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Methodenartikel

Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

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DOI:

10.3791/61003

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31. Mai 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, Cancer Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Beirne B. Carter Center for Immunology Research, University of Virginia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.

Zusammenfassung

Da die Zellfunktion von Nischen-spezifischen Faktoren in der zellulären Mikroumgebung beeinflusst wird, können Methoden zur Sezieren von Zelllokalisierung und Migration weitere Einblicke in die Zellfunktion liefern. B-1a-Zellen sind eine einzigartige B-Zell-Untergruppe in Mäusen, die schützende natürliche IgM-Antikörper gegen oxidationsspezifische Epitope produzieren, die während Gesundheit und Krankheit entstehen. Die B-1a-Zell-IgM-Produktion unterscheidet sich je nach B-1a-Zellposition, und daher wird es aus therapeutischer Sicht nützlich, die B-1a-Lokalisierung auf Nischen auszurichten, die eine hohe Antikörperproduktion unterstützen. Hier beschreiben wir eine Methode zur gezielten B-1a-Zellmigration in das Knochenmark durch retroviral-vermittelte Überexpression des C-X-C-Motiv-Chemokinrezeptors 4 (CXCR4). Die Geninduktion in primären murinen B-Zellen kann eine Herausforderung darstellen und führt je nach Technik zu niedrigen Transfektionseffizienzen von 10-20%. Hier zeigen wir, dass die retrovirale Transduktion von primären murinen B-1a-Zellen zu einer Transduktionseffizienz von 30-40% führt. Diese Methode nutzt die Adoptivzellübertragung von transduzierten B-1a-Zellen in B-Zell-mangelhafte Empfängermäuse, so dass spender-B-1a-Zellmigration und -lokalisierung visualisiert werden können. Dieses Protokoll kann für andere retrovirale Konstrukte modifiziert werden und kann in verschiedenen funktionellen Assays nach der Adoption verwendet werden, einschließlich der Analyse des Phänotyps und der Funktion von Spenderzellen oder Wirtszellen oder der Analyse von löslichen Faktoren, die nach der B-1a-Zellübertragung abgesondert werden. Die Verwendung von unterschiedlichen Spender- und Empfängermäusen, die nach CD45.1- und CD45.2-Allotyp unterschieden werden, und das Vorhandensein eines GFP-Reporters innerhalb des retroviralen Plasmids könnten auch den Nachweis von Spenderzellen in anderen, immunreichen Mausmodellen ermöglichen, die endogene B-Zellpopulationen enthalten.

Einleitung

Jüngste Studien haben eine beträchtliche Immunzelle, insbesondere B-Zelle, phänotypische und funktionelle Heterogenität in Abhängigkeit von der Zelllokalisierung1,2,3,4,5gezeigt. B-1a-Zellen sind eine solche Population mit heterogener Fähigkeit, schützende IgM-Antikörper zu produzieren; Knochenmark B-1a-Zellen sezernieren IgM konstitutiv und tragen signifikant zu Plasma-IgM-Titers6bei, während peritoneale B-1a-Zellen bei Homöostase eine niedrige IgM-Sekretion haben und stattdessen durch angeborenen mautähnlichen Rezeptor (TLR) oder zytokinvermittelte Signalisierung aktiviert werden können, um sich schnell zu vermehren, zu migrieren und igM7,8,9,10zu sezernieren. B-1a-Zell-IgM-Antikörper erkennen oxidationsspezifische Epitope (OSE), die auf Krankheitserregern, apoptotischen Zellen und oxidierter LDL vorhanden sind, und IgM-Bindung an OSE kann entzündliche nachgeschaltete Signalisierung bei Krankheiten wie Arteriosklerose verhindern11. Daher können Strategien zur Erhöhung der IgM-Produktion durch erhöhung der peritonealen B-1a-Zellmigration zu Orten wie dem Knochenmark therapeutisch nützlich sein. Jedoch, Es ist wichtig, dass solche Strategien gezielt und zellspezifisch sind, da Off-Target-Effekte die Immunfunktion oder Gesundheit negativ beeinflussen können.

Hier beschreiben wir eine Methode zur gezielten und langfristigen Überexpression von CXCR4 in primären murinen B-1a-Zellen und nachfolgender Adoptivübertragung zur Visualisierung der Zellmigration und der funktionellen IgM-Antikörperproduktion (Abbildung 1). Die genetische Manipulation von primären B-Zellen wird durch niedrige Transfektionseffizienzen im Vergleich zur Transfektion transformierter Zelllinien eingeschränkt. Da transformierte Zelllinien jedoch erheblich von den Primärzellen12,13abweichen können, ist es wahrscheinlich, dass die Verwendung von Primärzellen Ergebnisse liefert, die sich stärker an der normalen Physiologie ausrichten. Mehrere Techniken wurden für den Gentransfer in primären murinen B-Zellen beschrieben, einschließlich retroviraler Transduktion, adenoviraler Transduktion, Lipofektion oder elektroporationsbasierter Transfektion, die unterschiedliche Effizienz, Vergänglichkeit und Auswirkungen auf die Zellgesundheit haben13,14,15. Die folgende Methode nutzte die retrovirale Transduktion, da sie eine ausreichende Genübertragungseffizienz von >30 % bei minimaler Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit ergab. Das CXCR4-exezierende Retrovirus wurde mit dem zuvor beschriebenen retroviralen Konstrukt murinen Stammzellvirus-internen ribosomalen Eintrag site-greenescent Protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, in das das Maus-CXCR4-Gen 4 subkloniert4wurde. MigR1 (Control(Ctl)-GFP) und CXCR4-GFP retrovirale Partikel wurden mit Calciumphosphattransfektion erzeugt, wie in den zuvor veröffentlichten Protokollen4,14beschrieben.

Erfolgreich transduzierte B-1a-Zellen wurden dann intravenös in lymphozyten-defizientenRag1-/- Mäusen übertragen. Sowohl Spender- als auch Empfängermäuse enthielten zusätzlich Knockout des Apolipoproteins E (ApoE)-Gens, was zu einer erhöhten OSE-Akkumulation und Arteriosklerose führt und somit ein Modell für die In-vivo-B-1-Zellaktivierung und IgM-Produktion darstellt. Darüber hinaus unterschieden sich Spender- und Empfängermäuse in CD45-Allotyp; Spender-B-1-Zellen stammten von CD45.1+ ApoE-/- Mäusen und wurden in Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- Empfänger übertragen. Dies ermöglichte die Differenzierung von Spender-CD45.1 von Empfänger-CD45.2-B-Zellen nach der Übertragung, ohne dass b-Zellmarker während der Durchflusszytometrieanalyse zusätzlich gefärbt werden mussten. Die hier bereitgestellten Ergebnisse zeigen, dass die gezielte CXCR4-Überexpression auf B-1a-Zellen mit einer erhöhten Fähigkeit von B-1a-Zellen zur Migration in das Knochenmark assoziiert, was mit erhöhtem Plasma-Anti-OSE-IgM assoziiert. Darüber hinaus bieten wir ein Verfahren zur Anreicherung von peritonealen B-1-Zellen durch negative Selektion an und demonstrieren die Anforderung der B-1-Zellaktivierung für eine effiziente Transduktion. Diese Methode kann für andere retrovirale Konstrukte angepasst werden, um die Wirkung der Proteinüberexpression auf die B-1a-Zellmigration, den Phänotyp oder die Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus könnte die Verwendung von CD45.1 im Vergleich zu CD45.2-Allotyp-Unterscheidung theoretisch den Transfer in andere immunausreichende murine Modelle ermöglichen, die endogene B-Zellen enthalten.

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Protokoll

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Virginia genehmigt.

1. Magnetische Trennung und Anreicherung von peritonealen B-1-Zellen

  1. Euthanisieren Sie eine 12-14 Wochen alte, männliche, CD45.1+ApoE-/- Maus mit CO2.
  2. Machen Sie einen oberflächlichen Schnitt in den Bauch mit geraden chirurgischen Schere und schälen Sie rücken Die Haut mit gebogenen Schere, um die Peritonealwand auszusetzen. Unterspülen Sie die Peritonealhöhle mit 10 ml 37 °C RPMI-1640 Medium mit einer 10 ml Spritze und einer 25 G Nadel. Schütteln Sie die Maus, um Zellen zu lösen, indem Sie den Schwanz greifen und die Mausseite gründlich für 15-20 s bewegen.
    HINWEIS: Die Massierung des lavaged Peritoneumkannes kann auch die Zellwiederherstellung maximieren.
  3. Sammeln Sie Peritonealflüssigkeit mit einer 10 ml Spritze und 25 G Nadel, indem Sie Flüssigkeit an der unteren rechten Seite des Peritoneums knapp über dem Niveau der Hüfte, in der Nähe des Darms. Vermeiden Sie die Störung epidydimaler Fettdepots und der darunter liegenden Organe. Vermeiden Sie das Ziehen von Flüssigkeit von der linken Seite der Maus, da das Omentalfett leicht in die Spritze gezogen werden kann.
  4. Sobald 6 x 7 ml Flüssigkeit gesammelt ist, in ein 50 ml kegelförmiges Rohr auf Eis gelegt geben. Als nächstes heben Sie die Maus vertikal, indem Sie die Peritonealwand mit Zangen über dem Zwerchfell halten, so dass die verbleibende Flüssigkeit am Boden der Peritonealhöhle verbleibt. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Peritonealwand mit chirurgischen Scheren über der Leber (stellen Sie sicher, nicht die Leber zu schneiden) und sammeln Sie alle verbleibenden Peritonealflüssigkeit mit einer Glaspipette und Glühbirne.
  5. Peritoneale Auswaschzellen aus allen CD45.1+ApoE-/- Mäusen (n = 15-20) in 50 ml konische Röhren bündeln und auf Eis lagern.
    HINWEIS: Zur Berechnung der Anzahl der benötigten Mäuse: B-1a-Zellen machen 5 bis 10 % der gesamten Peritonealpopulation aus und ergeben etwa 2,5 x 5 x 105 B-1a-Zellen pro Maus in den Händen der Autoren. Die Transduktionseffizienz liegt bei 30 bis 40 %, wie unten gezeigt.
  6. Zählen Sie lebende Zellen mit einem Lebensfähigkeitsfarbstoff wie Trypanblau und Hämozytometer (Proben 1:5 in Trypanblau verdünnen und 10 l in die Hämozytometerkammer laden). Poolzellen mit bis zu 1 x 108 Zellen pro Tube. Zentrifugenzellen bei 400 x g für 5 min bei 4 °C, dann Aspirat Überstand.
  7. Bis zu 1 x 108 Zellen in 1 ml Anti-CD16/CD32-Antikörper (Materialtabelle) 1:50 im Assaypuffer verdünnt (1x Phosphat gepufferte Kochstoffkochin [PBS], 0,5% Rinderserumalbumin [BSA], 2 mM EDTA), um Fc-Rezeptoren zu blockieren. Skalieren Sie je nach Bedarf basierend auf der Zellanzahl. 10 min bei 4 °C auf Eis bebrüten.
  8. Bereiten Sie eine 2x Master-Mischung der biotinylierten Antikörper (Tabelle 1) im Assay-Puffer für die Erschöpfung vor. Der 2x Master Mix berücksichtigt das Volumen der Flüssigkeit, in der sich die Zellen bereits beim Inkubieren mit Anti-CD16/CD32 befinden. Wenn beispielsweise Zellen in 500 L verdünnter Anti-CD16/CD32 brüten, fügen Sie 500 L 2x Master-Mix hinzu, der 10 l biotinylierte Ter119-, Gr-1-, CD23- und NK1.1-Antikörper enthält, und 25 l biotinylierten F4/80-Antikörpern, um die in Tabelle 1angegebenen Endkonzentrationen zu erreichen. 2x Master-Mix zu den Zellen geben und 20 min bei 4 °C färben.
  9. Waschzellen mit 5 ml Assaypuffer und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und Aspiratüberstand.
  10. Resuspend und inkubieren Zellen mit Anti-Biotin-Mikroperlen (Tabelle der Materialien) im Assay-Puffer gemäß der vom Hersteller empfohlenen Konzentration und Protokoll verdünnt.
  11. Mit 5 ml Assaypuffer und Zentrifuge bei 400 x g 5 min bei 4 °C waschen. Aspirieren Sie Überstand und resuspendieren Sie bis zu 1 x 108 Zellen in 500 l Assaypuffer.
  12. Prime magnetische Auswahlsäulen (Materialtabelle) mit 3 ml Assaypuffer. Übertragen Sie Zellen auf grundierte magnetische Selektionssäulen und sammeln Sie das Eluent, das angereicherte B-1-Zellen enthält, in einem 15 ml konischen Rohr auf Eis. Waschen Sie die magnetische Selektionssäule mit zusätzlichem Assaypuffer, bis das gesammelte Gesamtvolumen 10 ml beträgt.
    ANMERKUNG: Ein Aliquot der vorgereinigten und nachgereinigten Zellfraktionen sollte separat durch Durchflusszytometrie zur Reinigung der Effizienz durch Färbung von CD19+ B-Zellen, F480+ Makrophagen und CD5+ T-Zellen analysiert werden, wie in Abbildung 2dargestellt.
  13. Zählen Sie die postgereinigte Zellfraktion (das Eluent, das angereicherte B-1-Zellen enthält) durch Zählen lebender Zellen gemäß Schritt 1.6, und bei 1 x 106 Zellen/ml im B-Zellkulturmedium (RPMI-1640, 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum [FBS], 10 mM HEPES, 1x nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 50 g/ml Gentamicin, 55 m-Mercaptoethanol)

2. Peritoneale B-1-Zellstimulation

  1. Split gepoolte Zellen für die beiden transduced Bedingungen (Ctl-GFP und CXCR4-GFP), während beiseite und beschichtungen mindestens 10 x 106 Zellen für eine nicht-transduced Steuerung.
  2. Platte bis zu 150 l (150.000 Zellen) pro Well in 96-well Rundbodenplatten.
  3. Fügen Sie 100 nM TLR9 Agonist ODN1668 zu allen Brunnen hinzu, um die Zellproliferation zu stimulieren.
  4. Inkubieren für 16-18 h bei 37 °C, 5%CO2.

3. Retrovirale Transduktion von Peritoneal-B-Zellen

  1. Generieren Sie ctl-GFP (MigR1) und CXCR4-GFP retrovirale Partikel mit Calciumphosphattransfektion, wie in den zuvor veröffentlichten Protokollen14beschrieben.
    HINWEIS: Dies wird mehrere Tage dauern, also bereiten und titer retrovirale Bestände und speichern Aliquots bei -80 °C vor Dem Start dieses Protokolls.
  2. Tauen Retrovirus-Bestände auf Eis. Verwenden Sie sofort und nicht wieder einfrieren, da Virus-Titer während des Frost-Tau-Zyklen deutlich abnimmt. Fügen Sie den Zellen ctl-GFP oder CXCR4-GFP retrovirale Überstandmittel bei 20:1 Infektionsvielfalt (MOI) in Gegenwart von 8 g/ml Polybren und frischem Mercaptoethanol bei einer Endkonzentration von 55 m hinzu. Fügen Sie den Zellen, die für die nicht-transduced Kontrolle vorgesehen sind, keine virusischen Bestände hinzu.
  3. Führen Sie die Spritzinfektion durch Zentrifugieren von Platten bei 800 x g für 90 min bei Raumtemperatur durch.
  4. Inkubieren Platten mit Retrovirus bei 37 °C, 5%CO2 für zusätzliche 3 h.
  5. Stammzellen in frischem B-Zellmedium ernten und neu probandieren und bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht inkubieren.

4. Zellsortierung von transduzierten peritonealen B-1a-Zellen

  1. Ernten Sie kultivierte Zellen und bündeln Sie in drei separate 50 ml konische Röhren für jede Bedingung: nicht transduced, Ctl-GFP transduced und CXCR4-GFP transduced.
  2. Zählen Sie lebende Zellen wie in Schritt 1.6, dann Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und Aspirat überstand.
  3. Resuspend Zellen bei 100.000 Zellen/L im Sortierpuffer (PBS + 1% BSA) mit 1:50 Anti-CD16/CD32 Antikörper (Tabelle der Materialien), um Fc-Rezeptoren zu blockieren. 10 min bei 4 °C auf Eis bebrüten.
  4. Aliquot-Zellen für Kompensationskontrollen (30.000 Zellen pro Kompensationskontrolle): für ungefärbte und einzelne Fleckenkontrollen, die aus nicht transduced Proben aliquot werden, und für GFP-Einzelfleckenkontrolle, die aus transduzierten Proben aliquot.
    HINWEIS: Kommerziell erhältliche Kompensationsperlen können alternativ für einzelne Fleckenkontrollen verwendet werden, wenn die nicht transducierte Zellnummer niedrig ist.
  5. Bereiten Sie einen 2x Antikörper-Master-Mix vor, der die fluorophorkonjugierten Antikörper im Sortierpuffer enthält (Tabelle 1). Fügen Sie den 2x Master-Mix nicht transduced, CTL-GFP transduced und CXCR4-GFP transduced Samples hinzu. Fügen Sie einzelne Antikörper zu einzelnen Fleckenkontrollen hinzu. 20 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
    HINWEIS: Der 2x Master-Mix berücksichtigt das Volumen der Flüssigkeit, in der sich die Zellen bereits bei der Inkubation mit Anti-CD16/CD32 befinden, wie in Schritt 1.8. Ein Aliquot von Zellen aus jeder Bedingung kann separat für CXCR4 gebeizt werden, um die CXCR4-Überexpression zu bestätigen.
  6. Proben mit 1 ml Sortierpuffer waschen und durch 70 m Filter in Polypropylen-Rohre abziehen.
  7. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C und Aspirat-Überstand. Resuspend Proben bei 50.000 Zellen / L im Sortierpuffer.
  8. Vor der Zellsortierung präzierte fluoreszenzaktivierte Zellsortierungs-Röhrchen (FACS) mit 1 ml Sammelmedium (RPMI-1640, 20% hitzeinaktiviertes FBS, 10 mM HEPES, 1x nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 50 g/ml Gentamicin, 55 m -M-Mercaptoethanol) für jede zu sortierende Population.
  9. Vor dem Ausführen von Proben auf dem Zellsortierer fügen Sie 2x DAPI (vorbereitet als 1:5000 Verdünnung im Sortierpuffer) für die Diskriminierung toter Zellen hinzu.
  10. Sortieren Sie GFP+ B-1a-Zellen in FACS-Röhren, die ein Sammelmedium als DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ Zellen aus den Proben CTL-GFP und CXCR4-GFP enthalten. Verwenden Sie das nicht transduced Sample, um das GFP+-Gate einzustellen und DAPI- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+ nicht transduced B-1a-Zellen zu sortieren.
    HINWEIS: Alternativ können nicht transducierte Zellen auch aus den CTL-GFP- und CXCR4-GFP-Proben sortiert werden, indem B-1a-Zellen innerhalb der GFP-Fraktion getrennt gekreuzt werden. Transduced oder nicht-transduced B-1b-Zellen können auch mit dieser Sortierstrategie als DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5- Zellen sortiert werden.

5. Adoptivtransfer

  1. Zentrifugenzellen bei 400 x g bei 5 min bei 4 °C und Aspiratüberstand bei 4 °C vorsichtig ansaugen.
  2. Resuspend Zellen in kaltsterilen 1x PBS bei 1.000 Zellen/L.
  3. Anästhetisieren Sie männliche Rag1-/- ApoE-/- Mäuse mit Isofluran und injizieren Sie 100 l (100.000 Zellen) pro Maus mittels intravenöser retroorbitaler oder Schwanzveneninjektion mit einer ultrafeinen Insulinspritze. Injizieren Sie ein paar Mäuse mit 1x PBS als Steuerung.

6. Quantifizierung von Spenderzellen und Plasma IgM

  1. Analysieren Sie zum gewünschten Zeitpunkt nach der Adoption übertragene Zellen in Empfängermäusen nach Knochenmark und Milzgewebe Ernte4 und Durchflusszytometrie. Quantifizieren Sie die Lokalisierung der Spenderzellen und die CXCR4-Überexpression durch Färbung für CD45.1, CD45.2 und CXCR4, und analysieren Sie die Ergebnisse der Durchflusszytometrie mithilfe einer Software wie Flowjo.
    HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Antikörper, die in diesem Schritt verwendet werden. Achten Sie darauf, kein Antikörperkonjugat zu verwenden, das fluoreszenz im FITC-Kanal als GFP auf transduzierten Spenderzellen vorhanden ist.
  2. Isolieren Sie das Plasma, indem Sie 10 l 0,5 M EDTA zu Vollblut hinzufügen, das zum Zeitpunkt der Tieropfer durch Herzpunktion gesammelt wurde. Zentrifugieren Sie Vollblut bei 7.000 x g und Aliquotplasma in separate 1,5 ml Zentrifugenröhren. Bei -80 °C speichern, bis die Analyse von sezernierten Faktoren wie IgM von ELISA4durchgeführt wird.

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Ergebnisse

Eine Übersicht über das Protokoll finden Sie in Abbildung 1. Abbildung 2 zeigt die Anreicherung von peritonealen B-1a-Zellen nach magnetischer Erschöpfung anderer Peritonealzelltypen. Lebende Singletzellen in der Post-Depletion-Fraktion haben einen größeren Anteil an CD19+ B-Zellen im Vergleich zu F4/80+ Makrophagen, fehlen CD5hi CD19- T-Zellen und enthalten eine erhöhte Frequenz von CD19+ CD5-Mittel-B-1a-Zellen im Ver...

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Diskussion

Die hier angebotene Methode ermöglicht eine stabile und relativ effiziente primäre B-1a-Zellgenabgabe, in vivo-Adoptivübertragung sowie die Identifizierung und Lokalisierung der injizierten Zellen. Zellen konnten 17 Wochen nach der Zellübertragung nachgewiesen und eine erhöhte CXCR4-Expression beibehalten werden. Retrovirus-vermittelte Abgabe ergab 30-40% Transduktionseffizienz der primären murinen B-1a-Zellen mit minimalen Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit in unseren Händen (Abbildung 4e

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Project 3 von P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) und R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye wurde von American Heart Association Pre-Doctoral Fellowship 16PRE30300002 und 5T32AI007496-20 unterstützt. Wir danken Joanne Lannigan, Mike Solga und Claude Chew von der University of Virginia Flow Cytometry Core für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
70 Mikron FilterkappenFalcon352235
Anti-Biotin-MikrokügelchenMiltenyi Biotec130-090-485
Anti-CD16/CD32 oder Fc-BlockLife TechnologiesMFCR00
B220 APCeBioscience17-0452-83Klon: RA3-6B2
Beta-MercaptoethanolGibco21985-023
CD19 APCef780eBioscience47-0193-82Klon: eBio1D3
CD23 BiotineBioscience13-0232-81Klon: B3B4
CD23 PECy7eBioscience25-0232-82Klon: B3B4
CD3e BiotineBioscience13-0033-85Klon: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- MäuseN/AN/AGezüchtet im Haus
CD45.1 PerCP-Cy5.5BD Biosciences560580Klon: A20
CD45.2 BV421BD Biosciences562895Klon: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- MäuseN/AN/AGezüchtet im Haus
CD5 PEeBioscience12-0051-83Klon: 53-7.3
Ctl-GFP RetrovirusN/AN/AHaus erzeugt mit dem GFP-exprimierenden retroviralen Plasmid MigR1, zur Verfügung gestellt von Dr. T.P. Bender
CXCR4 APCeBioscience17-9991-82Klon: 2B11
CXCR4-GFP RetrovirusN/AN/AEigens erzeugt durch Klonierung von Maus CXCR4 in das retrovirale MigR1-Plasmid
F4/80 BiotinLife TechnologiesMF48015Klon: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6Treestar Inc.Lizenz erforderlich
GentamicinGibco15710-064
Gr-1 BiotineBioscience13-5931-82Klon: RB6-8C5
hitzeinaktiviertes fötales RinderserumGibco16000-044
HEPESGibco15630-080
IgM PECF594BD Biosciences562565Klon: R6-60.2
InsulinspritzenBD Biosciences329461
IsofluranHenry Schein Animal Health029405
Lebend/tot GelbLife TechnologiesL34968
LS SäulenMiltenyi Biotec130-042-401
NK1.1 BiotinBD Biosciences553163Klon: PK136
Nicht-essentielle AminosäurenGibco11140-050
ODN 1668InvivoGentlrl-1668
PBSGibco14190-144
RPMI-1640Gibco11875-093
NatriumpyruvatGibco11360-070
Ter119 BiotineBioscience13-5921-82Klon: Ter119
Im

Referenzen

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