Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

Paige Rudich; Carley Snoznik; Noah Puleo; Todd Lamitina

doi:10.3791/61024

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Methodenartikel

Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

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DOI:

10.3791/61024

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30. April 2020

Paige Rudich¹ , Carley Snoznik² , Noah Puleo² , Todd Lamitina¹^,²

¹Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, ²Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wiederholte nicht-ATG-abhängige Translationsprodukte sind neu entstehende pathogene Merkmale mehrerer wiederholter, auf Expansionskrankheiten basierender Krankheiten. Das Ziel des beschriebenen Protokolls ist es, die Toxizität zu bewerten, die durch diese Peptide verursacht wird, indem Verhaltens- und Zellassays im Modellsystem C. elegansverwendet werden.

Zusammenfassung

C. elegans wird häufig verwendet, um altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen zu modellieren, die durch wiederholte Expansionsmutationen verursacht werden, wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Huntington-Krankheit. Kürzlich wurde gezeigt, dass wiederholte, erweiterungshaltige RNA das Substrat für eine neuartige Art von Proteinübersetzung ist, die als repeat-assoziierte nicht-AUG-abhängige (RAN) Translation bezeichnet wird. Im Gegensatz zur kanonischen Übersetzung erfordert die RAN-Übersetzung kein Start-Codon und tritt nur auf, wenn Wiederholungen eine Schwellenwertlänge überschreiten. Da es kein Startcodon gibt, um den Leserahmen zu bestimmen, erfolgt die RAN-Übersetzung in allen Leserahmen sowohl aus Sense- als auch aus Antisense-RNA-Vorlagen, die eine wiederholte Erweiterungssequenz enthalten. Daher erweitert die RAN-Übersetzung die Anzahl möglicher krankheitsassoziierter toxischer Peptide von eins auf sechs. Bisher wurde die RAN-Übersetzung in acht verschiedenen wiederholten, erweiterungsbasierten neurodegenerativen und neuromuskulären Erkrankungen dokumentiert. In jedem Fall ist die Entschlüsselung der AL-Produkte, die toxisch sind, sowie ihrer Toxizitätsmechanismen ein entscheidender Schritt, um zu verstehen, wie diese Peptide zur Krankheitspathophysiologie beitragen. In diesem Beitrag stellen wir Strategien zur Messung der Toxizität von RAN-Peptiden im Modellsystem C. elegansvor. Zunächst beschreiben wir Verfahren zur Messung der RAN-Peptidtoxizität auf das Wachstum und die Beweglichkeit der Entwicklung von C. elegans. Zweitens beschreiben wir einen Test zur Messung postentwicklungsabhängiger, altersabhängiger Wirkungen von RAN-Peptiden auf die Beweglichkeit. Schließlich beschreiben wir einen Neurotoxizitätstest zur Bewertung der Auswirkungen von RAN-Peptiden auf die Neuronenmorphologie. Diese Assays bieten eine umfassende Bewertung der RAN-Peptidtoxizität und können für die Durchführung von groß angelegten genetischen oder kleinen Molekül-Screens nützlich sein, um Krankheitsmechanismen oder Therapien zu identifizieren.

Einleitung

Die unangemessene Ausdehnung von DNA-Wiederholungssequenzen ist die genetische Grundlage für mehrere neurodegenerative Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und Huntington (HD)¹. Zwar gibt es etablierte Zell- und Tiermodelle für diese Krankheiten, Mechanismen, die diesen Bedingungen zugrunde liegen, sind jedoch nicht genau definiert. Beispielsweise wird DIE Huntington-Krankheit durch die Erweiterungeiner einer CAG-Wiederholungssequenz in der Codierungssequenz für das Huntingtin-Protein Htt²verursacht. Da CAG die Aminosäure Glutamin kodiert, führt die CAG-Wiederholungsexpansion zu....