Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) ist ein neuartiger Ansatz für den quantitativen Nachweis endogener und exogen angewendeter MeCP2-Proteinvarianten, der hochquantitative, genaue und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler über einen weiten Arbeitsbereich erzeugt. Hier wird das Protokoll für die MeCP2-ECLIA im 96-Well-Format beschrieben.
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Methodenartikel
Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die ECLIA ist eine vielseitige Methode, die in der Lage ist, endogene und rekombinante Proteinmengen in einem 96-Well-Format zu quantifizieren. Um die ECLIA-Effizienz zu demonstrieren, wurde dieser Test verwendet, um intrinsische Konzentrationen von MeCP2 im Gehirngewebe der Maus und die Aufnahme von TAT-MeCP2 in humanen dermalen Fibroblasten zu analysieren. Der MeCP2-ECLIA erzeugt hochpräzise und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler. Zusammenfassend haben wir eine quantitative Methode zur Bewertung von MeCP2-Proteinvarianten entwickelt, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen eingesetzt werden können.
Einleitung
Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) basiert auf einem Verfahren, bei dem Etiketten verwendet werden, die bei elektrochemisch stimulierter Lumineszenz emittiert werden. Es ist eine allgemein anwendbare Technik für den quantitativen Nachweis biologischer Analyten in der Grundlagenindustrie und der akademischen Forschung, der Lebensmittelindustrie sowie in der klinischen Diagnostik1. Üblicherweise wird eine Einwegplatte mit Carbon-Tintenelektroden verwendet. Diese Elektroden fungieren als Festphasenträger für den Immunoassay. Ein sekundärer Antikörper wird mit einem elektrochemilumineszierenden Etikett konjugiert und wenn Strom auf das....
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Protokoll
Die Zulassung für die Beschaffung von Hautbiopsien zu Forschungszwecken wurde von der Human Research Ethics Committee of the Children es Hospital in Westmead, Australien, eingeholt. Die Zustimmung zu Tierversuchen erhielt das Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, die nach den örtlichen Tierschutzbestimmungen durchgeführt wurden (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
ANMERKUNG: Das Prinzip des ECLIA-Systems ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Antikörperauswahl
- Bewerten Sie das Signal-Rausch-Verhältnis für eine Reihe von verschiedenen MeCP2-Antikörpern und identi....
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Ergebnisse
Das Prinzip des ECLIA-Systems ist in Abbildung 1beschrieben. Standardkurven für zwei MeCP2-Varianten sind in Abbildung 2dargestellt. Eine genaue Quantifizierung war über einen breiten Konzentrationsbereich (1.800 ng/ml) möglich. In Abbildung 3wurden MeCP2-Spiegel von Lysaten aus Dem mausgehirn und HDFs analysiert. Die MeCP2-Expression in Kernlysaten im Gehirn von heterozygoten, Wildtyp- und Knockout-Mäusen wurde in
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Diskussion
Zur Messung der endogenen MeCP2-, rekombinanten MeCP2- und TAT-MeCP2-Spiegel wurde eine 96-Well-Platte ECLIA entwickelt. Es hat sich gezeigt, dass der Verlust der MeCP2-Proteinfunktion zum RTT-Syndrom6führt, für das die Behandlung derzeit auf Symptommanagement und Physiotherapie beschränkt ist. Eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit ist die sogenannte Proteinersatztherapie, bei der MeCP2-Spiegel bis zu ihrer benötigten Konzentration12,,13.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Dr. Brigitte Sturm für ihre Unterstützung beim ECLIA-Instrument.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonisches Lysereagenz, Extraktionspuffer |
| Bio-Rad Protein Assay Farbstoffreagenzkonzentrat | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | |
| Probenvorbereitung Nachweis AB SULFO-TAG markiert Anti-Kaninchen | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | |
| Antikörper-Entdeckungs-Workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco von Life Technologies | 41966-029 | Probenvorbereitung |
| Dulbecco' s PBS (steril) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Probenvorbereitung, Waschlösung, Beschichtungslösung |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraktionspuffer |
| Fötales Rinderserum | Sigma-Aldrich | F9665 | Probenvorbereitung |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraktionspuffer |
| Gold Read Buffer T (1x) mit Tensid | Mesoskala Diagnostik | R92TG | MeCP2 ECLIA-Protokoll |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonisches Lysereagenz, Extraktionspuffer |
| KIMBLE Dounce Gewebeschleifer-Set | Sigma-Aldrich | D8938 | Probenvorbereitung |
| Laborschüttler, Schaukelbewegung (niedrige Geschwindigkeit) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA-Protokoll |
| Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonisches Lysereagenz, Extraktionspuffer |
| MeCP2 (Human) Rekombinantes Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Zellbehandlung |
| Microseal B-Siegel | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | zur Plattenversiegelung |
| Monoklonales Anti-MeCP2, hergestellt in der Maus, Klon Mec-168, gereinigtes Immunglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antikörper, Beschichtungslösung |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA Protokoll |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA Protokoll |
| Penicillin-Streptomycin | gibco von Life Technologies | 15140122 | Probenvorbereitung |
| Polyklonales Anti-MeCP2, hergestellt in Kaninchen | Eurogentec S.A. | kundenspezifischer | Antikörper |
| Kaliumchlorid (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonisches Lysereagenz |
| Primär AB Maus, Anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antikörper |
| Primär AB Maus, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antikörper |
| Primär AB Maus, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antikörper |
| Primär AB Maus, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antikörper |
| Primär AB Kaninchen, anti-MeCP2 (D4F3) | Zellsignaltechnologie | 3456S; RRID:AB_2143849 | |
| (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonisches Lysereagenz, Extraktionspuffer |
| Sekundär AB, Kaninchen, Anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | kundenspezifischer | Antikörper |
| Sekundär AB, Kaninchen, Anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antikörper |
| Natriumchlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraktionspuffer |
| SULFO-TAG Markierter Anti-Kaninchen-Antikörper (Ziege) | Mesoskala Diagnostik | W0015528S | Antikörper |
| TAT-MeCP2 Fusionsprotein | Inhouse-Produktion | Zellbehandlung | |
| Trypsin EDTA 0,25% (1X) | gibco von Life Technologies | 25200-056 | Zellbehandlung |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Waschlösung |
Referenzen
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electr....
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Nachdrucke und Genehmigungen
