Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

Aditi Upadhye; Melissa Marshall; James  C. Garmey; Timothy  P. Bender; Coleen McNamara

doi:10.3791/61003

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Methodenartikel

Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

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DOI:

10.3791/61003

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31. Mai 2020

Aditi Upadhye¹ , Melissa Marshall² , James C. Garmey² , Timothy P. Bender³ , Coleen McNamara²

¹Department of Microbiology, Immunology, Cancer Biology, University of Virginia, ²Cardiovascular Research Center, University of Virginia, ³Beirne B. Carter Center for Immunology Research, University of Virginia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.

Zusammenfassung

Da die Zellfunktion von Nischen-spezifischen Faktoren in der zellulären Mikroumgebung beeinflusst wird, können Methoden zur Sezieren von Zelllokalisierung und Migration weitere Einblicke in die Zellfunktion liefern. B-1a-Zellen sind eine einzigartige B-Zell-Untergruppe in Mäusen, die schützende natürliche IgM-Antikörper gegen oxidationsspezifische Epitope produzieren, die während Gesundheit und Krankheit entstehen. Die B-1a-Zell-IgM-Produktion unterscheidet sich je nach B-1a-Zellposition, und daher wird es aus therapeutischer Sicht nützlich, die B-1a-Lokalisierung auf Nischen auszurichten, die eine hohe Antikörperproduktion unterstützen. Hier beschreiben wir eine Methode zur gezielten B-1a-Zellmigration in das Knochenmark durch retroviral-vermittelte Überexpression des C-X-C-Motiv-Chemokinrezeptors 4 (CXCR4). Die Geninduktion in primären murinen B-Zellen kann eine Herausforderung darstellen und führt je nach Technik zu niedrigen Transfektionseffizienzen von 10-20%. Hier zeigen wir, dass die retrovirale Transduktion von primären murinen B-1a-Zellen zu einer Transduktionseffizienz von 30-40% führt. Diese Methode nutzt die Adoptivzellübertragung von transduzierten B-1a-Zellen in B-Zell-mangelhafte Empfängermäuse, so dass spender-B-1a-Zellmigration und -lokalisierung visualisiert werden können. Dieses Protokoll kann für andere retrovirale Konstrukte modifiziert werden und kann in verschiedenen funktionellen Assays nach der Adoption verwendet werden, einschließlich der Analyse des Phänotyps und der Funktion von Spenderzellen oder Wirtszellen oder der Analyse von löslichen Faktoren, die nach der B-1a-Zellübertragung abgesondert werden. Die Verwendung von unterschiedlichen Spender- und Empfängermäusen, die nach CD45.1- und CD45.2-Allotyp unterschieden werden, und das Vorhandensein eines GFP-Reporters innerhalb des retroviralen Plasmids könnten auch den Nachweis von Spenderzellen in anderen, immunreichen Mausmodellen ermöglichen, die endogene B-Zellpopulationen enthalten.

Einleitung

Jüngste Studien haben eine beträchtliche Immunzelle, insbesondere B-Zelle, phänotypische und funktionelle Heterogenität in Abhängigkeit von der Zelllokalisierung¹^,²^,³^,⁴^,⁵gezeigt. B-1a-Zellen sind eine solche Population mit heterogener Fähigkeit, schützende IgM-Antikörper zu produzieren; Knochenmark B-1a-Zellen sezernieren IgM konstitutiv und tragen signifikant zu Plasma-IgM-Titers⁶bei, während peritoneale B-1a-Zellen bei Homöostase eine niedrige IgM-Sekretion haben und stattdessen du....