Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Summary

Wir haben einen kommerziell erhältlichen Östrogenrezeptor β Reporter-Assays für das Screening menschlicher und nichtmenschlicher Primatennahrung auf östrogene Aktivität optimiert. Wir validierten diesen Test, indem wir zeigten, dass die bekannten östrogene soja-Lebensmittel hoch registriert sind, während andere Lebensmittel keine Aktivität aufweisen.

Abstract

Pflanzen sind eine Nahrungsquelle für viele Tiere, und sie können Tausende von Chemikalien produzieren. Einige dieser Verbindungen beeinflussen physiologische Prozesse in den Wirbeltieren, die sie verbrauchen, wie endokrine Funktion. Phytoöstrogene, die am besten untersuchten endokrin-aktiven Phytochemikalien, interagieren direkt mit der Hypothalamo-Hypophysen-Gonadenachse des endokrine Systems der Wirbeltiere. Hier stellen wir die neuartige Verwendung eines zellbasierten Assays vor, um Pflanzenextrakte auf das Vorhandensein von Verbindungen zu überprüfen, die östrogene biologische Aktivität haben. Dieser Assay verwendet Säugetierzellen, die entwickelt wurden, um Östrogenrezeptor-Beta (ER) hoch auszudrücken und die mit einem Luziferase-Gen transfiziert wurden. Die Exposition gegenüber Verbindungen mit östrogener Aktivität führt dazu, dass die Zellen Licht produzieren. Dieser Test ist eine zuverlässige und einfache Möglichkeit, auf biologische östrogene Aktivität zu testen. Es hat mehrere Verbesserungen gegenüber transienten Transfektionstests, vor allem, Benutzerfreundlichkeit, die Stabilität der Zellen und die Empfindlichkeit des Assays.

Introduction

Pflanzen sind eine notwendige Nahrungsquelle für viele Tiere und liefern Kalorien und Nährstoffe, die für Überleben, Fortpflanzung, Wachstum, Entwicklung und Verhalten entscheidend sind¹. Pflanzen produzieren Tausende von Chemikalien, viele als Anpassungen für ihr eigenes Wachstum, stomatische Wartung und Reproduktion. Andere Verbindungen, als pflanzliche Sekundärmetaboliten (PSMs), haben Funktionen, die weniger klar sind, obwohl einige toxisch sind und wahrscheinlich als Schutz gegen Kraut und Parasitismus (z. B. Alkaloide, Tannine)^2,3verwendet werden. Einige dieser Chemikalien haben die Fähigkeit, langfristige physiologische Prozesse bei Tieren zu beeinflussen, wie endokrine Funktion, obwohl, warum diese endokrin-aktiven Phytochemikalien mit dem Wirbeltier endokrinsystem interagieren ist noch unklar^2,4.

Phytoöstrogene, die am besten untersuchten endokrin-aktiven Phytochemikalien, sind polyphenolische PSMs, die Östrogene strukturell und funktionell imitieren und direkt mit der Hypothalomo-Hypophysen-Gonadenachse des endokrine Wirbeltiersystems interagieren⁵. Die Einnahme von Phytoöstrogenen in der menschlichen Ernährung ist mit dem Schutz gegen einige Krebsarten, Herzerkrankungen und Wechseljahrssymptome verbunden, obwohl andere Effekte Fruchtbarkeitsprobleme umfassen. Tatsächlich wurden die physiologischen Wirkungen dieser Verbindungen in den 1940er Jahren entdeckt, als Unfruchtbarkeit bei Schafen auf ihre Beweidung auf phytoöstrogenreichem Klee (Trifolium subterrareum)⁶zurückgeführt wurde. Bei der Verunstaltung können Phytoöstrogene in Zellen übergehen und die Wirkung von Östrogen imitieren. Während Phytoöstrogene negative Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit von Schafen hatten, ist die Beziehung zwischen Phytoöstrogenen und Physiologie nicht einfach. Wie Schafe zeigen südliche weiße Nashörner empfindlichkeit gegenüber östrogenen Verbindungen in Futtermitteln, die aus hohen Mengen an Soja und Luzerne gewonnen werden. Töchter von Frauen, die diese Diät während der Schwangerschaft gefüttert werden, sind weniger wahrscheinlich,⁷zu reproduzieren. Jedoch, andere Studien haben gezeigt, dass Phytoöstrogene können auch positive Effekte haben, einschließlich reifung der Eierstockfollikel bei älteren Mäusen⁸, Prävention bestimmter Krebsarten, antioxidative Aktivität, und antiproliferative Effekte⁹.

Die Breite der Wirkung von Phytoöstrogenen sind nicht überraschend, da Östrogene eine breite Palette von biologischen Funktionen beeinflussen, einschließlich Wachstum, Entwicklung, und Regulierung der reproduktiven und zentralen Nervensysteme¹⁰. Obwohl es viele Wirkmechanismen gibt, Phytoöstrogene haben oft die Fähigkeit, Östrogen-Signalisierung durch ihre Fähigkeit, als Liganden für die intranuklearen Östrogen-Rezeptoren Alpha und Beta (ER) zu modifizieren, zu verbessern oder zu stören. Viele Phytoöstrogene haben eine phenolische Ringstruktur ähnlich wie Östrogene, die es ihnen ermöglicht, Östrogenrezeptoren zu binden. Diejenigen mit agonistischer östrogener Aktivität funktionieren wie Östrogen und bilden einen aktivierten ER-Ligand-Komplex, der an ein Östrogen-Antwortelement (ERE) dimerieren und binden kann und die Gentranskription¹¹auslösen kann. So, Östrogene und Phytoöstrogene regulieren Zellaktivität und Systemfunktionen durch ihre Aktionen als Transkriptionsfaktoren.

Hier stellen wir die neuartige Verwendung eines zellbasierten Assays vor, um Pflanzenextrakte auf das Vorhandensein von Verbindungen zu überprüfen, die östrogene biologische Aktivität haben. Dieser Test verwendet chinesische Hamster-Ovarial-CHO-Zellen, die entwickelt wurden, um ER hoch auszudrücken, die mit der Galle (Photinus pyralis) Luziferase-Gen in Verbindung mit einem ERE-Promotor¹²transfiziert wurden. Wenn östrogene Verbindungen vorhanden sind, binden sie an den ER, dimerisieren und binden an die ERE, was zur Transkription des Luziferase-Gens führt. Nach Zugabe einer Substratlösung katalysiert die Luziferase eine Reaktion, die zur Photonenemission führt. Daher produzieren positive Proben leichte und negative Proben nicht.

Dieser kommerziell erhältliche Assay eliminiert die Notwendigkeit für Laboratorien, die Säugetierzellen mit dem Reportergen und dem Östrogenrezeptor^13,14zu transfekieren, was instabil und variabel in der Wirksamkeit war. Der Assay bietet eine stabile Transfektionsplattform, die es ermöglicht, schnell und einfach zu bestimmen, ob eine Pflanze über Rezeptorbindung östrogene Aktivität hat.

Wir testen die Hypothese, dass Sojabohnen eine höhere östrogene Aktivität haben als alle anderen Lebensmittel angesichts ihrer bekannten Konzentrationen von östrogeneisofen¹⁵ mit menschlichen Lebensmitteln von lokalen Lebensmittelhändlern.

Protocol

1. Herstellung von Pflanzenmaterialien

1. Einfrieren von trockenen Pflanzenartikeln, die frisch mit einem Lyophilizer gesammelt wurden.
   1. Um Proben vor Licht zu schützen, decken Sie Kammern mit Aluminiumfolie während des Trocknungsprozesses ab.
   2. Um sicherzustellen, dass die Proben vollständig trocken sind, lyophilisieren, bis sich die Kammern nicht mehr kalt anfühlen und Pflanzenmaterialien beim Wiegen nicht mehr an Masse verlieren.
   3. Trockene Pflanzen in sterilen Säcken mit geringem Rückstand lagern, wenn bis zum Mahlen kein Licht entsteht.
2. Fein schleifen von Proben mit einer Schleifmühle mit 0,85 mm Maschensieb.
   1. Bewahren Sie die Bodenproben in den Säcken in Abwesenheit von Licht bis zur Extraktion auf.

2. Extraktion von pflanzlichen Sekundärmetaboliten

1. Um die sekundären pflanzlichen Metaboliten zu extrahieren, verwenden Sie ein Verhältnis von 1 g getrockneter Probe zu 10 ml HPLC-Methanol.
   1. Proben auf einer analytischen Waage wiegen und zu einem entsprechend großen Erlenmeyerkolben (125 – 250 ml) hinzufügen. Fügen Sie dann das entsprechende Volumen Methanol hinzu. Zeichnen Sie die Masse der extrahierten Probe auf.
   2. Bedecken Sie die Pflanzen-Methanol-Lösung mit Aluminiumfolie und drehen Sie dann 3 Tage lang bei Raumtemperatur (RT) auf einem Orbital-Shaker mit 100 Umdrehungen bei 100 Umdrehungen, sodass sich die potenziell östrogene Verbindungen in das Methanol auflösen können.
   3. Dekantieren Sie den Überstand mit Filterpapier (125 mm) in ein Tropffiltersystem.
   4. Trocknen Sie den Pflanzenextrakt mit einem Rotationsverdampfer, bis die Probe verdickt, aber gießbar ist, in einem 300 ml Rundbodenkolben. Gießen Sie die Probe in einen 50 ml Rundbodenkolben und spülen Sie den großen Kolben mit einer kleinen Menge Methanol. Trocknen Sie die Probe im kleinen Kolben weiter, bis das Methanol vollständig verdampft ist.
   5. Wiegen Sie den Probenrückstand mit einem analytischen Gleichgewicht. Rekordrückstandmasse.
   6. Den Pflanzenextrakt in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 0,1 g Extrakt auf 2 ml DMSO auflösen. Wirbel bis homogenisiert.
   7. Bewahren Sie die Pflanzenextrakt-DMSO-Lösung bei 4 °C in Bernsteinglasfläschchen bis zum Test auf.

VORSICHT: Pflanzen können unbekannte biologisch aktive Chemikalien herstellen, und DMSO ist ein Fahrzeug, das sie über Zellmembranen transportieren kann. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und Pflege bei der Handhabung dieser Proben.

3. Humaner Östrogenrezeptor β Transfektionstest¹²

HINWEIS: Aseptische Technik und eine laminare Durchflusshaube sind für Tag 1 des Assay-Protokolls erforderlich.

1. Bereiten Sie Verdünnungen von 17-Estradiol für die Standardkurve vor.
   1. Das Cell Recovery Medium und Compound Screening Medium (CSM) aus dem Gefrierlager übertragen und in einem 37 °C-Wasserbad auftauen.
   2. Mikrozentrifugenrohre Zwischen- und 2 (INT1, INT2) und 1-8 beschriften.
   3. Füllen Sie INT1 mit 995 l CSM, INT2 mit 615 l CSM, Tube 1 mit 900 l CSM und Rohre 2-8 mit 600 l CSM. Rohr 8 beiseite stellen.
   4. Übertragen Sie 5 l von 100 m 17-Estradiol-Bestand in INT1. Entsorgen Sie die Spitze. Vortex.
   5. Vor jeder Übertragung pipette 3 mal ausspülen und dann 10 l von INT1 in INT2 übertragen. Entsorgen Sie die Spitze.
   6. Spülen Sie die Pipette 3 Mal, und übertragen Sie dann 100 l von INT2 in Rohr 1. Entsorgen Sie die Spitze. Übertragen Sie 300 l von Rohr 1 in Rohr 2. Wiederholen Sie dies für Rohre 3 bis 7. Entsorgen Sie 300 l aus Rohr 7 in Abfallbehälter. Tube 8 ist eine Null und erhält kein Estradiol. Die Endkonzentrationen der beschichteten Normen sind: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 und 0 pM Estradiol.
2. Bereiten Sie Probenverbindungen vor.
   1. Vortex-Proben.
   2. Nehmen Sie 4 l jeder Pflanzenprobe in DMSO und fügen Sie 496 L CSM hinzu, um eine 0,8% DMSO-Lösung zu ergeben.
3. Schnell auftauen Reporterzellen.
   1. Rufen Sie das Rohr von Cell Recovery Medium aus dem 37 °C-Wasserbad auf. Desinfizieren Sie die Außenfläche mit 70% Ethanol.
   2. Holen Sie Reporterzellen aus -80 °C-Speicherung ab und tauen Sie auf, indem Sie 10 ml des vorgewärmten CRM in die Röhre gefrorener Zellen übertragen.
   3. Schließen Sie die Röhre der Reporterzellen und übertragen Sie sie für 5-10 min in ein 37°C Wasserbad.
   4. Holen Sie sich die Röhre der Reporter Cell Suspension aus dem Wasserbad. Invertieren Sie das Zellrohr mehrmals vorsichtig, um Aggregate von Zellen aufzubrechen und eine homogene Suspension zu erzeugen. Reinigen Sie die Oberfläche des Rohres mit 70% Ethanol.
4. Assay-Beschichtung
   1. Geben Sie 100 l der Reporter Cell Suspension mit einer Mehrkanalpipette in jeden Brunnen.
   2. Geben Sie 100 l Proben in Dreifacharbeit in geeignete Assaybrunnen.
   3. Übertragen Sie die Platte in einen 37 °C, befeuchtet 5% CO2-Inkubator für 22-24 h.
5. Tauenerkennungssubstrat und Detektionspuffer in einem dunklen Kühlschrank über Nacht, um sich auf Tag 2 vorzubereiten.
6. Kurz vor dem Ende der Platteninkubation, entfernen Sie Detektionssubstrat und Detektionspuffer aus dem Kühlschrank und legen Sie sie in einen schwachen Lichtbereich, bis sie mit RT ausgeglichen werden. Einmal bei RT, invertieren Sie jedes Rohr vorsichtig mehrmals, um Lösungen gründlich zu mischen.
   1. Unmittelbar vor Abschluss der Inkubation den gesamten Inhalt des Detektionspuffers in das Rohr des Erkennungssubstrats gießen, um Einfeinerungsreagenz zu erstellen. Mischen Sie sanft, um keinen Schaum zu produzieren.
   2. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, invertieren Sie die Platte, um den Inhalt in einen geeigneten Abfallbehälter zu entsorgen. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte auf ein sauberes, saugfähiges Papiertuch, um die letzten Tröpfchen aus den Brunnen zu entfernen.
   3. Fügen Sie jedem Brunnen 100 L des Luciferase Detection Reagenz hinzu. Lassen Sie die Assayplatte bei RT für 15 min ruhen. Schütteln Sie die Platte nicht.
7. Quantifizieren Sie die Lumineszenz mit einem 96-Well-Plattenlese-Luminometer.

Results

22 Extrakte von Obst und Gemüse, die häufig in der menschlichen Ernährung gefunden wurden, wurden auf das Vorhandensein von östrogene Verbindungen untersucht. Eine Vielzahl von Lebensmitteln wurden assayed, einschließlich Hülsenfrüchte, wie Sojabohnen, Schneeerbsen, und Schnapserbsen, wie die Erbsenfamilie ist eine bekannte Quelle von Phytoöstrogenen¹⁶, sowie Feigen, Datteln, Mais, Karotten, Äpfel, Bananen, Erdbeeren, Tomaten, Grünkohl und Kohl. Endokrine störende Verbindungen finden sich in gängi...

Discussion

Der eR-Reporter-Assay, der entwickelt wurde, um pharmazeutische Wirkstoffe einzeln zu überprüfen, eignet sich auch für das Screening von pflanzlichen Lebensmitteln auf Phytoöstrogene, die biologisch durch die ER aktiv sind. Wichtige Überlegungen im Protokoll sind die behandlung der Pflanzenproben mit Sorgfalt: Frisches Pflanzenmaterial muss schnell getrocknet werden, um Schimmelbildung oder anderen biologischen Abbau zu verhindern, und es muss von Licht ferngehalten werden, um eine Photolyse der Verbindungen zu verhinder...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 &Mikro; L Pipette
20 & Mikro; L Pipette
200 & Mikro; L Pipette
37 ° Wasserbad
37 °, befeuchtet 5 % CO2 Inkubator
70 % Ethanol
Analysenwaage
Zellkultur-bewertete Laminar-Flow-Haube
Dimethylsulfoxid
Einweg-Medienbecken, steriles
Tropffiltrationssystem
Erlenmeyerkolben			125 mL und 250 mL
Methanol
Human ERβ Reporter Assay System, 1 x Assay im 96-Well-Format Indigo	Biosciences	IB00411	Assay-Kit - analysiert 24 Proben plus
, Mehrkanalpipette
Orbitalschüttler
, Plattenablesung, Luminometer,			z. B. Bioteck Synergy HTX
Rotationsverdampfer
Rundkolben			50 mL und 300 mL
sterile Mikrozentrifugenröhrchen oder sterile Mehrkanal-Medienbecken
Sterile Spitzen			200 & micro; L und 1000 µ L
Whatman Grade 1
			sterile Polyethylen-Beutel