Beschrieben wird hier ein Protokoll zur Bestimmung von vier verschiedenen Tryptophan-Metaboliten, die im Kynurenin-Signalweg (Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, Xanthurensäure, 3-Hydroxyanthranilsäure) in dem Medium erzeugt werden, das aus Krebszellkulturen gesammelt wird, die durch flüssige Chromatographie in Verbindung mit einer einzigen Quadrupol-Massenspektrometrie analysiert werden.
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Methodenartikel
Gleichzeitige Quantifizierung ausgewählter Kynurenine, analysiert durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Medium Collected from Cancer Cell Cultures
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Kynurenin-Weg und die Tryptophan-Kataboliten genannt Kynurenine haben erhöhte Aufmerksamkeit für ihre Beteiligung an der Immunregulation und Krebsbiologie erhalten. Ein In-vitro-Zellkultur-Assay wird oft verwendet, um über den Beitrag verschiedener Tryptophan-Kataboliten in einem Krankheitsmechanismus zu lernen und therapeutische Strategien zu testen. Zellkulturmedium, das reich an sezernierten Metaboliten und Signalmolekülen ist, spiegelt den Status des Tryptophan-Stoffwechsels und anderer zellulärer Ereignisse wider. Neue Protokolle zur zuverlässigen Quantifizierung mehrerer Kynurenine im komplexen Zellkulturmedium sind erwünscht, um eine zuverlässige und schnelle Analyse mehrerer Proben zu ermöglichen. Dies kann mit flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie erreicht werden. Diese leistungsstarke Technik wird in vielen klinischen und Forschungslaboratorien für die Quantifizierung von Metaboliten eingesetzt und kann zur Messung von Kynureninen eingesetzt werden.
Hier wird die Verwendung der Flüssigchromatographie gekoppelt mit der Single-Quadrupol-Massenspektrometrie (LC-SQ) zur gleichzeitigen Bestimmung von vier Kynureninen, d.h. Kynurenin, 3-Hydroxykynurenin, 3-Hydroxyanthranilal und Xanthurensäure im Medium, das aus in vitro kultivierten Krebszellen gesammelt wird, vorgestellt. SQ-Detektor ist einfach zu bedienen und im Vergleich zu anderen Massenspektrometern kostengünstiger. In der SQ-MS-Analyse werden mehrere Ionen aus der Probe erzeugt und entsprechend ihrem spezifischen Massen-Zu-Lade-Verhältnis (m/z)getrennt, gefolgt von der Erkennung mit einem SIM-Modus (Single Ion Monitoring).
In diesem Papier wird auf die Vorteile der gemeldeten Methode hingewiesen und einige Schwachstellen aufgewiesen. Es konzentriert sich auf kritische Elemente der LC-SQ-Analyse einschließlich der Probenvorbereitung zusammen mit Chromatographie und Massenspektrometrie-Analyse. Auch die Qualitätskontrolle, Methodenkalibrierungsbedingungen und Matrixeffektfragen werden diskutiert. Wir beschrieben eine einfache Anwendung von 3-Nitrotyrosin als einen analogen Standard für alle Zielanalyten. Wie durch Experimente mit menschlichen Eierstock- und Brustkrebszellen bestätigt, liefert die vorgeschlagene LC-SQ-Methode zuverlässige Ergebnisse und kann weiter auf andere in vitro zelluläre Modelle angewendet werden.
Einleitung
Kynurenin-Weg (KP) ist die Hauptroute von Tryptophan (Trp) Katabolismus in menschlichen Zellen. Indollamin-2,3-Dioxygenase (IDO-1) in extrahepatischen Zellen ist das erste und begrenzende Enzym von KP und wandelt Trp in N-Formylkynurenin1um. Weitere Schritte innerhalb von KP erzeugen andere sekundäre Metaboliten, nämlich Kynurenine, die verschiedene biologische Eigenschaften aufweisen. Kynurenin (Kyn) ist der erste stabile Trp-Katabolit, der toxische Eigenschaften aufweist und zelluläre Ereignisse reguliert, nachdem es an den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR)2gebunden wurde. Anschließend wird Kyn entweder spontan ode....
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Protokoll
1. Herstellung von Standard 3NT, Kyn, 3HKyn, 3HAA, XA Standard-Lagerlösungen
- Wiegen Sie die Reagenzien in einer Durchstechflasche mit der höchsten Genauigkeit (jeweils 0,3 mg). Skalieren Sie die Reagenzien für eine bessere Genauigkeit, indem Sie das Volumen des Lösungsmittels gemäß Schritt 1.2 anpassen.
- Lösen Sie die Reagenzien in 300 l des Lösungsmittels auf, um eine Stammlösung von 1 g/L zu erhalten. Lösen Sie 3NT in 1% (v/v) Ameisensäure (FA) in Wasser; Kyn, 3HAA und XA in Dimethylsulfoxid (DMSO); 3HKyn in Wasser auf pH 2,5 mit Salzsäure (HCl) säuert.
VORSICHT: 3HAA reizt Augen, Nase, Hals und Lunge. Es ist schädlich beim Einatmen, bei Kontak....
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Ergebnisse
LC-MS bietet unbestreitbare Vorteile bei der Quantifizierung biologisch aktiver Moleküle, auch wenn einige Komponenten komplexer Proben sogenannte Matrixeffekte verursachen und die Ionisierung von Analyten beeinträchtigen. Es führt zu Ionenunterdrückung oder Ionenverstärkung, stark abnehmende Genauigkeit und Auswirkungen auf eine Grenze der Erkennung / Quantifizierung von LC-MS, die als "schwacher" Punkt der Methode betrachtet wird. In unserem Protokoll werden die Ionen durch Elektrospray-Ionisation (ESI) im positiven Mo.......
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Diskussion
Dieses Papier stellt ein detailliertes LC-SQ-Protokoll zur gleichzeitigen Quantifizierung von vier großen Trp-Metaboliten (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) vor, die in einem Medium aus in vitro kultivierten menschlichen Krebszellen gemessen werden. Besondere Aufmerksamkeit wird der Probenvorbereitung, dem chromatographischen/Massenspektrometrieverfahren und der Dateninterpretation, den wichtigsten Punkten der Analyse, gewidmet.
Im Allgemeinen erfordert die LC-MS-Analyse aufgrund der hohen Empfin.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung im Rahmen des Operationellen Programms Entwicklung Ostpolens 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00) von der Fakultät für Biotechnologie und Umweltwissenschaften der Katholischen Universität Lublin (Young Scientists Grant for Ilona Sadok), Polish National Science Centre, OPUS13 (2017/25/B/NZ4/01198 für Magdalena Staniszewska, Principle Investigator). Die Autoren danken Prof. Agnieszka 'cibior vom Laboratory of Oxidative Stress, Centre for Interdisciplinary Research, JPII CUL für die gemeinsame Nutzung der Ausrüstung für zellulierung und Proteinquantifizierung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3-Hydroksy-DL-Kynurenina | Sigma-Aldrich | H1771 | |
| 3-Hydroxyanthranilsäure | Sigma-Aldrich | 148776 | 97% |
| 3-Nitro-L-Tyrosin | Sigma-Aldrich | N7389 | |
| Acetonitril | Supelco | 1.00029 | Hypergrade für LC-MS LiChrosolv |
| Aktivkohle | Supelco | 05105 | Pulver |
| Analysenwaage | Ohaus | ||
| Analysesäule | Agilent Technologies | 959764-902 | Zorbax Eclipse Plus C18 rapid resolution HT (2,1 x 100 mm, 1,8 &; Mikro; m) |
| Ammoniumformiat-Supelco | 7022 | Eluenten-Additiv für LC-MS, LiChropur, ≥ 99,0% | |
| Rinderserum Albumin | Sigma | 1001887398 | |
| Kappen für chromatographische Fläschchen | Agilent Technologies | 5185-5820 | blaue Schraubverschlüsse, PTFE/rot sil sepa |
| Zellkulturschale | Nest | 704004 | Polystyrol, nicht pyrogen, steril |
| Zellkulturplatte | Biologix | 07-6012 | 12-Well, nicht pyrogen, nicht zytoxisch, steril |
| Zellinkubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 150i Cu | |
| Zentrifuge | Eppendorf | Modell 5415R | |
| Zentrifuge | Eppendorf | Modell 5428 | |
| Zentrifugenröhrchen | Bionovo | B-2278 | Eppendorf Typ, 1,5 mL |
| Zentrifugenröhrchen | Bionovo | B-3693 | Falcon Typ, 50 mL, PP |
| Chromatographische Daten Akquisitions- und Analysesoftware | Agilent Technologies | LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92) | |
| Chromatographische Einsatzfläschchen | Agilent Technologies | 9301-1387 | 100 µ L |
| Chromatographische Fläschchen | Agilent Technologies | 5182-0714 | 2 mL, Klarglas |
| Dimethylsulfoxid | Supelco | 1.02950 | Uvasol |
| Dubelcco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-41450 | |
| Dual Meter pH/Leitfähigkeit | Mettler Toledo | SevenMulti | |
| Verdampfer | Genevac | Modell EZ-2.3 Elite | |
| Fötales Rinderserum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Ameisensäure | Supelco | 5.33002 | für LC-MS LiChropur |
| Glasflasche für die Lagerung | von ReagenzienBionovo | S-2070 | 50 mL, Klarglas |
| Vorsäule | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse Plus-C18 Vorsäule mit schmaler Bohrung (2,1 x 12,5 mm, 5 &; Mikro; m) |
| Salzsäure | Merck | 1.00317.1000 | |
| L-Kynurenin | Sigma-Aldrich | K8625 | ≥ 98% (HPLC) |
| Magnetrührer | Wigo | ES 21 H | |
| Mikrowaage | Mettler Toledo | Modell XP6 | |
| Milli-Q System Millipore | ZRQSVPO30 | Direct-Q 3 UV mit Pumpe | |
| Quadrupol Massenspektrometer | Agilent Technologies | G1948B | Modell 6120 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Adrich | 048M4874V | |
| Plattenleser | Bio Tek | Synergy 2 betrieben von Gen5 | |
| Kaliumchlorid | Merck | 1.04936.1000 | |
| Kaliumdihydrogenphosphat | Merck | 1.05108.0500 | |
| Protein Assay Farbstoffreagenzkonzentrat | BioRad | 500-0006 | |
| Wippwippe | Stuart | SSL4 | |
| Serologische Pipette | Nest | 326001 | 5 mL, Polystyrol, nicht pyrogen, steril |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Natriumphosphat zweibasisch | Merck | 1.06346.1000 | |
| Lösemittel-Einlassfilter | Agilent Technologies | 5041-2168 | Glasfilter, 20 μ m Porengröße |
| Lösemittelreservoir (für LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6524 | 1 L, Klarglas |
| Lösemittelreservoir (für LC-MS) | Agilent Technologies | 9301-6526 | 1 L, Braunglas |
| Tabellenkalkulationsprogramm | Microsoft Office | Microsoft Office Excel | |
| Rührstab | Bionovo | 6-2003 | teflonbeschichtete |
| Spritzenvorsatzfilter für die Kultur mittlere Filtration | Bionovo | 7-8803 | regenerierte Zellulose, Ø 30 mm, 0,45 µ m |
| Spritzenvorsatzfilter für die Filtration von Komponenten in der mobilen Phase | Bionovo | 6-0018 | Nylon, Ø 30 mm, 0,22 & Mikro; m |
| Gewebekulturplatten | VWR | 10062-900 | 96-Wells, steril |
| Trypsin-EDTA Lösung | Sigma-Aldrih | T4049-100 mL | |
| Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-System | Agilent Technologies | G1367D, G1379B, G1312B, G1316C | 1200 Infinity-System bestehend aus Autosampler (G1367D), Entgaser (G1379B), Binärpumpe (G1312B), Säulenthermostat (G1316C) |
| Ultraschallbad | Polsonic | 104533 | Modell 6D |
| Vortex | Biosan | Modell V-1 plus | |
| Xanthurensäure | Sigma-Aldrich | D120804 | 96% |
Referenzen
- Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
- Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immun....
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Nachdrucke und Genehmigungen
