Standardisierte histomorphometrische Bewertung von Osteoarthritis in einem chirurgischen Mausmodell

Eine der häufigsten Gelenkerkrankungen in den Vereinigten Staaten, OA ist durch fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels gekennzeichnet, vor allem in den Hüft- und Kniegelenken, was zu signifikanten Auswirkungen auf die Patientenmobilität und Lebensqualität^1,2,3. Gelenkknorpel ist das spezialisierte Bindegewebe von Diarthrodialgelenken entwickelt, um Reibung zu minimieren, Bewegung zu erleichtern, und Gelenkkompression^{aushalten 4}. Gelenkknorpel besteht aus zwei Hauptkomponenten: Chondrozyten und extrazelluläre Matrix. Chondrozyten sind spezialisierte, metabolisch aktive Zellen, die eine primäre Rolle bei der Entwicklung, Wartung und Reparatur der extrazellulären Matrix⁴spielen. Chondrozytenhypertrophie (CH) ist eines der wichtigsten pathologischen Zeichen der OA-Entwicklung. Es zeichnet sich durch erhöhte Zellgröße, verminderte Proteoglykan-Produktion und erhöhte Produktion von Knorpelmatrix-abbauenden Enzymen aus, die schließlich zu Knorpeldegeneration^5,6,7führen. Weiterhin spielen pathologische Veränderungen des subchondralen Knochens und des Synoviums des Gelenks eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Progression der OA^8,9,10,11,12. Bis heute gibt es keine heilenden Therapien, die Knorpeldegeneration^1,2,3,13,14hemmen. So gibt es umfangreiche laufende Forschung, die darauf abzielt, OA Pathologie zu verstehen und neue therapeutische Ansätze zu entdecken, die in der Lage sind, zu verlangsamen oder sogar zu stoppen OA. Dementsprechend besteht ein zunehmender Bedarf an einem quantitativen und reproduzierbaren Ansatz, der eine genaue Bewertung der OA-assoziierten pathologischen Veränderungen im Knorpel, Synovium und subchondralen Knochen des Gelenks ermöglicht.

Derzeit werden OA Schweregrad und Progression in erster Linie mit den OARSI oder Mankin Scoring-Systemen¹⁵bewertet. Diese Bewertungssysteme sind jedoch nur semiquantitativ und können durch die Subjektivität des Benutzers beeinflusst werden. Noch wichtiger ist, dass sie es versäumen, subtile Veränderungen, die während der Krankheit oder als Reaktion auf genetische Manipulation oder eine therapeutische Intervention auftreten, genau zu bewerten. Es gibt sporadische Berichte in der Literatur, die histomorphometrische Analysen des Knorpels, Synoviums oder subchondralen Knochens^{16,17,18,19,20,21}beschreiben. Ein detailliertes Protokoll für eine rigorose und reproduzierbare histomorphometrische Analyse all dieser Gelenkkomponenten fehlt jedoch noch, was einen unerfüllten Bedarf vor Ort erzeugt.

Um pathologische Veränderungen in OA mit hilfe histomorphometrischer Analyse zu untersuchen, verwendeten wir ein chirurgisches OA-Mausmodell, um OA durch Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) zu induzieren. Unter den etablierten Modellen der murinen OA, DMM wurde für unsere Studie ausgewählt, weil es einen weniger traumatischen Mechanismus der Verletzung^{22,23,24,25,26}umfasst. Im Vergleich zu Meniskal-Bänderverletzungen (MLI) oder vorderen Kreuzbandverletzungen (ACLI) fördert DMM eine allmählichere Progression von OA, ähnlich der OA-Entwicklung beim Menschen^22,24,25,26. Mäuse wurden zwölf Wochen nach der DMM-Operation eingeschläfert, um Veränderungen im Gelenkknorpel, subchondralen Knochen und Synovium zu bewerten.

Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten, strengen und quantitativen Ansatz zur Bewertung gemeinsamer Änderungen zu etablieren, die OA begleiten.

Zwölf Wochen alte männliche C57BL/6 Mäuse wurden von Jax Labs gekauft. Alle Mäuse wurden in Gruppen von 3–5 Mäusen pro Mikroisolatorkäfig in einem Raum mit einem 12 h hell/dunklen Zeitplan untergebracht. Alle tierischen Eingriffe wurden gemäß dem Leitfaden des National Institute of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der Pennsylvania State University genehmigt.

1. Posttraumatisches Arthrose (PTOA) chirurgisches Modell

1. Anästhesisieren Sie Mäuse mit einer Ketamin (100 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) Kombination über intraperitoneale Injektion, verabreichen Sie Buprenorphin (1 mg/kg) über intraperitoneale Injektion zur Schmerzlinderung und rasieren Sie das Haar über dem Knie. Prüfen Sie, ob ein Pedalreflex fehlt, bevor Sie mit der Operation beginnen.
2. Führen Sie eine Destabilisierung der medialen Meniskusoperation (DMM) durch, wie zuvor beschrieben^22,23.
   HINWEIS: Bitte beachten Sie Glasson et al. und Singh et al. Referenzen für detailliertere chirurgische Protokollinformationen^22,23.
   1. Machen Sie einen 3 mm Längsschnitt von der distalen Patella zum proximalen Tibialplateau des rechten Kniegelenks. Verwenden Sie eine Naht, um die Patellasehne zu verdrängen.
   2. Öffnen Sie die Gelenkkapsel medial zur Sehne und bewegen Sie das infrapatellare Fettpolster, um die interkondylarRegion, den medialen Meniskus und das Meniskotibialband²³zu visualisieren.
   3. Transect das mediale Meniskotibialband, um DMM zu vervollständigen und das Gelenk zu destabilisieren^22,23. Schließen Sie die Einschnittstelle mit Heftklammern oder Nähten.
3. Führen Sie Scheinoperationen nach einem ähnlichen Verfahren durch, jedoch ohne Transektion des medialen Meniskotibialbandes.
   HINWEIS: Mäuse wurden randomisiert, um entweder DMM oder Scheinchirurgie zu erhalten. Nach der zuvor veröffentlichten Literatur entwickeln Mäuse signifikante PTOA 12 Wochen nach der DMM-Operation^22,23,24.

2. Maus-Euthanasie und Probensammlung

1. Maus-Euthanasie
   1. Zwölf Wochen nach DMM, anästhesieren Mäuse mit einem Ketamin (100 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) Kombination durch intraperitoneale Injektion.
   2. Machen Sie einen Mittellinienschnitt durch die Haut entlang des Thorax und ziehen Sie den Rippenkäfig zurück, um das Herz für perfusionsfixierung^{freizulegen 27}.
      HINWEIS: Weitere Informationen zum Protokoll zur korrekten Nagetierfixierung sowie zur Videodarstellung der richtigen Geräteanordnung und der Verfahren finden Sie in der Gage et al.-Referenz²⁷.
   3. Richten Sie das Perfusionsgerät gemäß dem Herstellerprotokoll ein.
   4. Euthanisieren Sie die Maus, indem Sie heparinisierte Saline durch die linke Herzkammer durchdringen, bis das Blut ausgelöscht wird und die Leber blass wird. Durchdringen Sie die Maus mit 10% neutral gepuffertem Formalin, bis eine vollständige Mausfixierung erreicht ist.
      HINWEIS: Eine erfolgreich durchfundierte Maus wird steif. Die durchschnittliche Durchblutungszeit mit dem automatisierten Pumpensystem beträgt 5–7 min.
2. Probenentnahme und -zubereitung
   1. Isolieren Sie die Knie, indem Sie den Knochen bei Mid-Femur und Mid-Tibia schneiden und sezieren Sie das umgebende Muskelgewebe.
   2. Setzen Sie die Fixierung fort, indem Sie kniegelenke in 10% neutral gepuffertem Formalin bei Raumtemperatur für 24 h und dann bei 4 °C für 6 Tage lagern.
   3. Entkalken Sie den Knochen, indem Sie die Probe in EDTA Entkalkungspuffer für 1 Woche bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln²⁸lagern. Ändern Sie die Entkalkungspufferlösung alle 3 Tage.
      HINWEIS: Der Entkalkungspuffer wurde durch Lösen von 140 g reinem EDTA-Tetranatrium in einer Lösung von 850 ml destilliertem Wasser plus 15 ml Eisessigsäure hergestellt. Der Puffer wurde durch tropfenweise Zugabe von Eisessigsäure zur Lösung auf 7,6 ausgeglichen. Bei Erreichen des pH=7,6 wurde der Puffer mit destilliertem Wasser auf 1 L Gesamtvolumen gebracht. Der Entkalkungspuffer wurde frisch zubereitet und innerhalb von 1 Woche nach der Zubereitung verwendet.
   4. Waschen Sie die Knie mit 50% Ethanol, dann 70% Ethanol für je 15 min, dann Prozess für die Einbettung.
      HINWEIS: Die Flüssigkeitstransferverarbeitung wurde vom Molecular and Histopathology Core am Penn State Milton S. Hershey Medical Center durchgeführt. Den Histologie-Kern der Institution finden Sie im Histologie-Kern der Institution, um Empfehlungen für eine optimale Probenverarbeitung zu erhalten.
   5. Die Mausknie in Paraffin mit dem medialen Aspekt des Gelenks mit Blick auf die untere Oberfläche des Paraffinblocks einbetten. Tragen Sie während der Einbettung leichten Druck auf die tibiale Seite des Gelenks auf, um sicherzustellen, dass die tibialen und femoralen Oberflächen so nah wie möglich an derselben Ebene sind.

3. Mikrotome Schnitt- und Diaauswahl

1. Mikrotome-Sektionierung
   1. Verwenden Sie die Ebenenverstellknöpfe am Blockhalter des Mikrotomes, um die richtige Verkleidung des Probenblocks zu gewährleisten.
   2. Stellen Sie sich dem Paraffinblock, so dass der distale Aspekt des Oberschenkelknochens, die proximale Region der Tibia und die vorderen und hinteren Hörner des medialen Meniskus in derselben Ebene für die Schnittsammlung erscheinen (Ergänzende Abbildung 1A). Beginnen Sie mit dem Sammeln von Abschnitten auf Dias, wenn sich die vorderen und hinteren Hörner des medialen Meniskus voneinander zu trennen beginnen.
   3. Stellen Sie sicher, dass Tibia, Oberschenkelknochen und Meniszien in derselben Ebene erscheinen, indem Sie Die Strukturgrößen vergleichen. Die Tibia und der Oberschenkelknochen sollten von vergleichbarer Größe sein, wobei beide Meniskalhörner in Größe und Form ähnlich sind(Zusatzabbildung 1A). Wenn eine Struktur im Vergleich zu ihrem Gegenstück zu groß erscheint, bedeutet dies, dass zusätzliche Verkleidungerforderlicher erforderlich sind. Wichtig ist, bestätigen, dass der Gelenkraum intakt bleibt.
   4. Nehmen Sie sagittale Abschnitte der paraffin-eingebetteten Mausknie durch das mediale Gelenkfach in 5 m Abschnitten und sammeln Sie die Abschnitte auf Dias. Sammeln Sie etwa 30 Abschnitte pro Paraffinblock.
2. Folienauswahl
   1. Wählen Sie für jede Probe ab dem fünften Abschnitt (d. h. die Folien 5, 15 und 25) drei repräsentative Abschnitte im Abstand von 50 m aus. Ausgewählte Folien werden für die nachfolgende Färbung, OARSI-Bewertung und histomorphometrische Analyse verwendet.
      HINWEIS: Wählen Sie aus einem Block mit insgesamt 30 Abschnitten Folien vom Anfang (Folien 5–10), Mitte (Folien 15–20) und Ende (Folien 25–30) des Sets aus, um das gesamte Sample klar darzustellen. Wählen Sie Folien aus ähnlichen Tiefenzwischenbeispielen aus.

4. Hämatoxylin, Safranin Orange und Fast Green Färbung

1. Deparaffinisieren Sie die ausgewählten Folien mit drei Xyloländerungen. Hydratieren Sie die Rutschen mit zwei Veränderungen von 100% Ethanol, zwei Veränderungen von 95% Ethanol und einer Änderung von 70% Ethanol.
2. Die Dias mit Hämatoxylin für 7 min färben und dann 10 min mit fließendem Wasser waschen. Mit Fast Green für 3 min färben und 1,0% Eisessigsäure für 10 s ausspülen. Mit Safranin-O für 5 min färben und durch Eintauchen von 0,5% Eisessig in 0,5% eissäureschnell abspülen.
3. In zwei Wechseln des destillierten Wassers gleitet und die Luft trocknen lässt.
4. Klare Dias in drei Xylolwechseln für jeweils 5 min und dann mit xylolbasierten Montagemedien und einem Coverslip montieren.
   HINWEIS: Hämatoxylin dient als nuklearer Fleck zur Identifizierung von Knochenmarkbereichen. Safranin-O wird verwendet, um Knorpel, Proteoglykane, Mucin und Mastzellgranulat zu färben. Fast Green wird als Gegenfleck für Knochen verwendet.

5. Dia-Bildgebung

1. Stellen Sie die Safranin-O- und Fast Green-Buntdias mit einer verfügbaren Kamera ab, die an ein Mikroskop und eine computergestützte Bildgebungssoftware angeschlossen ist.
2. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware (siehe Tabelle der Materialien) und ordnen Sie den Kniegelenksbereich von Interesse (ROI) in der Mitte des Bildgebungsfensters an. Wenn Sie eine Rotationsmikroskop-Schiebestufe verwenden, richten Sie den Schlitten so aus, dass sich die tibiale Oberfläche über die Breite der horizontalen Achse des Bildbereichs erstreckt.
3. Legen Sie den Weißabgleich der Kamera fest, bevor Sie mit dem Abbild einer Reihe von Beispielen beginnen (Ergänzende Abbildung 2). Stellen Sie das Gelenkfach bei 4x und 10x Vergrößerung vor, um sicherzustellen, dass sowohl die tibiale als auch die femorale Gelenkoberfläche und der tibiale subchondrale Knochen in jedem Bild ROIs enthalten sind (Ergänzende Abbildung 1A, B). Speichern Sie Bilder für jede der drei ausgewählten Ebenen, die für die OARSI-Bewertung verwendet werden sollen.
   HINWEIS: Das Einstellen des Weißabgleichs der Kamera hängt von der verwendeten Software und Kamerasystemen ab. Navigieren Sie im Allgemeinen zur Registerkarte Kamera oder zum Hauptimaging-Menü, und scrollen Sie nach unten, um Weißabgleich festzulegen. Wählen Sie Weißabgleich festlegen und ein kleiner Cursor oder ein Symbol sollte angezeigt werden (Ergänzende Abbildung 2A). Wählen Sie mit dem Cursor einen Bereich innerhalb des Bildes/Samples aus, der frei von Flecken ist, z. B. den Gelenkraum, um den Weißabgleich festzulegen.

6. Osteoarthritis Forschungsgesellschaft international (OARSI) erzielte¹⁵

1. Randomisieren Sie die drei ausgewählten Safranin-O- und Fast Green-Buntdias aus allen Proben.
2. Führen Sie OARSI Scoring in einer blinden Weise mit drei Beobachtern. Zeigen Sie kurz ein Bild nach dem anderen in einer randomisierten Reihenfolge an, und lassen Sie drei Beobachter jedes Bild bewerten, das mit einer der drei für jede Stichprobe ausgewählten Ebenen korreliert.
   HINWEIS: Detaillierte Beschreibungen der Benotungsskala¹⁵finden Sie in der OARSI-Bewertungstabelle .
3. Berechnen Sie die durchschnittliche Punktzahl für jeden Abschnitt mithilfe einzelner Partituren von jedem Beobachter. Bestimmen Sie die durchschnittliche Punktzahl pro Stichprobe, indem Sie die durchschnittliche Punktzahl der drei repräsentativen Abschnitte ermitteln.

7. Histomorphometrische Analyse

HINWEIS: Live-Bilder des Kniegelenks werden auf einem Touchscreen-Monitor mit einer Mikroskopkamera betrachtet, und ein Stift wird verwendet, um die ROIs manuell zu verfolgen. Integrierte Algorithmen der Histomorphometrie-Software quantifizieren die angegebenen Parameter (siehe Protokoll unten) in den definierten ROIs. Wichtig ist, dass die gleichen Safranin-O- und Fast Green-Gebeiffabschnitte, die in der OARSI-Bewertung verwendet werden, für die histomorphometrische Analyse verwendet werden.

1. Software-Einrichtung und Messvorbereitung
   1. Schalten Sie Mikroskop, Kamera, Computer und Touchscreen-Monitor ein. Klicken Sie auf das Software-Symbol, um das Softwareprogramm zu starten. Platzieren Sie die Folie zur Betrachtung auf der Mikroskopbühne.
   2. Zentrieren Sie die Probe innerhalb des Messfensters. Stellen Sie sicher, dass das Messraster auf die richtige Vergrößerung eingestellt ist, um dem am Mikroskop verwendeten Objektiv zu entsprechen (Ergänzende Abbildung 3).
   3. Gehen Sie auf die Registerkarte Datei oben auf dem Bildschirm und scrollen Sie nach unten zu Leseeinstellungen. Öffnen Sie das Fenster Einstellungen, und wählen Sie die entsprechende Einstellungsdatei für die zu messenden Parameter aus.
   4. Wählen Sie den zu messenden Parameter aus der Liste auf der rechten Seite des Bildschirms aus (Ergänzende Abbildung 3). Verwenden Sie den Stift oder Mauszeiger, um Bilder gemäß den unten beschriebenen Schritten zu verfolgen, um bestimmte Gewebe-ROIs zu messen. Wenn Sie mit jeder Messung abgeschlossen sind, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Messung zu beenden und mit dem nächsten Parameter fortzufahren.
      HINWEIS: Die Liste der zu messenden Parameter wird durch eine eindeutige Präferenzdatei erstellt, die in Absprache mit dem Softwareunternehmen zum Zwecke der Messung der beschriebenen ROIs erstellt wird. Weitere Informationen zum kompletten Setup finden Sie in der Diskussion.
   5. Führen Sie alle Messungen aus, und navigieren Sie dann zur Registerkarte Zusammenfassungsdaten am unteren Rand des Softwarebildschirms(ergänzende Abbildung 3). Klicken Sie auf das Bildschirmfenster, drücken Sie die Einfügetaste auf der Tastatur oder kopieren Sie die Daten und fügen Sie sie in eine separate Kalkulationstabelle ein.
      HINWEIS: Führen Sie eine histomorphometrische Analyse in einer randomisierten und geblendeten Weise durch. Nach Abschluss aller Parametermessungen für alle Proben organisieren Sie die Daten und durchschnittlich die Messungen aus den drei Dias aus jeder Probe.
2. Messungen der gesamten, verkalkten und unkalkulierten Knorpelbereiche
   HINWEIS: Verwenden Sie eine handelsübliche Software (siehe Materialtabelle), um diese Schritte auszuführen. In der ergänzenden Abbildung 1B, C finden Sie Erläuterungen zu Knorpelregionen, Kreuzungen und subchondralen Knochenregionen, die in diesem Abschnitt behandelt werden.
   1. Zeichnen Sie eine Linie über den oberen Rand der tibialen Knorpeloberfläche, wo der Knorpel auf den Gelenkraum trifft. Zeichnen Sie eine zweite Linie an der chondro-osseous Kreuzung, wo der verkalkte Knorpel trifft die subchondralen Knochen (Abbildung 1B). Verwenden Sie Area die Software Area-Funktion, um automatisch die Gesamtknorpelflächenmessung zu erhalten.
   2. Zeichnen Sie eine Linie entlang der Gezeitenmarke, eine natürlich vorkommende Linie, die die verkalkten und unkalkulierten Knorpelbereiche trennt. Zeichnen Sie eine zweite Linie an der chondro-osseous Kreuzung, wo der verkalkte Knorpel trifft die subchondralen Knochen (Abbildung 1B). Verwenden Sie Area die Software Area-Funktion, um automatisch die verkalkte Knorpelflächenmessung zu erhalten.
   3. Berechnen Sie die unkalkulierte Knorpelfläche, indem Sie die verkalkte Knorpelfläche von der gesamten Knorpelfläche subtrahieren (Abbildung 1B).
3. Bestimmung der Chondrozytenzahl und des Phänotyps
   1. Erstellen Sie separate Zählfunktionen innerhalb der Einstellungen in der Histomorphometrie-Software, um Matrix-Produzierende und Matrix-nicht-produzierende Chondrozyten zu unterscheiden (Abbildung 1B).
   2. Bestimmen Sie die Anzahl der Matrizen, die Chondrozyten produzieren oder nicht produzieren, indem Sie den Stift verwenden, um einen kleinen Punkt über jedem Chondrozyten zu machen, der den angegebenen Phänotyp ausdrückt (Abbildung 1B).
      ANMERKUNG: Zählen Sie Zellen nach ihrem Phänotyp als entweder Matrix produzierende (d. h. starke Safranin-O-Färbung) oder Matrix nicht produzierend (d. h. sehr schwach oder keine Safranin-O-Färbung).
4. Messung des tiialen Gelenkoberflächenumfangs
   1. Messen Sie den absoluten tiialen Gelenkoberflächenumfang, indem Sie eine Linie über die Oberfläche des tiialen Knorpels verfolgen und dabei individuelle Vorhofflimmern sorgfältig definieren (Abbildung 1C).
   2. Zeichnen Sie eine zweite Linie entlang des Gezeitenzeichens, um als interne Kontrolle für die Ebene jedes Abschnitts zu dienen (Abbildung 1C).
   3. Berechnen Sie den tibialen Gelenkoberflächenflimmerindex, indem Sie den tibialen Gelenkoberflächenumfang durch den Gezeitenumkreis dividieren.
      HINWEIS: Tidemark-Perimeter sind in der Regel in stichprobenartig gleich, sodass der Unterschied in den Gelenkoberflächenperimetern zwischen Schein und DMM im Allgemeinen gering war, unabhängig davon, ob ein absoluter Perimeter- oder Fibrillationsindex verwendet wurde.
5. Messung der subchondralen Knochen- und Markraumbereiche
   1. Messen Sie die subchondrale Mmarkraumfläche mithilfe der Area-Funktion, indem Sie Regionen in der subchondralen Region, die nur mit Hämatoxylin befleckt sind (d. h. negativ für Fast Green), um die Gesamtmarkraumfläche innerhalb des subchondralen Knochens zu bestimmen. Zeichnen Sie Linien um den Umfang dieser Bereiche, um die Gesamtfläche des gesamten Markraums innerhalb des tibialen subchondralen Knochens zu bestimmen (Abbildung 2B).
   2. Messen Sie die gesamte subchondrale Fläche anhand der Flächenfunktion, indem Sie den Bereich zwischen dem chondro-osseous-Knoten und der oberen Grenze der Wachstumsplatte umreißen und sich seitlich auf die Regionen der vorderen und hinteren Osteophyten erstrecken (Abbildung 2B).
   3. Berechnen Sie den subchondralen Knochenbereich, indem Sie den subchondralen Knochenmarkraumbereich von der gesamten subchondralen Fläche subchondral subchondral subchondral subchondral subtrahieren (Abbildung 2B,C).
6. Messung der vorderen und hinteren Osteophytenbereiche
   1. Um den Osteophytenbereich zu messen, verfolgen Sie die vorderen und hinteren Osteophyten der proximalen Tibia mit der Area-Funktion (Abbildung 2B,E,F).
      HINWEIS: Osteophyten sind knöcherne Projektionen, die sich zwischen dem Gelenkknorpel und der Wachstumsplatte, vorder oder hinter der subchondralen Region bilden. Osteophytenbereiche an den vorderen und hinteren Seiten der Tibia werden bestimmt, indem der Bereich vorder oder hinter dem subchondralen Knochen nachverfolgt wird. Die Kreuzung zwischen den Osteophyten und dem subchondralen Knochen wird durch eine Zelllinie, die sich vom Gelenkknorpel bis zur Wachstumsplatte erstreckt, deutlich abgegrenzt. Die Verbindung zwischen Osteophyt und Synovium wird durch einen Übergang zwischen knöchernem und faserigem Gewebe definiert.
7. Messung der Synovialdicke
   1. Messen Sie die vordere femorale Area Synovialdicke mit der Area-Funktion, indem Sie eine Linie von der inneren Einfügemarke des vorderen Synoviums auf dem Oberschenkelknochen in Richtung seines Befestigungspunkts auf dem Meniskus zeichnen (Abbildung 3B).
   2. Zeichnen Sie eine zweite Linie von der äußeren Einfügung des Synoviums auf dem Oberschenkelknochen in Richtung seiner Befestigung am Meniskus (Abbildung 3B).
   3. Berechnen Sie die Synovialdicke, indem Sie die gesamte Synovialfläche durch den Synovialumfang dividieren.

8. Statistische Analyse

1. Sammeln Sie die gemessenen Parameter und durchschnittlich die Ergebnisse aus den drei repräsentativen Abschnitten für jede Probe. Analysieren Sie die Daten mithilfe eines nicht gepaarten Schüler-T-Tests, um zwei Gruppen oder eine einseitige ANOVA zu vergleichen, um drei oder mehr Gruppen zu vergleichen.
2. Zeigen Sie die Daten als Mittelwert an, Standardfehler des Mittelwerts.
   ANMERKUNG: Die statistische Signifikanz wurde bei p 0,05 erreicht.

DMM-induzierte OA führt zu Gelenkknorpeldegeneration und Chondrozytenverlust
DMM-induzierte OA führte zu einem erhöhten OARSI-Score im Vergleich zu Scheinmäusen, die sich deutlich durch Oberflächenerosion und Knorpelverlust auszeichneten (Abbildung 1A,D). Das hier beschriebene Histomorphometrieprotokoll hat mehrere OA-assoziierte Veränderungen festgestellt, darunter eine Abnahme der gesamten Knorpelfläche und des unkalkulierten Knorpelbereichs (Abbildung 1A,B,E,G); Verringerung der Gesamtzahl der Chondrozyten; und, was wichtig ist, Verlust der Matrix produzierenden Chondrozyten (Abbildung 1H,I). Veränderungen der Gelenkoberfläche, die auf die Schwere der Erosion hindeuten, wurden anhand des Knorpelfibrillationsindex evaluiert. Insgesamt stieg der Fibrillationsindex bei DMM-Mäusen (Abbildung 1C,K,L). Es ist jedoch auch wichtig zu beachten, dass der Fibrillationsindex in der Endphase OA aufgrund der vollständigen Erosion der Knorpeloberfläche, wie im Protokoll erörtert, abnehmen kann. Eine Erhöhung des Fibrillationsindex bedeutet eine Degeneration der Gelenkknorpeloberfläche während der OA-Entwicklung und Progression. Diese Ergebnisse unterstreichen die Fähigkeit des histomorphometrischen Analyseprogramms, pathologische Knorpeländerungen zu erkennen und zu quantifizieren, die die OA-Progression charakterisieren.

Bewertung anderer gemeinsamer Veränderungen in DMM-induzierter OA
OA betrifft andere Gelenkgewebe als den Knorpel, und pathologische Veränderungen in diesen Geweben spielen eine entscheidende Rolle bei der Krankheitsprogression. Hier zeigte die beschriebene histomorphometrische Analysemethode eine Zunahme des subchondralen Knochenbereichs und eine Reduktion des Knochenmarkraums bei DMM-Mäusen (Abbildung 2A–D), was auf subchondrale Knochensklerose29,30hinweist. Sowohl vordere als auch hintere Osteophytenbereiche nahmen auch bei DMM-Mäusen zu (Abbildung 2E,F), was auf eine laufende subchondrale Knochenumgestaltung hindeutet, die als Kompensatormechanismus fungiert, um Veränderungen der Gelenkbelastung an der Stelle der Verletzung zu bewältigen29,30.

Histomorphometrische Analyse des Synoviums zeigte erhöhte Synovialdicke bei DMM-Mäusen (Abbildung 3A–C), was ein typisches Ergebnis einer OA-assoziierten Synovialentzündung und der Diffusion von entzündlichen Zytokinen in den Gelenkraum11,12,31,32,33,34ist.

Analyse der Interuservariabilität zwischen OARSI-Scoring und Histomorphometrie
Abbildung 4A zeigt keine signifikante Interuservariabilität sowohl der histomorphometrischen Analyse des unkalkulierten Knorpelbereichs (Abbildung 4A) als auch des OARSI-Scores (Abbildung 4B). Die histomorphometrische Analyse zeigte jedoch einen extrem geringen mittleren Unterschied zwischen Beobachtern zwischen -0,0001179–0,00120, was zu einer nahezu vollständigen Überlappung der von den drei Beobachtern erzielten Ergebnisse führte, während der mittlere Unterschied zwischen den Beobachtern im OARSI-Score zwischen -0,3–0,3 mit einer deutlichen Abweichung der O1-Werte von O2- und O3-Werten höher war.

Abbildung 1: Histomorphometrie von tibialen Gelenkknorpel und artikulären Chondrozyten-Phänotypen aus Scheinchirurgie und DMM-Mäusen. (A) Tibial Gelenkoberfläche mit Safranin-O/Fast Green gebeizt. (B) Histomorphometrische Analyse wurde verwendet, um die gesamte Knorpelfläche und die verkalkte Knorpelfläche (orange) zu verfolgen. Der Knorpel, der dem Gezeitenbereich überlegen ist, wurde als unkalkulierter Knorpel (grün) berechnet. Matrix produzierende Chondrozyten (weiß) und Matrix nicht produzierende Chondrozyten (Magenta) wurden im unkalkulierten Knorpelbereich gezählt. (C) Der tibiale Gelenkoberflächenumfang wurde gemessen, indem die Gelenkoberfläche (blaue Linie) gefolgt von der Gezeitenmarke (lila Linie) verfolgt wurde, um den Fibrillationsindex zu bestimmen. (D) Der OARSI-Score stieg bei DMM-Mäusen. (E–L) Grafische Darstellung der quantifizierten Knorpelbereiche und Chondrozytenzählungen von Schein- und DMM-Mäusen. Im Vergleich zu Scheinmäusen hatten DMM-Mäuse die gesamte tibiale Knorpelfläche verringert (E), die tibiale verkalkte Knorpelfläche (F), den tibialen unkalkulierten Knorpel (G), die tibiale Gesamtchondrozytenzahl (H), die tibiale Matrix produziert, Chondrozyten, (I) und tibiale Matrix, die keine chondrozyten (J) produziert. Im Vergleich zu Scheinmäusen hatten DMM-Mäuse einen erhöhten tibialen Gelenkoberflächenumfang (K) und einen erhöhten tibialen Gelenkoberflächenflimmerindex (L). Die Bilder wurden mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 und ****P < 0.0001 mit ungepaartem t-Test mit Welch-Korrektur, Werte werden als Mittelwert ausgedrückt. n = 5/Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Histomorphometrie des subchondralen Knochenmarkbereichs und des subchondralen Knochenbereichs von Scheinchirurgie und DMM-Mäusen. (A) TibialArtikulärknorpel und subchonderaler Knochen mit Safranin-O/Fast Green gefärbt. (B) Die subchondralen Knochenmarkbereiche (grün), der subchondrale Knochenbereich (Magenta), der vordere Osteophytenbereich (gelb) und der hintere Osteophytenbereich (grau) wurden mit berechneter Histomorphometrie-Software verfolgt. (C–F) Graphierte histomorphometrische Bereiche zwischen Schein- und DMM-Mäusen. Im Vergleich zu den Scheinmäusen hatten DMM-Mäuse eine erhöhte tibiale subchondrale Knochenfläche (C) und tibial vordere und hintere Osteophytenbereiche (E–F), sowie eine verminderte tibiale subchondrale Knochenmarkfläche im Vergleich zu Scheinmäusen (D). Die Bilder wurden mit 4-facher Vergrößerung aufgenommen. *P < 0.05, **P < 0.01 mit ungepaartem t-Test mit Welch-Korrektur. Die Werte werden als Mittelwert ausgedrückt: SEM; n = 5/Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Histomorphometrie von Synovium aus Scheinchirurgie und DMM-Mäusen. (A) Synovium mit Safranin-O/Fast Green gefärbt. (B) Die Synovialdicke wurde gemessen, indem die vordere meniscofemorale Synovialmembran über den vorderen Aspekt des tibiofemoralen Gelenks (grün) nachverfolgt wurde. (C) Grafische Darstellung von Synovialdickenmessungen mit berechneter Histomorphometrie-Software. DMM-Mäuse hatten eine erhöhte Synovialdicke im Vergleich zu Scheinmäusen. Die Bilder wurden mit der 20-fachen Vergrößerung aufgenommen. P < 0.001 mit ungepaartem t-Test mit Welch-Korrektur werden die Werte als Mittelwert ausgedrückt. n = 5/Gruppe; S = Synovium; F = Oberschenkelknochen; und M = Meniskus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Interuser-Variabilität in der OARSI-Bewertung im Vergleich zur histomorphometrischen Analyse. (A) Unkalkulierte Knorpelflächenmessungen, die mit Hilfe der Histomorphometrie von drei geblendeten Beobachtern (O1, O2, O3) durchgeführt wurden. (B) OARSI-Werte für Schein- und DMM-Mäuse, die von den drei geblendeten Beobachtern erhalten wurden. Die gepunkteten Linien bezeichnen den Mittelwert für jede Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Histologische Analyse von Safranin-O und Fast Green gebeizten Maus-Tibiofemoral-Gelenkabschnitten. (A) Ein 4-faches Vergrößerungsbild des tibiofemoralen Gelenks. Schwerpunkte sind gekennzeichnet. (B) Ein 10-faches Vergrößerungsbild des tibiofemoralen Gelenk-ROI. Die tibialen und femoralen Oberflächen sowie die vorderen und hinteren Meniskalhörner werden visualisiert. Die Menisken sind ungefähr gleich groß und der bildgebende ROI ist auf dem Gelenkfach zentriert. (C) Ein 40-faches Vergrößerungsbild der proximalen tiialen Oberfläche. Die Gezeitenlinie wird als Linie zwischen den unkalzinsierten und verkalkten Knorpelzonen bezeichnet. Die Osteochondrale Kreuzung ist zwischen dem Ende des verkalkten Knorpels und dem Beginn des subchondralen Knochens gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Histomorphometrie-System-Setup und Kamera-Weißabgleich-Kalibrierung. (A) Maus-Tibiofemoral-Gelenk visualisiert bei 4-facher Vergrößerung im Softwarefenster mit Weißabgleich nicht eingestellt. Beachten Sie die Registerkarte Kameraeinstellungen oben auf dem Bildschirm und die Auswahl im Dropdown-Menü, um den Weißabgleich festzulegen. (B) Maus-Tibiofemoralgelenk bei 4-facher Vergrößerung mit Weißabgleich. Beachten Sie die Änderung der Färbung und Färbung der Probe, wodurch die Fähigkeit des Benutzers, bestimmte Bereiche des tibiofemoralen Gelenks bei Messungen zu unterscheiden, erhöht wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Einrichtung histomorphometrischer Software vor histomorphometrischen Analysemessungen. Repräsentativer Screenshot des histomorphometrischen Softwarefensters. Beachten Sie, dass der gebeizte Mauskniebereich im Messbereich zentriert ist (gelbes Raster) und die richtige Vergrößerungsskala für den Bereich entsprechend dem objektiven Ziel ausgewählt ist, das auf dem Mikroskop verwendet wird (rot eingekreist in der oberen rechten Ecke des Bildschirms). Die Liste der Parameter wird in der Spalte rechts vom Bildgebungs- und Messbereich angezeigt. Wenn Sie einen Parameter auswählen, wird der Parameter hervorgehoben, daher wird Tibial Fibrillation derzeit für die Messung ausgewählt. Auf der Registerkarte Zusammenfassungsdaten am unteren Rand des Fensters werden die Messungen für jeden Parameter für jede Stichprobe organisiert und gespeichert, um nach Abschluss jeder Parametermessung für jeden Abschnitt exportiert zu werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

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