Methodenartikel

Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

DOI:

10.3791/61024

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30. April 2020

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Cell Biology and Molecular Physiology, University of Pittsburgh, 2Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wiederholte nicht-ATG-abhängige Translationsprodukte sind neu entstehende pathogene Merkmale mehrerer wiederholter, auf Expansionskrankheiten basierender Krankheiten. Das Ziel des beschriebenen Protokolls ist es, die Toxizität zu bewerten, die durch diese Peptide verursacht wird, indem Verhaltens- und Zellassays im Modellsystem C. elegansverwendet werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans wird häufig verwendet, um altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen zu modellieren, die durch wiederholte Expansionsmutationen verursacht werden, wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Huntington-Krankheit. Kürzlich wurde gezeigt, dass wiederholte, erweiterungshaltige RNA das Substrat für eine neuartige Art von Proteinübersetzung ist, die als repeat-assoziierte nicht-AUG-abhängige (RAN) Translation bezeichnet wird. Im Gegensatz zur kanonischen Übersetzung erfordert die RAN-Übersetzung kein Start-Codon und tritt nur auf, wenn Wiederholungen eine Schwellenwertlänge überschreiten. Da es kein Startcodon gibt, um den Leserahmen zu bestimmen, erfolgt die RAN-Übersetzung in allen Leserahmen sowohl aus Sense- als auch aus Antisense-RNA-Vorlagen, die eine wiederholte Erweiterungssequenz enthalten. Daher erweitert die RAN-Übersetzung die Anzahl möglicher krankheitsassoziierter toxischer Peptide von eins auf sechs. Bisher wurde die RAN-Übersetzung in acht verschiedenen wiederholten, erweiterungsbasierten neurodegenerativen und neuromuskulären Erkrankungen dokumentiert. In jedem Fall ist die Entschlüsselung der AL-Produkte, die toxisch sind, sowie ihrer Toxizitätsmechanismen ein entscheidender Schritt, um zu verstehen, wie diese Peptide zur Krankheitspathophysiologie beitragen. In diesem Beitrag stellen wir Strategien zur Messung der Toxizität von RAN-Peptiden im Modellsystem C. elegansvor. Zunächst beschreiben wir Verfahren zur Messung der RAN-Peptidtoxizität auf das Wachstum und die Beweglichkeit der Entwicklung von C. elegans. Zweitens beschreiben wir einen Test zur Messung postentwicklungsabhängiger, altersabhängiger Wirkungen von RAN-Peptiden auf die Beweglichkeit. Schließlich beschreiben wir einen Neurotoxizitätstest zur Bewertung der Auswirkungen von RAN-Peptiden auf die Neuronenmorphologie. Diese Assays bieten eine umfassende Bewertung der RAN-Peptidtoxizität und können für die Durchführung von groß angelegten genetischen oder kleinen Molekül-Screens nützlich sein, um Krankheitsmechanismen oder Therapien zu identifizieren.

Einleitung

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Die unangemessene Ausdehnung von DNA-Wiederholungssequenzen ist die genetische Grundlage für mehrere neurodegenerative Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und Huntington (HD)1. Zwar gibt es etablierte Zell- und Tiermodelle für diese Krankheiten, Mechanismen, die diesen Bedingungen zugrunde liegen, sind jedoch nicht genau definiert. Beispielsweise wird DIE Huntington-Krankheit durch die Erweiterungeiner einer CAG-Wiederholungssequenz in der Codierungssequenz für das Huntingtin-Protein Htt2verursacht. Da CAG die Aminosäure Glutamin kodiert, führt die CAG-Wiederholungsexpansion zur Insertion einer Polyglutamin- oder PolyQ-Sequenz innerhalb von Htt. Erweiterte PolyQ-Proteine bilden längen- und altersabhängige Proteinaggregate, die mit Toxizität3,4verbunden sind. Überraschenderweise deuten zwei neuere Studien darauf hin, dass die Länge der PolyQ-Sequenz nicht der Haupttreiber des Auftretens von Huntington-Erkrankungen ist, was darauf hindeutet, dass polyQ-unabhängige Faktoren auch zur Krankheit beitragen können5,6.

Ein möglicher polyQ-unabhängiger Mechanismus beinhaltet eine neu entdeckte Art von Proteinübersetzung mit dem Begriff Repeat Associated Non-AUG-abhängige (RAN) Übersetzung7. Wie der Name schon sagt, tritt die RAN-Übersetzung nur auf, wenn eine erweiterte Wiederholungssequenz vorhanden ist und kein kanonisches Start-Codon erfordert. Daher erfolgt die RAN-Übersetzung in allen drei Leserahmen der Wiederholung, um drei unterschiedliche Polypeptide zu erzeugen. Da viele Gene auch ein Antisense-Transkript produzieren, das die umgekehrte Ergänzung der erweiterten Wiederholungssequenz enthält, findet sich die RAN-Übersetzung auch in allen drei Lesebildern des Antisense-Transkripts vor. Zusammen erweitert die RAN-Übersetzung die Anzahl der Proteine, die aus einer erweiterten, wiederholhaltigen DNA-Sequenz von einem Peptid auf sechs Peptide produziert werden. Bis heute wurde die RAN-Übersetzung bei mindestens acht verschiedenen Wiederholungsdehnungsstörungen beobachtet8. RAN-Peptide werden in postmortalen Patientenproben beobachtet und nur in Fällen, in denen der Patient eine erweiterte Wiederholung9,10trägt. Während diese Peptide eindeutig in Patientenzellen vorhanden sind, ist ihr Beitrag zur Krankheitspathophysiologie unklar.

Um die potenzielle Toxizität im Zusammenhang mit RAN-Peptiden besser zu definieren, haben mehrere Gruppen jedes Peptid in verschiedenen Modellsystemen wie Hefe, Fliegen, Mäusen und Gewebekulturzellen11,,12,13,,14,15,16exprimiert. Anstatt die Wiederholungssequenz für den Ausdruck zu verwenden, verwenden diese Modelle einen Codon-Variation-Ansatz, bei dem die Wiederholungssequenz eliminiert wird, aber die Aminosäuresequenz erhalten bleibt. Die Translationsinitiierung erfolgt durch ein kanonisches ATG und das Peptid wird in der Regel mit einem fluoreszierenden Protein am N- oder C-Terminus verschmolzen, von denen keines die RAN-Peptidtoxizität zu stören scheint. Daher überexpressest jedes Konstrukt ein einzelnes RAN-Peptid. Die Modellierung der verschiedenen RAN-Produkte in einem multizellulären Organismus mit einfachen Assays zur Messung der RAN-Peptidtoxizität ist von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, wie die verschiedenen RAN-Produkte aus jeder krankheitserregenden Wiederholungsexpansion zu zellulärer Dysfunktion und Neurodegeneration beitragen.

Wie andere Modellsysteme bietet C. elegans eine flexible und effiziente experimentelle Plattform, die Studien neuer Krankheitsmechanismen wie der RAN-Peptidtoxizität ermöglicht. Würmer bieten mehrere einzigartige experimentelle Attribute, die derzeit in anderen Modellen der RAN-Peptidtoxizität nicht verfügbar sind. Erstens sind C. elegans von der Geburt bis zum Tod optisch transparent. Dies ermöglicht eine einfache Visualisierung der RAN-Peptidexpression und -lokalisation sowie eine In-vivo-Analyse der Neurodegeneration bei lebenden Tieren. Zweitens sind transgene Methoden zur Erzeugung von RAN-Peptidexpressionsmodellen kostengünstig und schnell. Angesichts des kurzen dreitägigen Lebenszyklus von C. eleganskönnen stabile transgene Linien, die ein bestimmtes RAN-Peptid zellspezifisch exdrücken, in weniger als einer Woche hergestellt werden. Drittens können einfache phänotypische Outputs mit genetischen Screening-Methoden wie chemischer Mutagenese oder RNAi-Screening kombiniert werden, um Schnell Gene zu identifizieren, die für die RAN-Peptidtoxizität unerlässlich sind. Schließlich ermöglicht die kurze Lebensdauer von C. elegans (ca. 20 Tage) den Forschern zu bestimmen, wie das Altern, das der größte Risikofaktor für die meisten wiederholten Expansionskrankheiten ist, die TOXIZITÄT des RAN-Peptids beeinflusst. Zusammen ist diese Kombination von experimentellen Attributen in jedem anderen Modellsystem unübertroffen und bietet eine leistungsstarke Plattform für die Untersuchung der RAN-Peptidtoxizität.

Hier beschreiben wir mehrere Assays, die die experimentellen Vorteile von C. elegans nutzen, um die Toxizität von RAN-Peptiden zu messen und genetische Modifikatoren dieser Toxizität zu identifizieren. Die kodon-verschiedenen ATG-initiierten RAN-Peptide werden mit GFP markiert und entweder in Muskelzellen unter dem Myo-3-Promotor oder in GABAergen Motorneuronen unter dem unc-47-Promotor einzeln exprimiert. Für die Expression in Muskelzellen ist es wichtig, dass toxische RAN-Peptide mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder einem anderen Fluoreszenzprotein-Tag (FP) markiert werden, das mit einem RNAi-Fütterungsvektor gezielt werden kann. Dies liegt daran, dass die toxische RAN-Peptidexpression in der Regel das Wachstum blockiert und solche Belastungen nicht lebensfähig macht. Die Verwendung von gfp(RNAi) inaktiviert bedingt die RAN-Peptidexpression und ermöglicht Dehnungserhaltung, genetische Kreuze usw. Für Assays werden diese Tiere aus gfp(RNAi)entfernt, was die Expression des RAN-Peptids und der resultierenden Phänotypen ermöglicht. Zusätzlich zu der molekularen Strategie zur Gestaltung kodon-variierter RAN-Peptidexpressionskonstrukte beschreiben wir Assays zur Messung der Entwicklungstoxizität (Larval Motilität und Wachstumstest), post-entwicklungsbedingten altersassoziierten Toxizitäten (Paralyse-Assay) und neuronmorphologischen Defekten (Commissure Assay).

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Protokoll

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1. Erzeugung von codon-variierten RAN-Peptid-Expressionskonstrukten

  1. Entwerfen Sie die individuelle RAN-Peptid-Codierungssequenz unter Verwendung synonymer Codons, um die grundlegende repetitive DNA/RNA-Struktur zu eliminieren, aber die darüber liegende Aminosäuresequenz zu erhalten.
  2. Bestellen Sie die benutzerdefinierten Codonsequenzen kommerziell zu den Für die Studien benötigten Wiederholungslängen (in der Regel 5–100 Wiederholungen). Schließen Sie eine HindIII-Beschränkungsstelle am 5'-Ende und eine BamHI-Einschränkungsstelle am Ende 3 ein, um das Klonen in C. elegans Expressionsvektoren wie pPD95.79 zu erleichtern.
    HINWEIS: Wenn sich die Synthese größerer Konstrukte als schwierig erweist, können kleinere Bausteinsequenzen synthetisiert und dann mithilfe einer Richtungsligationsstrategie17in größere Wiederholungen integriert werden.
  3. Subklonieren Sie die Peptidsequenz in einen C. elegans Expressionsvektor mit Standard-T4-Ligationsmethoden.
  4. Subklonieren Sie eine zelltypspezifische Promotorsequenz, die von PCR vor der RAN-Peptidsequenz erzeugt wird, um die gewebespezifische RAN-Peptid-GFP-Expression anzutreiben.
  5. Mikroinjizieren Sie das RAN-Peptidkonstrukt in den Gonaden des wilden Typs C. elegans, um transgene Stämme zu erzeugen, die extrachromosomale Arrays mit Standardmethoden18enthalten. Für einen Co-Injektionsmarker wurde der muskelspezifische RFP-Reporter (myo-3p::RFP (pCFJ104)) verwendet, obwohl auch andere Marker verwendet werden können.
  6. Integrieren Sie ein stabiles Transgen in das Genom mit Standard C. elegans Integrationsscreeningmethoden19.
  7. Wenn das RAN-Peptid toxisch ist und transgene Tiere nicht überleben, füttern Tiere gfp(RNAi), die Bakterien vor und nach der Injektion exemittieren, um die Expression des toxischen Proteins zum Schweigen zu bringen.
    ANMERKUNG: Die Entfernung von Tieren aus gfp(RNAi) ermöglicht die RAN-Peptidexpression für phänotypische Analysen mit den unten beschriebenen Assays.

2. Messung der Entwicklungstoxizität von RAN-Peptiden nach RNAi-basiertem Gen-Knockdown: Videogeschwindigkeitsanalyseprotokoll

  1. Gießen Sie Standard-Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) RNAi 24-Wellplatten mit 1 mM Isopropyl-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 25 g/ml Carbenicillin.
  2. Streifen Sie RNAi-Fütterungklone in HT115-Bakterien, die auf Luria-Brühe (LB) getestet werden sollen , + Carbenicillin (25 g/ml) Agarplatten und wachsen Bakterien bei 37 °C für 24 h. Leere Vektor (RNAi) als positive Kontrolle für Toxizität und gfp(RNAi) als Negativkontrolle.
  3. Für jeden Klon eine einzelne Kolonie in 1 ml LB + Carbenicillin flüssige Medien pflücken und Bakterien über Nacht bei 37 °C wachsen, während sie bei 250 Umdrehungen pro Minute (RPM) schütteln.
  4. Entdecken Sie vier einzelne Brunnen der NGM RNAI 24 Brunnen mit 20 l der folgenden über Nacht bakteriellen Kulturen: Spalte 1 Brunnen = gfp(RNAi); Spalte 2 Brunnen = (EV)RNAi; Säulen 3–6 Brunnen = RNAi gegen zu prüfende Gene. RNAi-Bakterien erlauben, die dsRNA-Produktion über Nacht bei Raumtemperatur (RT) zu induzieren.
  5. Isolieren Sie Eier vom ersten Tag C. elegans, die das integrierte RAN-Peptidtransgen nach der Standard-Hypochlorit-Methode ausdrücken, und Samen von 30 C. elegans Eier in jeden Brunnen der NGM RNAi 24 WellPlatte.
  6. Inkubieren Sie die 24 Brunnen bei 20 °C für 7 Tage.
    HINWEIS: Diese Inkubationszeit gilt für Stämme, die giftige C9orf72 RAN-Dipeptide wie PR50 oder GR50 exdrücken. Andere Stämme können kürzere Inkubationszeiten erfordern, um die Erschöpfung der bakteriellen Nahrungsquelle und den anschließenden Hunger zu verhindern.
  7. Erfassen Sie Durchlichtvideos mit einem Leica MZ16FA Stereo-Sezierendesmikroskop, das mit einer DFC345FX Monochromkamera ausgestattet ist, die an einen Windows-kompatiblen PC mit Leica AF Videoaufnahmesoftware (Version 2.6.0.7266) angeschlossen ist.
    1. Erwerben Sie zwei Videos aus zwei separaten Bohrungen für jede RNAi-Bedingung mithilfe konsistenter Videoaufnahmeeinstellungen zwischen Brunnen. Erfassen Sie für jedes Video 10 Sekunden bei 800 x 600 Pixel Auflösung und 13,16 Bildern pro Sekunde (Zeitvoxel-Dimension = 0,076 Sekunden) mit 18,6-facher Vergrößerung (1,49-Zoom-Einstellung in der AF-Software). Legen Sie die Belichtungszeit des Bildes auf 4 Millisekunden fest. Beschriften Sie jedes Video sofort mit der Sorte, RNAi Zustand und Well-Nummer.
  8. Blinden Sie den Experimentator für den Genotyp, der jeder Videodatei zugeordnet ist, indem Sie die Reihenfolge der Videos randomisieren und den Namen der Videos in Zahlen ändern. Speichern Sie diese Gruppe von Videos als neue Datei. Entblinden Sie den Experimentator, nachdem die Analyse abgeschlossen ist.
  9. Messen Sie die "zurückgelegte Entfernung" und die Länge jedes Tieres für 20 verschiedene Tiere aus jedem Video, wobei insgesamt 40 Würmer für jede RNAi-Bedingung untersucht werden.
    1. Wählen Sie in der Software die Schaltfläche "Anmerkungswerkzeuge" und dann das Textwerkzeug zeichnen aus. Klicken Sie auf einen Punkt in der Mitte des Wurms, der im ersten Frame des Videos gemessen wird, und markieren Sie ihn als Zahl. Bewegen Sie das Video bis zum Ende, während Sie den Bewegungspfad des Wurms visuell verfolgen. Klicken Sie im letzten Frame auf einen Punkt in der Mitte des gemessenen Wurms und markieren Sie die nächste entsprechende Zahl. Zeichnen Sie dann mithilfe des Ziehmaßstabswerkzeugs eine Linie von der ersten Zahl zur zweiten Zahl, um die "zurückgelegte Strecke" aufzuzeichnen.
    2. "zurückgelegte Entfernung" ist der Abstand zwischen den beiden Schwerpunktpunkten. Dieser Abstand wird neben der Messlinie angezeigt. Zeichnen Sie diese Messung in einer Kalkulationstabelle auf. Wiederholen Sie diese Messung für 19 andere Würmer im Video, während jede einzelne Messung im Analysefenster beibehalten wird.
  10. Machen Sie Messungen von Tieren mit der robustesten Bewegung, um die Auswahl von Tieren zu vermeiden, die keine Bewegung aufweisen und die Daten in Richtung Lähmung verzerrt. Sobald die Messungen abgeschlossen sind, machen Sie eine Momentaufnahme des endgültigen Videorahmens, der alle Messlinien veranschaulicht, so dass die Daten auf das Tier zurückverfolgt werden können, von dem sie stammen.
  11. Analysieren Sie die Daten mithilfe einer vierspaltigen Kalkulationstabelle. Spalte eins ist der Wurm "Bezeichner", Spalte zwei ist die zurückgelegte Strecke / Zeit (Geschwindigkeit).
    1. Die Uhrzeit jedes Videos kann durch Rechtsklick auf das Video unter dem Experiment und gehen sie zu den Eigenschaften des Videos gefunden werden.
  12. Normalisieren Sie die Geschwindigkeitsmessung, indem Sie die Länge jedes Tieres finden, indem Sie Quantify und dann Statistiken über die Software auswählen. Ein Klick auf das Symbol des Anmerkungswerkzeugs auf der Videoanzeige sollte die Verwendung des Werkzeugs "Polylinie zeichnen" ermöglichen. Dieses Werkzeug kann dann verwendet werden, um die C. elegans vom Video von der Spitze des Kopfes bis zur Schwanzspitze frei zu verfolgen. Die Länge der Strecke wird in der Statistik erfasst.
    1. Erstellen Sie eine Momentaufnahme des endgültigen Videorahmens, der alle Polylins veranschaulicht, die für die Dimensionierung der C. elegans verwendet werden, so dass die Daten auf das Tier zurückverfolgt werden können, von dem sie stammen.
  13. Analysieren Sie die Daten, indem Sie der Kalkulationstabelle zwei zusätzliche Spalten hinzufügen. Spalte drei ist die "Tierlänge", und Spalte vier ist die "Normalisierte Geschwindigkeit" (Geschwindigkeit/Tierlänge). Analysieren Sie die normalisierten Geschwindigkeitsdaten mit einer einwegigen ANOVA mit Post-hoc-Tests im Vergleich zu leeren Vektoren (RNAi).

3. Messung der Entwicklungstoxizität von RAN-Peptid: Wachstumstest

  1. Wählen Sie 30 Gravid-Tiere in einen 50-L-Punkt der Hypochloritlösung (10 ml Bleichmittel, 2,5 ml 10 N NaOH, 37,5 ml dH2O) entweder auf einer gfp(RNAi), (EV)RNAi oder (genspezifisch) 6 cm RNAi-Platte.
  2. Nach 24 h sechs transgene Nachkommen, die aus dem Hypochloritlösungspunkt herausgekrochen sind, auf eine neue 6 cm RNAi-Platte bewegen, die mit den RNAi-Bedingungen auf der Platte identisch ist, auf der sie der Hypochloritlösungsbehandlung unterzogen wurden. Diese Nachkommen (F1) auf 20 °C stellen, um zu wachsen und sich zu vermehren.
  3. Nach 24–48 h pflücken Sie 10 transgene L4-Tiere auf 6 cm RNAi, die den RNAi-Bedingungen entsprechen, auf denen die Tiere wachsen. Lassen Sie die Tiere legen Eier für 24 h in einem 20 °C Inkubator pulsieren.
  4. Nach 24 h die erwachsenen Tiere entfernen und entsorgen. Zählen Sie die Anzahl der Eier und L1-Larven, die während des 24-Stunden-Zeitraums mit einem mechanischen Handzähler gelegt wurden. Dies ist die gesamte Brutgröße.
  5. Zählen Sie in den nächsten 72 Stunden die Anzahl der Tiere, die die L4 oder ältere Stufe erreichen. Wenn jedes Tier gezählt wird, entfernen Sie es von der Platte.
  6. Quantifizieren Sie das "Prozentwachstum" als Prozentsatz der Tiere, die das L4-Stadium oder ein älteres Stadium apreals aus der gesamten Brutgröße erreichen.
  7. Führen Sie einen exakten Test von 2 x 2 Fisher im Vergleich zum leeren Vektor (RNAi) durch, um festzustellen, ob das prozentuale Wachstum statistisch signifikant ist. Die Kategorien zum Vergleich sind "Wachstum" (" der Tiere, die das L4-Stadium erreichthaben oder älter in 72 h) und "Kein Wachstum" (Gesamtbrutgröße abzüglich der Anzahl der Tiere, die L4 oder älter in 72 h erreichen).

4. Post-Developmental RAN Peptid Lähmung Assay

  1. Bewahren Sie integrierte Transgenstämme von C. elegans, die RAN-Peptid-GFP im Muskel auf gfp(RNAi) exemiten, indem Sie 4–6 transgene L4 es auf eine 6 cm gfp(RNAi) Platte legen und die Würmer bei 20 °C anbauen.
  2. Wenn das Experiment RNAi nutzt, um genetische Auswirkungen auf die RAN-Peptidtoxizität zu testen, bewegen Sie 10 transgene gravid Erwachsene von einer ungehungerten Platte auf jeweils zwei 6 cm leere Vektor(RNAi) (positive Kontrolle auf Lähmung, negative Kontrolle für genetische Effekte), gfp(RNAi) (negative Kontrolle für Lähmungen, positive Kontrolle für genetische Effekte), genspezifische(RNAi) (d.h., 10 gravid Erwachsene pro 6 cm Platte).
  3. Wenn Mutanten verwendet werden, um genetische Auswirkungen auf die RAN-Peptidtoxizität zu analysieren, platzieren Sie 10 gravid WT oder mutierte Tiere, die das gleiche RAN-Transgen auf zwei 6 cm leere Vektorplatten(RNAi) oder gfp(RNAi) ausdrücken. Die Würmer bei 20 °C für 48 h anbauen.
  4. Wählen Sie 10 Sets von 10 transgenen L4 aus den 6 cm RNAi-Platten und legen Sie jedes Set auf eine 3 cm RNAi-Platte (d. h. n = 100 Tiere pro Genotyp). Stellen Sie sicher, dass die für den Test ausgewählten L4 alle oberflächlich normale Beweglichkeit enden. Legen Sie die Platten in einen Reißverschluss-Aufbewahrungsbeutel, um Feuchtigkeit zu behalten.
  5. Legen Sie die verpackten Platten mit L4 in den 25 °C-Inkubator.
  6. Entfernen Sie die Tiere 24 h später aus dem 25 °C Inkubator eine Sorte nach der anderen, um die Zeit zu minimieren, die sie bei RT sind.
  7. Tippen Sie auf die Platten am Sezierendes Mikroskop, um die Bewegung zu überprüfen. Wenn sich die Tiere mehr als eine Körperlänge bewegen, zählen Sie das Tier als mobil und übertragen Sie es auf eine neue 3 cm RNAi-Platte. Verwenden Sie eine Platin-Pick, um die verbleibenden Würmer auf den Kopf oder Schwanz tippen. Bewegt sich das Tier mehr als eine Körperlänge, zählen Sie das Tier als mobil und übertragen Sie es auf eine neue 3 cm RNAi-Platte.
    HINWEIS: Nicht mehr als 10 Würmer pro Platte bei der Übertragung. Achten Sie darauf, die Nachkommenschaft nicht auf die neue RNAi-Platte zu verschieben, da der Test nur von der Folgenden alter Tiere abhängt.
  8. Gruppieren Sie alle nicht beweglichen Würmer so, dass Bewegungen von mehr als einer Körperlänge leicht erkannt werden können. Geben Sie dem Tier mindestens eine Minute, um mehr als eine Körperlänge zu bewegen. Wenn es sich immer noch nicht bewegt, ist es gelähmt, eingesackt (d.h. Larven, die in der Mutter geschlüpft sind) oder tot.
  9. Zensierende Tiere, die Absacken aufweisen, an den Seiten des Tellers verachten, extrudierte Därme ausstellen, graben, verloren gehen oder zum Zeitpunkt der Detektion am Test sterben. Gelähmte Würmer werden gezählt, auf der alten RNAi-Platte zurückgelassen und entsorgt.
  10. Erzielen Sie die Tiere jeden Tag für 5-7 Tage, wie in den Schritten 4.6-4.9 beschrieben.
  11. Analysieren Sie Lähmungsdaten mit einem Log-Rank-Test, der mit dem zur Analyse der Lebensdauer identisch ist. In dieser statistischen Analyse werden bewegte Würmer als "Alive" bewertet, gelähmte Würmer als "Tot" und tot, verpackt, darm extrudiert, ausgetrocknet, gegraben oder anderweitig verlorene Würmer als "Zensiert" bewertet.
    HINWEIS: In dieser Analyse gibt die Zahl "Percent Alive" die "Percent Moving"-Tiere an. Das Inverse stellt das "Prozent gelähmt" dar. Verwenden Sie das Online-Analysetool OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/), um statistische Analysen im Log-Rank durchzuführen.

5. Messung der Neuronenpathologie: Commissure-Assay

  1. Generieren Sie transgene C. Elegane, die das RAN-Peptid von Interesse in den GABAergen Neuronen mit dem Unc-47-Promotor ausdrücken. Drücken Sie auch unc-47p::GFP oder unc-47p::RFP, um die zelluläre Morphologie der GABA-Neuronen zu offenbaren.
  2. 50 transgene L4-Tiere pflücken und 24 h auf eine 6 cm OP50 Platte bei 25 °C legen.
  3. Die 50 transgenen Tiere bei 25 °C für 24 h auf eine neue 6 cm OP50 Platte geben.
  4. Machen Sie Agarose-Pads für die Abbildung der Tiere unter Weitfeldmikroskopie.
    1. Legen Sie zwei Klebebandstücke auf zwei Mikroskopschlitten. Legen Sie eine gereinigte Folie ohne Klebeband in die Mitte der beiden geklebten Dias.
    2. Geben Sie 3% geschmolzene Agarose mit einer Steril-Transfer-Einweg-Übertragungspipette auf den mittleren Schlitten (1 Tropfen aus einer Einweg-Kunststoff-Pasteur-Pipette).
    3. Legen Sie sofort eine zweite saubere Rutsche über den Tropfen geschmolzener Agarose, so dass sie auf den verklebten Dias ruht und eine dünne und gleichmäßige Schicht von Agarose zwischen den Dias erzeugt.
    4. Nachdem die Agarose abgekühlt und verfestigt hat, entfernen Sie vorsichtig die beiden Dias mit der Schicht von Agarose zwischen ihnen, ohne sie zu trennen, und legen Sie sie in eine Plastiktüte mit einem feuchten Stück Papier darunter. Machen Sie eine Folie pro 10 Würmer, die untersucht werden soll, zusammen mit drei zusätzlichen Folien.
  5. Entfernen Sie die transgenen C. elegans aus dem 25 °C Inkubator und pflücken Sie 10 transgene C. elegans in einem 100-L-Tropfen von 10 mM Levamisol in einem Glasdepressionsschlitten. 10 min oder bis die Tiere gelähmt sind.
  6. Entfernen Sie ein Diapaar aus der Plastiktüte und trennen Sie es sorgfältig. Beschriften Sie das Dia mit der Agarose mit dem Genotyp und fügen Sie der Mitte der Agarose 2 l von 10 mM Levamisol hinzu. Bewegen Sie die 10 Tiere in die Levamisole auf dem Agarose-Pad. Bedecken Sie die Tiere mit einem #1 Dicken-Abdeckung.
  7. Bildtiere, bei denen die Vulva so ausgerichtet ist, dass sie sich auf der rechten Seite des Tieres befindet. Wenn sich die Vulva auf der linken Seite des Kopfes befindet, werden die Kommissuren der motorischen Neuronen unter den Tieren sein und nicht so deutlich sichtbar sein, was eine genaue Quantifizierung erschwert. Lassen Sie die Quantifizierung von diesen Tieren weg. In dieser Ausrichtung sind die Kommissuren der Motorneuronen dem Coverslip am nächsten und auf einem invertierten Weitfeldfluoreszenzmikroskop deutlich sichtbar. Visualisieren Sie die Neuronen-Kommissuren, die GFP exzieren, mit einem Leica DMI4000B invertierten Weitfeldfluoreszenzmikroskop mit einem 63X 1.4X NA-Öl-Tauchlinsen und einem Leica L5 GFP-Filterset (Ex480/40nm; Em527/30nm). Wenn die Neuronen-Kommunikation RFP anstelle von GFP ausdrücken, verwenden Sie einen Leica TX2 RFP-Filtersatz (Ex560/40nm; Em645/75nm).
    1. Visualisieren Sie die Neuronen-Kommissuren, die GFP exzieren, mit einem invertierten Weitfeldfluoreszenzmikroskop mit einer 63x 1,4x NA-Öl-Tauchlinse und einem GFP-Filterset (Ex480/40 nm; Em527/30 nm). Wenn die Neuronen-Kommissuren RFP anstelle von GFP ausdrücken, verwenden Sie ein rotes fluoreszierendes Protein (RFP) Filterset (Ex560/40 nm; Em 645/75 nm).
  8. Stellen Sie die Würmer innerhalb von 45 min auf, um den Deckelaufschlag auf die Würmer zu legen, um die Toxizität durch Immobilisierung zu minimieren.
  9. Zählen Sie für jeden Wurm die Anzahl der sichtbaren Kommissuren. Es gibt 16 sichtbare Kommissuren bei Wildtieren. Zählen Sie auch die Anzahl der Kommissuren, die große Perlen (d.h. Blebs) in den Kommissuren haben, sowie die Anzahl der Kommissuren, die gebrochen sind. Um zu bestätigen, dass die Kommissure gebrochen ist, folgen Sie der Kommissure von der Dorsalschnur bis zur ventralen Schnur, indem Sie die Brennebene einstellen.
    ANMERKUNG: Mitteilungen, in denen die unc-47p::GFP-Fluoreszenz eine Lücke aufweist, gelten als gebrochen. Eine gebrochene Kommissure hat in der Regel eine Blessur auf beiden Seiten der Pause, was dazu beiträgt, zu zeigen, dass die Kommissuren gebrochen sind. Zählen Sie die Menge an Blödungen und Pausen für 20 Würmer.
  10. Berechnen Sie den Anteil der Kommissuren mit Blebs oder Brüchen über die Gesamtzahl der beobachteten Kommissuren für jedes Tier. Die absolute Anzahl der pro Tier gezählten Kommissuren (einschließlich Wildtyp, Blutungen und gebrochene Ereignisse) kann ebenfalls gemessen werden.
  11. Berechnen Sie für jede Kategorie den Mittelwert sD und analysieren Sie statistisch entweder mit einem Schüler-t-Test für den Vergleich zwischen zwei Populationen oder einer einseitigen ANOVA für Vergleiche zwischen 3 oder mehr Populationen.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir verwendeten die hier beschriebenen Assays, um die Wirkung verschiedener Genhemmungen auf die Toxizität von RAN-Dipeptiden zu bewerten, die bei ALS-Patienten mit einer G4C2-Wiederholungsexpansion gefunden werden. Mit Hilfe des Wachstums-Assays zur Messung der Entwicklungstoxizität analysierten wir die Auswirkungen mehrerer genetischer Knockout-Mutationen, die in einem genomweiten RNAi-Bildschirmsuppressoren der muskelausgedrückten PR50-GFP-Toxizität identifiziert wurden. Während die Expression vo...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier berichten wir Methoden, die verwendet werden können, um RAN Peptid Toxizität im Muskel oder in den Neuronen von C. elegansmodelliert assay. Während neurodegenerative Proteine bei menschlichen Patienten einen altersbedingten Phänotyp haben, können sie auch eine entwicklungsfördernde Weise aufweisen, wenn sie in Modellsystemen überexprimiert werden. Überexpression hat erhebliche interpretatole Einschränkungen, aber es bietet auch einen starken Ausgangspunkt für genetische oder pharmakologische Screens zur Ide...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH R21NS107797

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
35 mm x 10 mm Petrischale, sterilCELLTREAT Scientific Products50-202-036Nematoden-Wachstumsplatten und RNAi
AGAR GRANULIERTE 2 KILOGRAMMBD DIAGNOSESYSTEMENematoden-Wachstumsplatten und RNAi
AGAROSE ULTRAPURELIFE TECHNOLOGIESMikroinjektion zur Erzeugung von transgenen RAN-Peptidstämmen
CARBENICILLIN 5GTHERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALSBP26485Nematoden-Wachstumsplatten und RNAi-DECKGLÄSER
NR. 1 22MM 1OZ/PKTHERMO SCI ERIE12542BBildgebung für Kommissur-Assays
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CSEPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLSMikroinjektion zur Erzeugung von transgenen Peptidstämmen
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPKTHERMO SCI ERIE125485CMikroinjektion zur Erzeugung transgener RAN-Peptidstämme
Fisherbrand Superfrost Plus ObjektträgerTHERMO SCI ERIE12-550-15Bildgebung für Kommissenassay
Gibco  Bacto Pepton Gibco DF0118-17-0Nematoden-Wachstumsplatten und RNAi
HALOCARBON OIL 700SIGMA-ALDRICH INCH8898-50MLMikroinjektion zur Erzeugung von transgenen RAN-Peptidstämmen
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Referenzen

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