Wir haben einen kommerziell erhältlichen Östrogenrezeptor β Reporter-Assays für das Screening menschlicher und nichtmenschlicher Primatennahrung auf östrogene Aktivität optimiert. Wir validierten diesen Test, indem wir zeigten, dass die bekannten östrogene soja-Lebensmittel hoch registriert sind, während andere Lebensmittel keine Aktivität aufweisen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Pflanzen sind eine Nahrungsquelle für viele Tiere, und sie können Tausende von Chemikalien produzieren. Einige dieser Verbindungen beeinflussen physiologische Prozesse in den Wirbeltieren, die sie verbrauchen, wie endokrine Funktion. Phytoöstrogene, die am besten untersuchten endokrin-aktiven Phytochemikalien, interagieren direkt mit der Hypothalamo-Hypophysen-Gonadenachse des endokrine Systems der Wirbeltiere. Hier stellen wir die neuartige Verwendung eines zellbasierten Assays vor, um Pflanzenextrakte auf das Vorhandensein von Verbindungen zu überprüfen, die östrogene biologische Aktivität haben. Dieser Assay verwendet Säugetierzellen, die entwickelt wurden, um Östrogenrezeptor-Beta (ER) hoch auszudrücken und die mit einem Luziferase-Gen transfiziert wurden. Die Exposition gegenüber Verbindungen mit östrogener Aktivität führt dazu, dass die Zellen Licht produzieren. Dieser Test ist eine zuverlässige und einfache Möglichkeit, auf biologische östrogene Aktivität zu testen. Es hat mehrere Verbesserungen gegenüber transienten Transfektionstests, vor allem, Benutzerfreundlichkeit, die Stabilität der Zellen und die Empfindlichkeit des Assays.
Einleitung
Pflanzen sind eine notwendige Nahrungsquelle für viele Tiere und liefern Kalorien und Nährstoffe, die für Überleben, Fortpflanzung, Wachstum, Entwicklung und Verhalten entscheidend sind1. Pflanzen produzieren Tausende von Chemikalien, viele als Anpassungen für ihr eigenes Wachstum, stomatische Wartung und Reproduktion. Andere Verbindungen, als pflanzliche Sekundärmetaboliten (PSMs), haben Funktionen, die weniger klar sind, obwohl einige toxisch sind und wahrscheinlich als Schutz gegen Kraut und Parasitismus (z. B. Alkaloide, Tannine)2,3verwendet werden. Einige dieser Chemikalien haben d....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Herstellung von Pflanzenmaterialien
- Einfrieren von trockenen Pflanzenartikeln, die frisch mit einem Lyophilizer gesammelt wurden.
- Um Proben vor Licht zu schützen, decken Sie Kammern mit Aluminiumfolie während des Trocknungsprozesses ab.
- Um sicherzustellen, dass die Proben vollständig trocken sind, lyophilisieren, bis sich die Kammern nicht mehr kalt anfühlen und Pflanzenmaterialien beim Wiegen nicht mehr an Masse verlieren.
- Trockene Pflanzen in sterilen Säcken mit geringem Rückstand lagern, wenn bis zum Mahlen kein Licht entsteht.
- Fein schleifen von Proben mit einer Schleifmühle mit 0,85 mm Maschensieb.....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
22 Extrakte von Obst und Gemüse, die häufig in der menschlichen Ernährung gefunden wurden, wurden auf das Vorhandensein von östrogene Verbindungen untersucht. Eine Vielzahl von Lebensmitteln wurden assayed, einschließlich Hülsenfrüchte, wie Sojabohnen, Schneeerbsen, und Schnapserbsen, wie die Erbsenfamilie ist eine bekannte Quelle von Phytoöstrogenen16, sowie Feigen, Datteln, Mais, Karotten, Äpfel, Bananen, Erdbeeren, Tomaten, Grünkohl und Kohl. Endokrine störende Verbindungen finden sich in gängi.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Der eR-Reporter-Assay, der entwickelt wurde, um pharmazeutische Wirkstoffe einzeln zu überprüfen, eignet sich auch für das Screening von pflanzlichen Lebensmitteln auf Phytoöstrogene, die biologisch durch die ER aktiv sind. Wichtige Überlegungen im Protokoll sind die behandlung der Pflanzenproben mit Sorgfalt: Frisches Pflanzenmaterial muss schnell getrocknet werden, um Schimmelbildung oder anderen biologischen Abbau zu verhindern, und es muss von Licht ferngehalten werden, um eine Photolyse der Verbindungen zu verhinder.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren danken Dale Leitman für die Erstausbildung in der Verwendung von transienten Transfektions-Assays zur Bestimmung der östrogenen Aktivität von Primatenpflanzen. Vielen Dank an Bradford Westrich und C. Eric Johnson für die Unterstützung bei der Einrichtung von Laborgeräten und der Ausbildung von Studenten in Extraktionsmethoden. Abschließend möchte ich mich bei der Indiana University für die Finanzierung dieser Forschung bedanken.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1000 &Mikro; L Pipette | |||
| 20 & Mikro; L Pipette | |||
| 200 & Mikro; L Pipette | |||
| 37 ° Wasserbad | |||
| 37 °, befeuchtet 5 % CO2 Inkubator | |||
| 70 % Ethanol | |||
| Analysenwaage | |||
| Zellkultur-bewertete Laminar-Flow-Haube | |||
| Dimethylsulfoxid | |||
| Einweg-Medienbecken, steriles | |||
| Tropffiltrationssystem | |||
| Erlenmeyerkolben | 125 mL und 250 mL | ||
| Methanol | |||
| Human ERβ Reporter Assay System, 1 x Assay im 96-Well-Format Indigo | Biosciences | IB00411 | Assay-Kit - analysiert 24 Proben plus |
| , Mehrkanalpipette | |||
| Orbitalschüttler | |||
| , Plattenablesung, Luminometer, | z. B. Bioteck Synergy HTX | ||
| Rotationsverdampfer | |||
| Rundkolben | 50 mL und 300 mL | ||
| sterile Mikrozentrifugenröhrchen oder sterile Mehrkanal-Medienbecken | |||
| Sterile Spitzen | 200 & micro; L und 1000 µ L | ||
| Whatman Grade 1 | |||
| sterile Polyethylen-Beutel |
Referenzen
- Wasserman, M. D., et al. Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior. Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).
- Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
