählte Folien werden für die nachfolgende Färbung, OARSI-Bewertung und histomorphometrische Analyse verwendet.
      HINWEIS: Wählen Sie aus einem Block mit insgesamt 30 Abschnitten Folien vom Anfang (Folien 5–10), Mitte (Folien 15–20) und Ende (Folien 25–30) des Sets aus, um das gesamte Sample klar darzustellen. Wählen Sie Folien aus ähnlichen Tiefenzwischenbeispielen aus.

4. Hämatoxylin, Safranin Orange und Fast Green Färbung

  1. Deparaffinisieren Sie die ausgewählten Folien mit drei Xyloländerungen. Hydratieren Sie die Rutschen mit zwei Veränderungen von 100% Ethanol, zwei Veränderungen von 95% Ethanol und einer Änderung von 70% Ethanol.
  2. Die Dias mit Hämatoxylin für 7 min färben und dann 10 min mit fließendem Wasser waschen. Mit Fast Green für 3 min färben und 1,0% Eisessigsäure für 10 s ausspülen. Mit Safranin-O für 5 min färben und durch Eintauchen von 0,5% Eisessig in 0,5% eissäureschnell abspülen.
  3. In zwei Wechseln des destillierten Wassers gleitet und die Luft trocknen lässt.
  4. Klare Dias in drei Xylolwechseln für jeweils 5 min und dann mit xylolbasierten Montagemedien und einem Coverslip montieren.
    HINWEIS: Hämatoxylin dient als nuklearer Fleck zur Identifizierung von Knochenmarkbereichen. Safranin-O wird verwendet, um Knorpel, Proteoglykane, Mucin und Mastzellgranulat zu färben. Fast Green wird als Gegenfleck für Knochen verwendet.

5. Dia-Bildgebung

  1. Stellen Sie die Safranin-O- und Fast Green-Buntdias mit einer verfügbaren Kamera ab, die an ein Mikroskop und eine computergestützte Bildgebungssoftware angeschlossen ist.
  2. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware (siehe Tabelle der Materialien) und ordnen Sie den Kniegelenksbereich von Interesse (ROI) in der Mitte des Bildgebungsfensters an. Wenn Sie eine Rotationsmikroskop-Schiebestufe verwenden, richten Sie den Schlitten so aus, dass sich die tibiale Oberfläche über die Breite der horizontalen Achse des Bildbereichs erstreckt.
  3. Legen Sie den Weißabgleich der Kamera fest, bevor Sie mit dem Abbild einer Reihe von Beispielen beginnen (Ergänzende Abbildung 2). Stellen Sie das Gelenkfach bei 4x und 10x Vergrößerung vor, um sicherzustellen, dass sowohl die tibiale als auch die femorale Gelenkoberfläche und der tibiale subchondrale Knochen in jedem Bild ROIs enthalten sind (Ergänzende Abbildung 1A, B). Speichern Sie Bilder für jede der drei ausgewählten Ebenen, die für die OARSI-Bewertung verwendet werden sollen.
    HINWEIS: Das Einstellen des Weißabgleichs der Kamera hängt von der verwendeten Software und Kamerasystemen ab. Navigieren Sie im Allgemeinen zur Registerkarte Kamera oder zum Hauptimaging-Menü, und scrollen Sie nach unten, um Weißabgleich festzulegen. Wählen Sie Weißabgleich festlegen und ein kleiner Cursor oder ein Symbol sollte angezeigt werden (Ergänzende Abbildung 2A). Wählen Sie mit dem Cursor einen Bereich innerhalb des Bildes/Samples aus, der frei von Flecken ist, z. B. den Gelenkraum, um den Weißabgleich festzulegen.

6. Osteoarthritis Forschungsgesellschaft international (OARSI) erzielte15

  1. Randomisieren Sie die drei ausgewählten Safranin-O- und Fast Green-Buntdias aus allen Proben.
  2. Führen Sie OARSI Scoring in einer blinden Weise mit drei Beobachtern. Zeigen Sie kurz ein Bild nach dem anderen in einer randomisierten Reihenfolge an, und lassen Sie drei Beobachter jedes Bild bewerten, das mit einer der drei für jede Stichprobe ausgewählten Ebenen korreliert.
    HINWEIS: Detaillierte Beschreibungen der Benotungsskala15finden Sie in der OARSI-Bewertungstabelle .
  3. Berechnen Sie die durchschnittliche Punktzahl für jeden Abschnitt mithilfe einzelner Partituren von jedem Beobachter. Bestimmen Sie die durchschnittliche Punktzahl pro Stichprobe, indem Sie die durchschnittliche Punktzahl der drei repräsentativen Abschnitte ermitteln.

7. Histomorphometrische Analyse

HINWEIS: Live-Bilder des Kniegelenks werden auf einem Touchscreen-Monitor mit einer Mikroskopkamera betrachtet, und ein Stift wird verwendet, um die ROIs manuell zu verfolgen. Integrierte Algorithmen der Histomorphometrie-Software quantifizieren die angegebenen Parameter (siehe Protokoll unten) in den definierten ROIs. Wichtig ist, dass die gleichen Safranin-O- und Fast Green-Gebeiffabschnitte, die in der OARSI-Bewertung verwendet werden, für die histomorphometrische Analyse verwendet werden.

  1. Software-Einrichtung und Messvorbereitung
    1. Schalten Sie Mikroskop, Kamera, Computer und Touchscreen-Monitor ein. Klicken Sie auf das Software-Symbol, um das Softwareprogramm zu starten. Platzieren Sie die Folie zur Betrachtung auf der Mikroskopbühne.
    2. Zentrieren Sie die Probe innerhalb des Messfensters. Stellen Sie sicher, dass das Messraster auf die richtige Vergrößerung eingestellt ist, um dem am Mikroskop verwendeten Objektiv zu entsprechen (Ergänzende Abbildung 3).
    3. Gehen Sie auf die Registerkarte Datei oben auf dem Bildschirm und scrollen Sie nach unten zu Leseeinstellungen. Öffnen Sie das Fenster Einstellungen, und wählen Sie die entsprechende Einstellungsdatei für die zu messenden Parameter aus.
    4. Wählen Sie den zu messenden Parameter aus der Liste auf der rechten Seite des Bildschirms aus (Ergänzende Abbildung 3). Verwenden Sie den Stift oder Mauszeiger, um Bilder gemäß den unten beschriebenen Schritten zu verfolgen, um bestimmte Gewebe-ROIs zu messen. Wenn Sie mit jeder Messung abgeschlossen sind, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Messung zu beenden und mit dem nächsten Parameter fortzufahren.
      HINWEIS: Die Liste der zu messenden Parameter wird durch eine eindeutige Präferenzdatei erstellt, die in Absprache mit dem Softwareunternehmen zum Zwecke der Messung der beschriebenen ROIs erstellt wird. Weitere Informationen zum kompletten Setup finden Sie in der Diskussion.
    5. Führen Sie alle Messungen aus, und navigieren Sie dann zur Registerkarte Zusammenfassungsdaten am unteren Rand des Softwarebildschirms(ergänzende Abbildung 3). Klicken Sie auf das Bildschirmfenster, drücken Sie die Einfügetaste auf der Tastatur oder kopieren Sie die Daten und fügen Sie sie in eine separate Kalkulationstabelle ein.
      HINWEIS: Führen Sie eine histomorphometrische Analyse in einer randomisierten und geblendeten Weise durch. Nach Abschluss aller Parametermessungen für alle Proben organisieren Sie die Daten und durchschnittlich die Messungen aus den drei Dias aus jeder Probe.
  2. Messungen der gesamten, verkalkten und unkalkulierten Knorpelbereiche
    HINWEIS: Verwenden Sie eine handelsübliche Software (siehe Materialtabelle), um diese Schritte auszuführen. In der ergänzenden Abbildung 1B, C finden Sie Erläuterungen zu Knorpelregionen, Kreuzungen und subchondralen Knochenregionen, die in diesem Abschnitt behandelt werden.
    1. Zeichnen Sie eine Linie über den oberen Rand der tibialen Knorpeloberfläche, wo der Knorpel auf den Gelenkraum trifft. Zeichnen Sie eine zweite Linie an der chondro-osseous Kreuzung, wo der verkalkte Knorpel trifft die subchondralen Knochen (Abbildung 1B). Verwenden Sie Area die Software Area-Funktion, um automatisch die Gesamtknorpelflächenmessung zu erhalten.
    2. Zeichnen Sie eine Linie entlang der Gezeitenmarke, eine natürlich vorkommende Linie, die die verkalkten und unkalkulierten Knorpelbereiche trennt. Zeichnen Sie eine zweite Linie an der chondro-osseous Kreuzung, wo der verkalkte Knorpel trifft die subchondralen Knochen (Abbildung 1B). Verwenden Sie Area die Software Area-Funktion, um automatisch die verkalkte Knorpelflächenmessung zu erhalten.
    3. Berechnen Sie die unkalkulierte Knorpelfläche, indem Sie die verkalkte Knorpelfläche von der gesamten Knorpelfläche subtrahieren (Abbildung 1B).
  3. Bestimmung der Chondrozytenzahl und des Phänotyps
    1. Erstellen Sie separate Zählfunktionen innerhalb der Einstellungen in der Histomorphometrie-Software, um Matrix-Produzierende und Matrix-nicht-produzierende Chondrozyten zu unterscheiden (Abbildung 1B).
    2. Bestimmen Sie die Anzahl der Matrizen, die Chondrozyten produzieren oder nicht produzieren, indem Sie den Stift verwenden, um einen kleinen Punkt über jedem Chondrozyten zu machen, der den angegebenen Phänotyp ausdrückt (Abbildung 1B).
      ANMERKUNG: Zählen Sie Zellen nach ihrem Phänotyp als entweder Matrix produzierende (d. h. starke Safranin-O-Färbung) oder Matrix nicht produzierend (d. h. sehr schwach oder keine Safranin-O-Färbung).
  4. Messung des tiialen Gelenkoberflächenumfangs
    1. Messen Sie den absoluten tiialen Gelenkoberflächenumfang, indem Sie eine Linie über die Oberfläche des tiialen Knorpels verfolgen und dabei individuelle Vorhofflimmern sorgfältig definieren (Abbildung 1C).
    2. Zeichnen Sie eine zweite Linie entlang des Gezeitenzeichens, um als interne Kontrolle für die Ebene jedes Abschnitts zu dienen (Abbildung 1C).
    3. Berechnen Sie den tibialen Gelenkoberflächenflimmerindex, indem Sie den tibialen Gelenkoberflächenumfang durch den Gezeitenumkreis dividieren.
      HINWEIS: Tidemark-Perimeter sind in der Regel in stichprobenartig gleich, sodass der Unterschied in den Gelenkoberflächenperimetern zwischen Schein und DMM im Allgemeinen gering war, unabhängig davon, ob ein absoluter Perimeter- oder Fibrillationsindex verwendet wurde.
  5. Messung der subchondralen Knochen- und Markraumbereiche
    1. Messen Sie die subchondrale Mmarkraumfläche mithilfe der Area-Funktion, indem Sie Regionen in der subchondralen Region, die nur mit Hämatoxylin befleckt sind (d. h. negativ für Fast Green), um die Gesamtmarkraumfläche innerhalb des subchondralen Knochens zu bestimmen. Zeichnen Sie Linien um den Umfang dieser Bereiche, um die Gesamtfläche des gesamten Markraums innerhalb des tibialen subchondralen Knochens zu bestimmen (Abbildung 2B).
    2. Messen Sie die gesamte subchondrale Fläche anhand der Flächenfunktion, indem Sie den Bereich zwischen dem chondro-osseous-Knoten und der oberen Grenze der Wachstumsplatte umreißen und sich seitlich auf die Regionen der vorderen und hinteren Osteophyten erstrecken (Abbildung 2B).
    3. Berechnen Sie den subchondralen Knochenbereich, indem Sie den subchondralen Knochenmarkraumbereich von der gesamten subchondralen Fläche subchondral subchondral subchondral subchondral subtrahieren (Abbildung 2B,C).
  6. Messung der vorderen und hinteren Osteophytenbereiche
    1. Um den Osteophytenbereich zu messen, verfolgen Sie die vorderen und hinteren Osteophyten der proximalen Tibia mit der Area-Funktion (Abbildung 2B,E,F).
      HINWEIS: Osteophyten sind knöcherne Projektionen, die sich zwischen dem Gelenkknorpel und der Wachstumsplatte, vorder oder hinter der subchondralen Region bilden. Osteophytenbereiche an den vorderen und hinteren Seiten der Tibia werden bestimmt, indem der Bereich vorder oder hinter dem subchondralen Knochen nachverfolgt wird. Die Kreuzung zwischen den Osteophyten und dem subchondralen Knochen wird durch eine Zelllinie, die sich vom Gelenkknorpel bis zur Wachstumsplatte erstreckt, deutlich abgegrenzt. Die Verbindung zwischen Osteophyt und Synovium wird durch einen Übergang zwischen knöchernem und faserigem Gewebe definiert.
  7. Messung der Synovialdicke
    1. Messen Sie die vordere femorale Area Synovialdicke mit der Area-Funktion, indem Sie eine Linie von der inneren Einfügemarke des vorderen Synoviums auf dem Oberschenkelknochen in Richtung seines Befestigungspunkts auf dem Meniskus zeichnen (Abbildung 3B).
    2. Zeichnen Sie eine zweite Linie von der äußeren Einfügung des Synoviums auf dem Oberschenkelknochen in Richtung seiner Befestigung am Meniskus (Abbildung 3B).
    3. Berechnen Sie die Synovialdicke, indem Sie die gesamte Synovialfläche durch den Synovialumfang dividieren.

8. Statistische Analyse

  1. Sammeln Sie die gemessenen Parameter und durchschnittlich die Ergebnisse aus den drei repräsentativen Abschnitten für jede Probe. Analysieren Sie die Daten mithilfe eines nicht gepaarten Schüler-T-Tests, um zwei Gruppen oder eine einseitige ANOVA zu vergleichen, um drei oder mehr Gruppen zu vergleichen.
  2. Zeigen Sie die Daten als Mittelwert an, Standardfehler des Mittelwerts.
    ANMERKUNG: Die statistische Signifikanz wurde bei p 0,05 erreicht.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DMM-induzierte OA führt zu Gelenkknorpeldegeneration und Chondrozytenverlust
DMM-induzierte OA führte zu einem erhöhten OARSI-Score im Vergleich zu Scheinmäusen, die sich deutlich durch Oberflächenerosion und Knorpelverlust auszeichneten (Abbildung 1A,D). Das hier beschriebene Histomorphometrieprotokoll hat mehrere OA-assoziierte Veränderungen festgestellt, darunter eine Abnahme der gesamten Knorpelfläche und des unkalkulierten Knorpelbereichs (

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jüngste Arthrose Forschung hat unser Verständnis des Crosstalk zwischen den verschiedenen Geweben innerhalb des Gelenks und die Rolle jedes Gewebes bei der Krankheitseinleitung oder Progression8,9,10,35,36verbessert. Daher ist es offensichtlich geworden, dass sich die Bewertung von OA nicht auf die Analyse des Knorpels beschränken sollte, sondern auch die Anal...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten die Unterstützung des Personals der Abteilung für Vergleichende Medizin und des Kerns der Molekular- und Histopathologie am Penn State Milton S. Hershey Medical Center würdigen. Finanzierungsquellen: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10% gepuffertes FormalinphosphatFisher ChemicalSF100-20Für die Probenfixierung nach der Ernte
Essigsäure, eiskalt (zertifiziert A.C.S.)Fisher ChemicalA38S-212Für die Entkalkung Vorbereitung von Puffern und Essigsäurelösungen für die Färbung
Cintiq 27QHD Creative Pen DisplayWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchFür histomorphometrische Analysen und Bildgebung
Cintiq Ergo StativWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchFür histomorphometrische Analysen und Bildgebung
Ethylendiamintetraessigsäure, Tetranatriumsalzdihydrat, 99%Acros OrganicsAC446080010Für die Entkalkung Puffervorbereitung
Schneller grüner FarbstoffSIGMA Life SciencesF7258Für die Probenfärbung
Fisherbrand Superfrost Plus ObjektträgerFisher12-550-15Für die Entnahme
von ProbenschnittenHistoPrep XylolFisherbrandHC-700-1GALFür die Probenentparrafinisierung und -färbung
Histosette II Gewebekassetten - Kombination aus Deckel und BodenFisher15-182-701AFür die Probenverarbeitung und Einbettung
HP Z440 WorkstationHPArtikelnummer: Y5C77US#ABAFür histomorphometrische Analyse und Bildgebung
Manuelles RotationsmikrotomLeicaRM 2235Für Schneiden von Proben
MarkierstifteLeica3801880Für die Etikettierung von Proben, Kassetten und Objektträgern
OLYMPUS BX53 MikroskopOLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/Für histomorphometrische Analysen und Bildgebung
OLYMPUS DP 73 Mikroskop KameraOLYMPUShttps://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/Für histomorphometrische Analysen und Bildgebung (eingestellt)
ORION STAR A211 pH-MessgerätThermo ScientificSTARA2110Für die Entkalkung Vorbereitung von Puffern
OsteoMeasure Software OsteoMetricshttps://www.osteometrics.com/index.htmFür histomorphometrische Messungen und Analysen
Perfusion Zwei automatisierte DruckperfusionssystemeLeicaModell # 39471005Für Maus Knieernte
PRISM 7 SoftwareGraphPadInstitutional Access AccountStatistische Analyse
Safranin-O FärbungSIGMA Life SciencesS8884Für die Probenfärbung
ThinkBoneStage - Rotierender Mikroskoptisch ThinkBone Consulting Inc. - OsteoMetrics (Lieferant)http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.phpFür histomorphometrische Analyse und Bildgebung
Wacom Pro Pen StylusWacomhttps://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touchFür histomorphometrische Analysen und Bildgebung
Weigerts Eisen Hämatoxylin AFisher5029713Für Hämatoxylin-Färbung
Weigerts Eisen Hämatoxylin BFisher5029714Für Hämatoxylin-Färbung

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
  2. Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
  3. Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
  4. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  5. Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
  6. Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
  7. Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654(2011).
  8. Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
  9. Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632(2016).
  10. Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072(2016).
  11. Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471(2011).
  12. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625(2010).
  13. Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  14. Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
  15. Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  16. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  17. O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
  18. Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
  19. Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
  20. Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
  21. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  22. Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  23. Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
  24. Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413(2014).
  25. Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
  26. Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  28. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
  29. Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
  30. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223(2013).
  31. Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33(2011).
  32. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  33. Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
  34. De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
  35. Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028(2016).
  36. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43(2011).
  37. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  38. Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
  39. Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
  40. Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175(2018).
  41. Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
  42. Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037(2016).
  43. Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
  44. Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Osteoarthritis Mausmodellhistomorphometrische AnalyseMessung der Knorpelfl cheBewertung des subchondralen KnochensQuantifizierung der Osteophytenfl cheBeurteilung der SynovialdickeZ hlung der ChondrozytenanzahlBerechnung des FibrillationsindexDMM induzierte OAquantitative Gelenkbeurteilung

Verwandte Artikel