Methodenartikel
Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.
Zweidimensionale (2D) Zellkulturen imitieren das In-vivo-Tumorwachstum nicht zufriedenstellend. Daher wurden dreidimensionale (3D) Kultursphäroidmodelle entwickelt. Diese Modelle können im Bereich der Neuroonkologie besonders wichtig sein. Tatsächlich haben Hirntumoren die Tendenz, in die gesunde Gehirnumgebung einzudringen. Wir beschreiben hierin einen idealen 3D-Glioblastom-Sphäroid-basierten Assay, den wir entwickelt haben, um Tumorinvasionen zu untersuchen. Wir stellen ihnen alle technischen Details und Analysewerkzeuge zur Verfügung, um diesen Test erfolgreich durchzuführen.
In den meisten Studien mit primären oder kommerziell erhältlichen Zelllinien werden Assays an Zellen durchgeführt, die auf Kunststoffoberflächen als Monolayer-Kulturen angebaut werden. Das Verwalten der Zellkultur in 2D stellt Nachteile dar, da sie keine in vivo 3D-Zellenumgebung imitiert. In 2D-Kulturen ist die gesamte Zelloberfläche direkt mit dem Medium in Kontakt, verändert das Zellwachstum und verändert die Verfügbarkeit von Medikamenten. Darüber hinaus löst die nichtphysiologische Kunststoffoberfläche die Zelldifferenzierung1aus. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurden dreidimensionale Kulturmodelle entwickelt. Sie haben den Vortei....
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Von allen Patienten (vom Haukeland Hospital, Bergen, Norwegen gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethikkommission) wurde eine schriftliche Schriftliche Zustimmung eingeholt. Unser Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung unserer Institution.
1. Erzeugung von tumorsphäroiden in einheitlicher Größe
HINWEIS: Stem-ähnliche Zellen werden in neurobasalen Medium speziert, ergänzt durch B27-Ergänzung, Heparin, FGF-2, Penicillin und Streptomycin, wie in früheren Artikeln12beschrieben. Diese Zellen bilden spontan Sphäroide in der Kultur.
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Sphäroide wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben vorbereitet und Beobachtungen in Bezug auf Migration, Invasion, Proliferation und Mikroskopie gemacht. Zur Messung der Hypoxie in verschiedenen Bereichen der sphärischen Struktur wurde zur Bestimmung der hypoxischen Aktivität die karboxische Anhydrase IX-Färbung verwendet (Abbildung 1A-C). Weitere CAIX-positive Zellen wurden im Sphäroidzentrum beobachtet (Abbildung 1<.......
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Tumor-Sphäroid-Assays sind gut geeignet, um Tumoreigenschaften wie Proliferation, Invasion und Migration sowie Zelltod und Medikamentenreaktion zu untersuchen. Krebszellen dringen in die 3D-Matrix ein und bilden einen invasiven Mikrotumor, wie in Abbildung 4B,Czu sehen ist. Während des invasiven Prozesses können Matrix-Metalloproteinasen (MMP) Matrizen, die Tumorzellen13umgeben, und MMP-Inhibitoren (z. B. GM6001 oder Rebimastat) die Zellinvasion beein.......
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Diese Arbeit wurde unterstützt von Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon ist Stipendiat des Universitätsklinikums Toulouse (CHU Toulouse).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96 Well Platte mit rundem Boden | Falcon | 08-772-212 | |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Gelagert bei 4 > C, Kugeldissoziationsenzym |
| B27 | Gibco | 12587 | Gelagert bei -20 &de; C, vor Gebrauch auftauen |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Gelagert bei -20 ° C, vor Gebrauch auftauen |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| DPBS 10X | Pan Biotech | P04-53-500 | Gelagert bei 4 ° C |
| Fidschi Software | ImageJ | Wird zur Analyse von Bildern | |
| verwendet Flachmann 75 cm2 | Falcon | 10497302 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | Gelagert bei -20 &/de; C, verdünnt auf eine Endkonzentration von 0,2 mg/ml in kaltem NBM Methylcellulose |
| Sigma | M0512 | Verdünnt in NBM für eine Endkonzentration von 2 % | |
| NBM | Gibco | 21103-049 | Lagerung bei 4 & Grad; C |
| Neurobasales Medium | Gibco | 21103049 | Gelagert bei 4 Grad; C |
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Gelagert bei 4 > C |
| Trypanblau 0,4 | ThermoFisher | T10282 | Wird zur Zellzählung |
| verwendet Typ I Kollagen | Corning 354236 | Gelagert bei 4 & Grad; C |
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