Vereinfachte Reverse Genetics-Methode zur Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren, die Reporterproteine ausdrücken

Zusammenfassung

Die Generierung rekombinanter Rotaviren aus Plasmid-DNA ist ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der Rotavirus-Replikation und Pathogenese sowie für die Entwicklung von Rotavirus-Expressionsvektoren und Impfstoffen. Hierin beschreiben wir einen vereinfachten Reverse-Genetik-Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Rotaviren, einschließlich Stämmen, die fluoreszierende Reporterproteine exdrücken.

Zusammenfassung

Rotaviren sind eine große und sich entwickelnde Population segmentierter doppelsträngiger RNA-Viren, die bei vielen Säugetier- und Vogelwirtarten, einschließlich des Menschen, eine schwere Gastroenteritis verursachen. Mit dem jüngsten Aufkommen von Rotavirus-Reverse-Genetik-Systemen ist es möglich geworden, gezielte Mutagenese zu verwenden, um die Rotavirusbiologie zu erforschen, bestehende Rotavirus-Impfstoffe zu modifizieren und zu optimieren und Rotavirus-Multitarget-Impfstoffvektoren zu entwickeln. In diesem Bericht beschreiben wir ein vereinfachtes Reverse-Genetik-System, das die effiziente und zuverlässige Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren ermöglicht. Das System basiert auf der Kotransfektion von T7-Transkriptionsvektoren, die Rotavirus (+)RNAs exdrücken, und einem CMV-Vektor, der ein RNA-Verschlussenzym in BHK-Zellen kodiert, die konstitutiv T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) produzieren. Rekombinante Rotaviren werden verstärkt, indem die transfizierten BHK-T7-Zellen mit MA104-Zellen übersaat werden, einer Affen-Nierenzelllinie, die für das Viruswachstum sehr freizügig ist. In diesem Bericht beschreiben wir auch einen Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Rotaviren, die durch die Einführung eines 2A-Translational Stop-Restart-Elements in das Genomsegment 7 (NSP3) ein separates fluoreszierendes Reporterprotein ausdrücken. Dieser Ansatz vermeidet das Löschen oder Ändern eines der viralen offenen Leserahmen und ermöglicht so die Produktion rekombinanter Rotaviren, die voll funktionsfähige virale Proteine behalten und gleichzeitig ein fluoreszierendes Protein exezieren.

Einleitung

Rotaviren sind Hauptursachen für schwere Gastroenteritis bei Säuglingen und Kleinkindern, sowie bei vielen anderen Säugetier- und Vogelarten¹. Als Mitglieder der Reoviridae-Familie haben Rotaviren ein segmentiertes doppelsträngiges RNA-Genom (dsRNA). Die Genomsegmente sind in einem nicht umhüllten ikosaedralen Virion enthalten, das aus drei konzentrischen Schichten des Proteins²gebildet wird. Basierend auf der Sequenzierung und phylogenetischen Analyse der Genomsegmente wurden neun Arten von Rotavirus (A-D, F-J) definiert³. Die Stämme, die Rotavirus-Arten A umfassen, sind für die überwiegende Mehrheit der menschlichen Krankheit verantwortlich⁴. Die Einführung von Rotavirus-Impfstoffen in Impfprogramme für Kinder, die in den letzten zehn Jahren begonnen haben, korreliert mit einer signifikanten Verringerung der Sterblichkeit und Morbidität von Rotavirus. Vor allem ist die Zahl der Rotavirus-assoziierten Todesfälle im Kindesalter von etwa 528.000 im Jahr 2000 auf 128.500 im Jahr 2016^{gesunken 4,5}. Rotavirus-Impfstoffe werden aus lebenden abgeschwächten Stämmen des Virus formuliert, wobei 2 bis 3 Dosen kindern im Alter von 6 Monaten verabreicht werden. Die große Anzahl genetisch unterschiedlicher Rotavirusstämme, die bei Menschen und anderen Säugetierarten zirkulieren, in Verbindung mit ihrer Fähigkeit, sich durch Mutagenese und Neusortierung schnell zu entwickeln, können zu antigenen Veränderungen in den Arten von Rotaviren führen, die Kinder^6,7,8infizieren. Solche Änderungen können die Wirksamkeit bestehender Impfstoffe untergraben, die deren Ersatz oder Änderung erfordern.

Die Entwicklung vollständig plasmidbasierter Reverse-Genetik-Systeme, die die Manipulation eines der 11 Rotavirus-Genomsegmente ermöglichen, wurde erst vor kurzem erreicht⁹. Mit der Verfügbarkeit dieser Systeme ist es möglich geworden, molekulare Details der Rotavirusreplikation und Pathogenese zu entwirren, verbesserte Hochdurchsatz-Screening-Methoden für Anti-Rotavirus-Verbindungen zu entwickeln und neue potenziell effektivere Klassen von Rotavirus-Impfstoffen zu schaffen. Während der Rotavirus-Replikation leiten gekappte virale (+)RNAs nicht nur die Synthese viraler Proteine, sondern dienen auch als Vorlagen für die Synthese von Nachkommen dsRNA-Genomsegmenten^10,11. Alle bisher beschriebenen Rotavirus-Reverse-Genetik-Systeme stützen sich auf die Transfektion von T7-Transkriptionsvektoren in Säugetierzelllinien als Quelle von cDNA-abgeleiteten (+)RNAs, die bei der Wiederherstellung rekombinanter Viren^9,12,13verwendet werden. Innerhalb der Transkriptionsvektoren werden virale cDNAs in voller Länge zwischen einem vorgelagerten T7-Promotor und einem nachgeschalteten Hepatitis-Delta-Virus (HDV)-Ribozym positioniert, so dass virale (+)RNAs durch T7-RNA-Polymerase synthetisiert werden, die authentische 5' und 3'-termini enthalten (Abbildung 1A). Im Reverse-Genetik-System der ersten Generation wurden rekombinante Viren durch Transfizierung von Babyhamster-Nierenzellen hergestellt, die T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) mit 11 T7 (pT7) Transkriptionsvektoren exdrücken, jede direkte Synthese einer einzigartigen (+)RNA des simians SA11-Virusstamms und drei CMV-Promotor-Antriebsexpressionsplasmiden, eines kodiert das Aviäre Reovirus p10FAST-Fusionsprotein und zwei kodierende Untereinheiten des Impfvirus D1R-D12L-Verschluss-Enzymkomplexes⁹. Rekombinante SA11-Viren, die in transfizierten BHK-T7-Zellen erzeugt wurden, wurden durch Übersaat mit MA104-Zellen verstärkt, einer Zelllinie, die für das Wachstum des Rotavirus freiist. Es wurde eine modifizierte Version des Reverse-Genetik-Systems der ersten Generation beschrieben, die keine Unterstützungplasmide mehr verwendet¹². Stattdessen erzeugt das modifizierte System erfolgreich rekombinante Rotaviren, indem es BHK-T7-Zellen mit den 11 SA11 T7 Transkriptionsvektoren transfiziert, wobei der Vorbehalt besteht, dass Vektoren für die Bausteine der viralen Fabrik (Viroplasma) (nichtstrukturelle Proteine NSP2 und NSP5) auf Ebenen hinzugefügt werden, die 3-fach höher sind als die anderen Vektoren^14,15. Modifizierte Versionen des Reverse-Genetik-Systems wurden auch entwickelt, die die Wiederherstellung der menschlichen KU- und Odelia-Stämme des Rotavirus^16,17unterstützen. Das Rotavirus-Genom ist bemerkenswert anfällig für Manipulationen durch umgekehrte Genetik, mit rekombinanten Viren, die bisher mit Mutationen in VP4^18,NSP1⁹, NSP2¹⁹, NSP3^20,21und NSP5^22,23eingeführt wurden. Zu den nützlichsten Viren, die bisher erzeugt wurden, gehören diejenigen, die entwickelt wurden, um fluoreszierende Reporterproteine (FPs)^{auszudrücken 9,12,21,24,25}.

In dieser Publikation stellen wir das Protokoll für das Reverse-Genetik-System zur Verfügung, das wir in unserem Labor verwenden, um rekombinante Stämme von SA11-Rotavirus zu erzeugen. Das Hauptmerkmal unseres Protokolls ist die Ko-Transfektion von BHK-T7-Zellen mit den 11 pT7 Transkriptionsvektoren (modifiziert um 3x Ebenen des pT7/NSP2SA11 und pT7/NSP5SA11-Vektors) und eines CMV-Expressionsvektors, der das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) NP868R-Verschlussenzym²¹ (Abbildung 2) kodiert. In unseren Händen führt das Vorhandensein des NP868R-Plasmids zur Produktion von höheren Tittern rekombinanter Viren durch transfizierte BHK-T7-Zellen. In dieser Publikation stellen wir auch ein Protokoll zur Änderung des pT7/NSP3SA11-Plasmids bereit, so dass rekombinante Viren erzeugt werden können, die nicht nur das Segment 7-Proteinprodukt NSP3, sondern auch ein separates FP ausdrücken. Dies wird erreicht, indem der NSP3-Leserahmen (ORF) im pT7/NSP3SA11-Plasmid neu gestaltet wird, um ein nachgeschaltetes 2A-Translational Stop-Restart-Element gefolgt von einem FP ORF (Abbildung 1B)^24,26. Durch diesen Ansatz haben wir rekombinante Rotaviren erzeugt, die verschiedene FpPs exdrücken: UnaG (grün), mKate (far-red), mRuby (rot), TagBFP (blau), CFP (cyan) und YFP (gelb)^24,27,28. Diese FP-exemitten Rotaviren werden ohne Löschung des NSP3 ORF hergestellt, wodurch Viren entstehen, von denen erwartet wird, dass sie eine vollständige Ergänzung funktionierender viraler Proteine kodieren.

Protokoll

1. Medienaufbereitung und Zellkulturpflege

1. Erhalten Sie Babyhamster-Nierenzellen, die konstitutiv T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) und afrikanische grüne Affennieren-MA104-Zellen exemiten.
   HINWEIS: BHK-T7 (oder BSR-T7) Zellen sind nicht kommerziell erhältlich, sondern sind eine gemeinsame Zelllinie von Laboratorien, die Umgekehrte Genetik verwenden, um die RNA-Virusbiologie zu untersuchen. Die in diesem Protokoll verwendete BHK-T7-Zelllinie wurde von Dr. Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), einem Mitentwickler der ursprünglichen BHK-Zelllinie, die T7-RNA-Polymerase²⁹exexzessiiert, bezogen. MA104-Zellen sind bei der European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) und bei American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich.
2. Bereiten Sie die folgenden Kulturmedien in einer sterilen Umgebung vor, vorzugsweise ein biologisches Sicherheitskabinett der Klasse II. Medien im Dunkeln bei 4 °C aufbewahren und unmittelbar vor gebrauchen auf 37 °C erwärmen.
   HINWEIS: Quellen von Medienkomponenten sind in der Tabelle der Materialienenthalten.
   1. Um DMEM unvollständiges Medium vorzubereiten, kombinieren Sie 500 ml des modifizierten Minimum-Essential-Mediums (MEM) von Dulbecco, das 4,5 g/L Glukose und 1% Glutamin mit 5 ml 100x Pen-Strep enthält.
   2. Um DMEM komplettes Medium vorzubereiten, kombinieren Sie 500 ml DMEM unvollständiges Medium mit 25 ml fetalem Rinderserum (FBS).
   3. Um GMEM unvollständiges Medium vorzubereiten, kombinieren Sie 500 ml Glasgow minimum essential medium, 5 ml of 100x glutamin, 50 ml tryptose-phosphate brühe (TPB), 5 ml von 100x nicht essentielle Aminosäuren (NEAA) und 5 ml 100x Pen-Strep.
   4. Um GMEM komplettes Medium vorzubereiten, kombinieren Sie 500 ml GMEM unvollständiges Medium mit 25 ml wärmeinaktiviertem FBS.
   5. Um GMEM+G komplettes Medium vorzubereiten, fügen Sie 10 ml 50 mg/ml Geneticin (G418) auf 500 ml GMEM-Gesamtmedium hinzu.
   6. Um das unvollständige Mittel des KmuM vorzubereiten, kombinieren Sie 500 ml von Jokliks modifiziertem Eagle es MEM, 5 ml 100x Glutamin, 50 ml TPB, 5 ml 100x NEAA und 5 ml 100x Pen-Strep.
3. Kultur MA104-Zellen in T75- oder T175-Kolben, die 12 bzw. 25 ml DMEM-Gesamtmedium enthalten. Um MA104-Zellen, die 100% Koninfluenza erreicht haben, zu durchziehen, spülen Sie die Zellmonoschicht 2x mit phosphatgepufferter Saline (PBS), dissoziieren Sie mit Trypsin (0,05%)-EDTA (0,1%) 5 (T75-Kolben) oder 10 ml (T175-Kolben) dmEM-Unvollständiges Medium.
   1. Legen Sie 0,5 bis 1,0 ml resuspendierte Zellen in frische Kolben und bringen Sie das entsprechende Endvolumen durch Hinzufügen von DMEM-Gesamtmedium. Kolben in einen 37 °C,₂ 5% CO2-Inkubator stellen.
4. Vermehren Sie BHK-T7-Zellen in T75-Flaschen, abwechselnd zwischen der Verwendung von GMEM und GMEM+G komplettem Medium mit jeder Durchgangsrunde. Um BHK-T7-Zellen, die eine 100%ige Konfluenz erreicht haben, zu subkulturieren, spülen Sie die Zellmonoschicht 2x mit PBS, distanzieren Sie sich mit der Trypsin-EDTA-Lösung und setzen Sie sich in 5 ml Medium aus.
   1. Nachdem Sie 15 ml GEM oder GMEM+G komplettin einen frischen T75-Kolben platziert haben, fügen Sie vier Tropfen resuspendierter BHK-T7-Zellen hinzu. Kolben in einen 37 °C,₂ 5% CO2-Inkubator stellen.

2. Plasmid-Vorbereitung

1. Erhalten Sie die folgenden Plasmide, die Rotavirus SA11 (+)RNAs von Addgene exzieren: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11 und pT7/NSP5SA11. Beziehen Sie das Plasmid, das das ASFV-Verschlussenzym (pCMV/NP868R) exzessient, von den Autoren²¹.
   HINWEIS: Modifizierte pT7/NSP3SA11 Plasmide, die entwickelt wurden, um ein FP durch die Aktivität eines 2A-Translationalelements (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) auszudrücken, können auch von den Autoren^24,26bezogen werden. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP Plasmide, die die folgenden FP exdrücken, sind verfügbar: UnaG (grün), mKate (far-red), mRuby (rot), TagBFP (blau), CFP (cyan) und YFP (gelb)²⁴.
2. Verwandeln Sie Plasmide in kompetente E. coli UND verbreiten Sie Bakterien auf Luria Brühe AgarPlatten, die das entsprechende Antibiotikum enthalten. Wachsen Sie Bakterienkulturen aus einzelnen Kolonien und bereiten kleinere Mengen an Plasmid (20 g) mit einem Spin Miniprep Reinigungssatz (Tabelle der Materialien), nach den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie größere Mengen an Plasmid aus Bakterienkulturen mit Midi- und Maxi-Reinigungskits(Tabelle der Materialien).
   HINWEIS: Plasmide, die für den Einsatz im Reverse-Genetik-System geeignet sind, wurden auch mit anderen Plasmid-Reinigungskits hergestellt. Es ist nicht notwendig, Plasmide mit Kits vorzubereiten, die speziell entwickelt wurden, um Endotoxinfreies Material zu erzeugen.
3. Stellen Sie die Konzentrationen von gereinigten Plasmiden auf 1 mg/ml in nukleasefreiem molekularbiologischem Wasser ein. Überprüfen Sie die Plasmidreinheit, indem Sie mit einem Spektralphotometer ein Absorptionsverhältnis von 260/280 von 1,8 € bestätigen. Verwenden Sie außerdem die Elektrophorese an 0,8% Agarose-Gelen, um zu überprüfen, ob Plasmide überwiegend übergewickelt sind.
4. Aliquot gereinigte Plasmide in 0,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen, die jeweils 10 l enthalten. Plasmide bei -80 °C lagern.

3. Generierung des rekombinanten Virus

HINWEIS: Die Forschung an rotavirus, einschließlich der Erzeugung und Charakterisierung rekombinanter Rotavirusstämme, muss unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) behandelt werden und bedarf der vorherigen Genehmigung durch den Institutional Biosafety Committee (IBC). Geeignete BSL-2 Laborbedingungen werden in Biosafety in Mikrobiologischen und biomedizinischen Laboratorien (BMBL) beschrieben, die von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC)³⁰produziert werden.

1. Tag 1: Aussaat von BHK-T7-Zellen in 12-Well-Platten
   1. Spülen Sie eine frisch konfluente Monoschicht von BHK-T7-Zellen, die in einem T75-Kolben 2x mit PBS enthalten sind. Unterbrechen Sie die Zellmonolayer mit Trypsin-EDTA-Lösung und setzen Sie die Zellen in 5 ml GMEM-Gesamtmedium wieder aus.
   2. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler und eine trypan-blaue Lösung, um die Konzentration lebensfähiger BHK-T7-Zellen im Medium zu bestimmen. Samenzellen in 12-Well-Zellkulturplatten, wobei jeder Brunnen 2 x 10⁵ Zellen in einem Gesamtvolumen von 1 ml GMEM (G418-frei) komplettem Medium enthält. Inkubieren Sie in einem 37₂ °C, 5% CO2-Inkubator. Die Zellen sollten bis Tag 2 80 bis 90 % konfluenz erreichen.
2. Tag 2: Transfektion von BHK-T7-Zellen mit Plasmidmischungen
   1. Zur Herstellung des Plasmidgemischs folgendes in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Plasmidvorräten zu kombinieren, die auf 1 mg/ml eingestellt sind: 0,8 l pro SA11 pT7-Plasmids VP1; VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 und NSP4, je 2,4 L sA11 pT7 Plasmide NSP2 und NSP5 und 0,8 l pCMV/NP868R. Mischen Sie Plasmide vorsichtig, indem Sie auf das Rohr tippen und Inhalte durch Pulszentrifugation sammeln. Um rekombinante Viren vorzubereiten, die Fpps exezieren, ersetzen Sie pT7/NSP3SA11 durch das entsprechende pT7/NSP3-2A-3xFL-FP-Plasmid.
      HINWEIS: Plasmidmischungen sollten auf Eis gelagert werden, bis sie verwendet werden. Für jede Transfektion sollte ein separates Rohr vorbereitet werden.
   2. Zur Herstellung des Plasmid/reduzierten Serummediums/Transfektionsreagenzgemisches: 110 L vorgewärmtes (37 °C) reduziertes Serummedium(Materialtabelle) zu jedem Plasmidgemisch hinzufügen und durch sanftes Pipetieren nach oben und unten mischen. Danach fügen Sie jedem Plasmid/reduzierten Serummedium-Gemisch 32 L Transfektionsreagenz (Materialtabelle) hinzu; Dies ergibt eine Konzentration von 2,5 l Transfektionsreagenz pro g Plasmid in Mischungen. Wirbelmischungen sanft und inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min.
   3. Während der 20 min Inkubationszeit spülen BHK-T7-Zellen in 12-Well-Platten (vorbereitet am 1. Tag) einmal mit 2 ml GMEM unvollständigen Medien. Fügen Sie anschließend 1 ml SMEM unvollständiges Medium zu jedem Brunnen hinzu und geben Sie Platten an den Inkubator zurück.
   4. Nach der 20 min Inkubationszeit fügen Sie das Plasmid/reduzierte Serummedium/Transfektionsgemisch Tropfen für Tropfen zu jedem Bohrkörper der 12-Well-Platten mit einem 200-L-Pipettor hinzu. Leicht Gesteinsplatten und kehren Sie zu einem₂ 37 °C, 5% CO2-Inkubator zurück.
3. Tag 4: Übersaat transfizierter BHK-T7-Zellen mit MA104-Zellen
   1. Spülen Sie eine frisch konfluente Monoschicht von MA104-Zellen, die in einem T75-Kolben 2x mit PBS enthalten sind. Unterbrechen Sie die Monoschicht mit Trypsin-EDTA-Lösung und setzen Sie Zellen in 5 ml DMEM-Gesamtmedium wieder auf.
   2. Mit hilfe einer automatisierten Zellzähler und Trypan-Blau-Lösung, bestimmen Sie die Konzentration der lebensfähigen MA104-Zellen im Medium. Stellen Sie die Konzentration auf 8 x 10⁵ MA104-Zellen/ml in DMEM-Unvollständigen medium ein und fügen Sie 0,25 ml suspendierte Zellen (2 x 10⁵ Zellen) tropfenweise zu den Brunnen hinzu, die transfizierte BHK-T7-Zellen enthalten.
   3. Passen Sie die Konzentration von Trypsin (SchweinepankreasTyp IX) im Medium auf 0,5 g/ml an, indem Sie jedem Bohrgut 0,8 l von 1 mg/ml Trypsin-Bestand hinzufügen.
      HINWEIS: Trypsin-Bestände sollten in PBS hergestellt, aliquoted und bei -20 °C gelagert werden.
   4. Verwenden Sie die verbleibenden MA104-Zellen, um 6-Well-Platten vorzubereiten, die an Tag 7 benötigt werden, um rekombinante Viren zu verstärken. Um 6-Well-Platten auszusäen, resuspendierte MA104-Zellen auf eine Konzentration von 1,5 x 10⁵ Zellen/ml in DMEM-Gesamtmedium verdünnen und 2 ml in jedem Brunnen platzieren. Platten in einen 37 °C,₂ 5% CO2-Inkubator legen.
4. Tag 7: Rückgewinnung und Verstärkung von rekombinanten Viren aus transfizierten Zellen
   1. Unter sterilen Bedingungen BHK-T7/MA104-Zellen in 12-Well-Platten drei Zyklen Gefriertau unter sterilen Bedingungen, bewegliche Platten zwischen -20 °C Gefrierschrank und Raumtemperaturoberfläche. Nach der Übertragung von Lysaten auf 1,5 ml-Rohre, Zentrifugenrohre für 10 min bei 500 x g (4 °C) zu Pellet großen zellulären Schmutz. Überstand sammeln und bei 4 °C (kurzfristig) oder -20 °C (langfristig) lagern.
   2. MA104 Monolayer in 6-Well-Platten (vorbereitet an Tag 4) 2x mit PBS waschen. Platzieren Sie 2 ml DMEM unvollständiges Medium zu jedem Brunnen, der 0,5 g/ml Trypsin enthält. Fügen Sie 300 L Überstand, der aus BHK-T7/MA104-Zelllysaten zurückgewonnen wurde, in Brunnen₂ einundund legen Sie Platten in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
   3. Inkubationsplatten für 7 Tage oder bis vollständige zytopathische Wirkungen (CPE) beobachtet werden. Lyse MA104-Zellen in 6-Well-Platten durch drei Zyklen Gefriertau, dann übertragen Lysate auf 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre. Pellet große zelluläre Ablagerungen durch Zentrifugation für 10 min bei 500 x g (4 °C). Die geklärten Zelllysate in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei -20 °C lagern.

4. Plaque-Isolierung von rekombinanten Viren

1. Aktivieren Sie Viren in 100 l geklärter Zelllysate, indem Sie Trypsin zu einer Endkonzentration von 10 g/ml hinzufügen und bei 37 °C für 1 h inkubieren. Bereiten Sie eine 10-fache serielle Verdünnungsserie von 10^-1 bis 10^-7 (jeweils 1 ml) in DMEM-Unvollständiges Medium vor.
2. MA104 Monolayer in 6-Well-Platten 2x mit 2 ml PBS und einmal mit DMEM unvollständigem Medium spülen. Fügen Sie 400 ml Lysatverdünnungen in Doppeltarbeit zu den Platten hinzu. Inkubieren Sie die Platten für 1 h in₂ einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator, Schaukeln alle 10 bis 15 min, um Verdünnungen über die Monoschicht umzuverteilen.
3. Bereiten Sie eine Agarose-MEM-Overlay-Lösung vor, indem Sie gleiche Volumina des minimalen essentiellen Mediums 2x Eagle (EMEM; vorgewärmt auf 37 °C) mit 1,5% Agarose kombinieren, die mit einer Mikrowelle in Wasser geschmolzen und auf 45 °C vorgekühlt wurde. Halten Sie die Overlay-Lösung bei 42 °C mit einem Wasserbad und stellen Sie sich unmittelbar vor dem Auflegen auf die Zellen auf eine Endkonzentration von 0,5 g/ml Trypsin ein.
4. Lysatverdünnungen von 6-Well-Platten abziehen, dann Zellen einmal mit 2 ml unvollständigem DMEM abspülen. Überlagern Sie 3 ml der Agarose-MEM-Overlay-Lösung vorsichtig auf die in jedem Brunnen enthaltene Zellmonolayer. Lassen Sie die Agarose-Overlay bei Raumtemperatur aushärten und dann Dieplatten zum Inkubator zurückgeben.
5. Drei Tage später eine Agarose-MEM-Overlay-Lösung wie in Schritt 4.3 vorbereiten und auf 42 °C bringen. Stellen Sie die Überlagerungslösung unmittelbar vor der Verwendung auf eine Endkonzentration von 50 g/ml neutral rot ein (Materialtabelle).
6. Fügen Sie 2 ml der Overlay-Lösung auf die vorhandene Agarose-Schicht in die 6-Well-Platten. Nachdem Sie die neue Agaroseschicht aushärten lassen, geben Sie die Platten zum Inkubator zurück. Schützen Sie Lösungen und Platten, die neutrales Rot enthalten, vor Lichteinwirkung.
7. Identifizieren Sie in den nächsten 6 h Rotavirus-Plaques in den 6-Well-Platten mit Hilfe eines Leuchtkastens. Wählen Sie klar definierte Plaques mit Einweg-Transferpipetten, die Agarose-Stecker wiederherstellen, die sich vollständig auf die Zellschicht erstrecken.
8. Den Stecker in ein 1,5 ml-Rohr mit 0,5 ml DMEM-Unvollständigem Medium austreiben und die Probe für 30 s wirbeln lassen. Verstärken Sie das plaqueisolierte Virus, das durch Vermehrung auf MA104-Monolayern in 6-Well-Platten oder T25-Kolben mit DMEM-Unvollständigem Medium und 0,5 g/mL Trypsin in das Medium eluiert wird.
   HINWEIS: Weitere Informationen zur Isolierung und Titering von Rotavirus durch Plaque-Assay sind in Arnold et al.³¹verfügbar.

5. Gelelektrophorese der viralen dsRNA

1. Legen Sie 600 l geklärte infizierte Zelllysate und 400 l Guanidiniumthiocyanat in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren, Wirbel für 30 s und inkubieren Bei Raumtemperatur für 5 min. Fügen Sie 200 l Chloroform, Wirbel für 30 s und inkubieren für 3 min. Nach zentrifugieren für 5 min bei 13.000 x g (4 °C), übertragen Sie die obere wässrige Phase in frische Schläuche.
2. Recyre virale dsRNA aus der wässrigen Phase, indem du 2 Volumina (ca. 900'L) kalten Isopropylalkohol und invertierende Röhren 4x 6x hinzufügen. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min Zentrifugenrohre für 10 min bei 13.000 x g (4 °C). Überstand entsorgen und die RNA-Pellets behalten.
3. Waschen Sie die Pellets, indem Sie 1 ml 75% Ethanol in das Rohr geben, einmal invertieren und 5 min bei 7.500 x g (4 °C) zentrifugieren. Nach sorgfältigem Entfernen des Ethanolwaschens mit einem Pipetten lassen Sie RNA-Pellets auf der Laborbank für 5 bis 10 min lufttrocknen. Lösen Sie RNA-Pellets in 15 l nukleasefreiem molekularbiologischem Wasser und lagern Sie sie bei -20 °C.
4. Kombinieren Sie 10 l gelöste RNA-Proben mit 2 l 6x DNA-Ladepuffer, Last auf vorgegossene 10% Polyacrylamid-Minigele (oder Handguss-Äquivalente) und lösen Sie RNAs durch Elektrophorese im Tris-Glycin-Laufpuffer für 2 h unter einem konstanten Strom (16 mA). Einweichen Sie Gele für 5 x 10 min in Wasser, das Ethidiumbromid mit einem Wert von 1 g/ml enthält, und detektieren Sie Rotavirus-Genomsegmente mit einem UV-Transilluminator.

6. Rückgewinnung und Sequenzierung viraler dsRNA

1. Suchen Sie virale dsRNA-Bänder auf Polyacrylamid-Gelen vorzugsweise mit schwacher Intensität langwelligem UV-Licht, um die Erzeugung von Nukleinsäure-Kreuzverbindungen zu vermeiden. Mit einer frischen Rasierklinge Gelfragmente mit dsRNA-Bändern ausschneiden und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren übertragen.
2. Nach Zugabe von 10 x 20 l RNase-freiem Wasser zerkleinern Sie jedes Fragment mit einem RNase-freien Einweg-Pellet-Pestle, das für ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr ausgelegt ist, oder indem Sie durch eine 18 G-Nadel auf und ab ziehen. Zerkleinerte Fragmente über Nacht bei 4 °C inkubieren.
3. Lassen Sie 3 l Flüssigkeit aus Rohren mit zerkleinerten Gelfragmenten zurück. Generieren Sie cDNAs der viralen dsRNAs mit einem einstufigen Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktions-Kit (RT-PCR)(Tabelle der Materialien) und geeigneten Oligonukleotid-Primern.
   HINWEIS: PCR-Produkte werden mit einem PCR-Reinigungskit(Tabelle der Materialien) gelgereinigt und zusammen mit Primern von kommerziellen DNA-Sequenzdiensten zur Nächtlichen Sequenzierung zusammen mit Primern versandt.

7. Immunoblot-Analyse viraler Proteine

1. Säen Sie 6-Well-Platten mit 3 x 10⁵ MA104 Zellen pro Brunnen in einem Gesamtvolumen von 2 ml DMEM-Gesamtmedium. Platten in einen 37 °C,₂ 5% CO2-Inkubator legen und lassen, bis die Zellen die Konfluenz erreichen (3 bis 5 Tage).
   HINWEIS: Brunnen mit konfluenten Monolayern enthalten 1,2 x 10⁶ Zellen.
2. Behandeln Sie geklärte Überräube, indem Sie mit 10 g/ml Trypsin bei 37 °C für 1 h die darin enthaltenen rekombinanten Rotaviruspartikel inkubieren.
3. MA104 Monolayer in 6-Well-Platten 2x mit 2 ml PBS spülen. Infizieren Sie Zellen, indem Sie jedem Brunnen 200 L Inokulum mit 3-5 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Zelle des Trypsin-aktivierten Rotavirus in DMEM-unvollständigem Medium hinzufügen. Platten zum Inkubator zurückgeben.
4. Entfernen Sie alle 10 min Platten und schaukeln Sie sanft, um Inokulum über die Zellmonoschicht umzuverteilen. Nach 1 h inokulum durch 2 ml DMEM unvollständiges Medium ersetzen.
5. Bei 8 h nach der Infektion, spülen Zellen in 6-Well-Platten 2x mit PBS. Schrottzellen in 750 l PBS und übertragen Volumen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Spülen Sie die Platte mit weiteren 750 L PBS und kombinieren Sie mit der vorherigen gesammelten 750-L-Probe.
6. Pelletzellen in der Probe durch Zentrifugieren bei 5.000 x g für 10 min bei 4 °C. Nach dem Wegwerfen von Überstand Zellpellets bei -80 °C lagern, bis sie weiterverarbeitet werden.
7. Bereiten Sie einen Zelllysepuffer mit 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2% Triton X-100 und 1x EDTA-freiem Vollständigen Proteaseinhibitor vor. Nach Zugabe von 300 l Lysepuffer zu gefrorenen Zellpellets kurz Wirbelproben und 10 min auf Eis inkubieren.
8. Wiederholen Sie den Prozess der Wirbel- und Inkubationsproben auf Eis 3x. Anschließend Zentrifugenproben bei 15.000 x g für 10 min bei 4 °C, dann Überstand sammeln und bei -80 °C lagern.
9. Lösen Sie Proteine, die in 20 L Volumen von überstäudigen Proben enthalten sind, durch Elektrophorese auf vorgefertigten linearen 8-16% Polyacrylamid-Minigelen und Übertragung auf Nitrozellulosemembranen auf. Blockmembranen durch Inkubation mit PBS-Tween 20 (0,02%) 5% fettfreie Trockenmilch.
10. Sondenmembranen durch Inkubation mit einem oder mehreren primären Antikörpern (z. B. Meerschweinchen-Anti-NSP3- oder Anti-VP6-Antisera, Maus monoklonaler Anti-Flag-M2-Antikörper oder monoklonaler Anti-PCNA-Antikörper von Kaninchen). Entdecken Sie primäre Antikörper durch Inkubation von Membranen mit Pferd Anti-Maus-IgG, Anti-Meerschweinchen-Schwein IgG, oder Ziege Anti-Kaninchen IgG Meerrettich peroxidase-konjugierte sekundäre Antikörper, gefolgt von der verbesserten Chemilumineszenz (ECL) Meerrettich Chemilumineszenz Substrat. Visualisieren Sie Lumineszenzsignale mit einem Gel-Bildgebungssystem (Tabelle der Materialien) oder Röntgenfilm.

8. Live-Zell-Bildgebung von Zellen, die mit FP-exezierenden Viren infiziert sind

1. Säen Sie 6-Well-Platten mit 3 x 10⁵ MA104 Zellen pro Brunnen in insgesamt 2 ml DMEM-Gesamtmedium. Platten in einen 37 °C,₂ 5% CO2-Inkubator legen und lassen, bis die Zellen die Konfluenz erreichen (3 bis 5 Tage).
   HINWEIS: Brunnen mit konfluenten Monolayern enthalten 1,2 x 10⁶ Zellen.
2. Aktivieren Sie Rotavirus-Proben von bekannten Titern durch Inkubation mit 10 g/ml Trypsin bei 37 °C für 1 h.
3. 6-Well-Platten mit MA104 Monolayern 2x mit 2 ml PBS spülen. Infizieren Sie Zellen, indem Sie jedem Brunnen 200 L Inokulum hinzufügen, das 3,5 PFU pro Zelle des Trypsin-aktivierten Rotavirus in DMEM-unvollständigem Medium enthält. Geben Sie Platten zum Inkubator zurück und schaukeln Sie die Platten sanft, um Inokulum alle 10 min über die Zellmonoschicht umzuverteilen.
   HINWEIS: Brunnen, die mit virenfreiem DMEM-Inoculum infiziert sind, sollten als Kontrollen einbezogen werden.
4. Nach 1 h Virusadsorption Monolayer 2x mit PBS ausspülen und Medium mit 0,5 ml pro Bohrung des DMEM unvollständigen Mediums ersetzen. Bei 7,5 h nach der Infektion, ersetzen Kulturmedium mit DMEM mit niedrigem Hintergrund Fluoreszenz (Tabelle der Materialien). Verwenden Sie bei 8 h nach der Infektion einen Live-Zell-Imager, um Zellen bei 20-facher Vergrößerung auf grünes, rotes oder blaues Fluoreszenzsignal zu untersuchen.

Ergebnisse

Das in diesem Artikel beschriebene Reverse-Genetik-Protokoll führt mehrere verschiedene Schritte durch: (1) Ko-Transfektion von BHK-T7-Zellen mit Rotavirus pT7-Transkriptionsvektoren und einem pCMV/NP868R-Expressionsplasmid, (2) Übersaat von transfizierten BHK-T7-Zellen mit MA104-Zellen, (3) Amplifikation rekombinanter Viren in BHK-T7/MA104-Zellen lysiert mit MA104-Zellen und (4) Plaque-Isolierung des rekombinanten Virus mit MA104-Zellen (Abbildung 2). In unseren Händen ist das Protokoll eff...

Diskussion

In unserem Labor verlassen wir uns routinemäßig auf das hier beschriebene Reverse-Genetik-Protokoll, um rekombinante SA11-Rotaviren zu produzieren. Mit diesem Ansatz erholen sich Personen mit wenig Erfahrung in molekularbiologischen Techniken oder der Arbeit mit Rotaviren rekombinante Viren auch beim ersten Versuch. Wir haben nach diesem Protokoll fast 100 rekombinante Viren erzeugt, einschließlich derer mit Genomen, die überarbeitet wurden, um fremde Proteine (z. B. FPs) auszudrücken, die Sequenzadditionen, Löschungen u...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Baby Hamster Niere - T7 RdRP (BHK-T7) Zellen			Kontakt: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycin Polyacrylamid Mini-Gel	Bio-Rad	45608105
Cellometer AutoT4 Zähler für lebensfähige Zellen	Nexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging System	Bio-Rad
Chloroform	MP	194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrat	Bio-Rad	170-5060
Kompetente E.coli DH5alpha Bakterien	Lucigen	60602-2
Complete Protease Inhibitor	Pierce	A32965
Einweg-Transferpipetten, ultrafeine verlängerte Spitzen	MTC Bio	P4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Lonza	12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)	Quality Biological	115-073-101
Ethanol, absolut (200 proof)	Fisher Bioreagents	BP2818-500
Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml)	Invitrogen	15585-011
Fötales Rinderserum (FBS)	Corning	35-010-CV
Fötales Rinderserum (FBS), Hitzeinaktiviertes	Corning	35-011-CV
Flag M2 Antikörper, Maus Monoklonal	Sigma-Aldrich	F1804
GenEluat HP Plasmid Midiprep Kit	Sigma	NA0200-1KT
Geneticin (G-418)	Invitrogen	10131-027
Gibco FluroBrite DMEM	ThermoFisher A1896701		DMEM mit niedrigem Hintergrund Fluoreszenz
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)	Gibco	11710-035
Ziege Anti-Kaninchen IgG, Meerrettichperoxidase (HRP) Konjugierte	Zellsignaltechnologie	7074S
Meerschweinchen Anti-NSP3 Antiserum	Patton Laborlos	55068
Meerschweinchen Anti-VP6 Antierum	Patton Laborlos	53963
Pferde-Anti-Meerschweinchen-IgG, Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert	KPL	5220-0366
Pferde-Anti-Maus-IgG, Meerrettich-Eroxidase (HRP) konjugierte	Zellsignaltechnologie	7076S
iNtRON Biotechnologie e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit	JH Science	25235
Isopropylalkohol	Macron	3032-02
L-Glutamin-Lösung ( 100x)	Gibco	25030-081
Luria Agar Pulver (Miller's LB Agar)	RPI Forschungsprodukte	L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Kulturmedium	Hyclone	Sh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)	Lonza	04-719Q
Affenniere (MA104) Zellen	ATCC	ATCC CRL-2378.1
NanoDrop One Spektralphotometer	ThermoScientific
Neutralrote Lösung (0,33%)	Sigma-Aldrich	N2889-100ml
nicht-essentielle Aminosäurelösung (100x)	Gibco	11140-050
Novex 10% Tris-Glycin-Polyacrylamid Mini-Gel	Invitrogen	XP00102BOX
Nuklease-frei Molekularbiologie Qualität	Invitrogen	10977-015
NucleoSpin Gel und PCR Clean-Up Kit	Takara	740609.25
Opti-MEM Reduziertes Serummedium	Gibco	31985-070
Pellet-Stößel (RNase-frei, Einweg)	Fisher	12-141-368
Penicillin-Streptomycin-Lösung, (100x Penn-Streptokokken)	Corning	30-002-Cl
Phosphat Gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x	Fisher Bioreagents	BP399-20
Schweinetrypsin, Typ IX-S	Sigma-Aldrich	T0303
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12162
Qiagen Plasmid Midi Kit	Qiagen	12143
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
SA11 pT7 Transkriptionsvektoren	Addgene	89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transkriptionsvektoren, die fluoreszierende Proteine			Kontakt: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarose	Lonza	50000	Für die Gelelektrophorese
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Für Plaque-Assay
Superscript III One-Step RT-PCR Kit	Invitrogen	12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit	Bio-Rad	170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer System	Bio-Rad
TransIT-LTI Transfektionsreagenz	Mirus	MIR2306
Tris-Glycin-SDS Gel Running Buffer (10x)	Bio-Rad	161-0772
Triton X 100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Trizol RNA Extraktionsreagenz	Ambion	15596026
Trypanblau	Corning	25-900-CI
Trypsin (0,05%)-EDTA (0,1%) Zelldissoziationslösung	Qualität Biologisch	118-087-721
Tryptosephosphat Bouillon	Gibco	18050-039
Tween-20	VWR	0777-1L
Vertrel VF Lösungsmittel	Zoro	G0707178
Zoe Fluoreszierender Lebendzell-Imager	Bio-Rad