Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.
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Methodenartikel
Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Drosophila-Hoden sind ein leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung biologischer Prozesse, einschließlich Stammzellbiologie, Kernarchitektur, Meiose und Spermienentwicklung. Die Immunmarkierung des gesamten Drosophila-Hodens ist jedoch oft mit einer signifikanten Ungleichmäßigkeit der Färbung aufgrund der Antikörperpenetration verbunden. Gequetschte Präparate überwinden das Problem nur teilweise, da sie die 3D-Qualität der Analysen verringern. Hierin beschreiben wir ein Whole-Mount-Protokoll mit NP40 und Heptan während der Fixierung zusammen mit der Immunmarkierung in flüssigen Medien. Es bewahrt das für die konfokale Mikroskopie geeignete Volumen zusammen mit einer reproduzierbaren und zuverlässigen Markierung. Wir zeigen verschiedene Beispiele für die 3D-Rekonstitution von Spermatozytenkernen aus konfokalen Abschnitten. Die Reproduzierbarkeit von Intra- und Inter-Hoden ermöglicht die 3D-Quantifizierung und den Vergleich der Fluoreszenz zwischen einzelnen Zellen verschiedener Genotypen. Wir verwendeten verschiedene Komponenten der intranukleären MINT-Struktur (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) sowie zwei Komponenten, die mit dem Kernporenkomplex verbunden sind, um dieses Protokoll und seine Anwendungen auf den größten Zellen des Hodens, den S4-S5-Spermatozyten, zu veranschaulichen.
Einleitung
Drosophila-Hoden sind ein wertvolles Modell für das Studium der nuklearen Architektur. In mitotischen Spermatogonienzellen ist das Kernvolumen weitgehend mit Chromatin besetzt. Diese Zellen durchlaufen vier Teilungsrunden und produzieren eine Zyste von 16 primären Spermatozyten. In den nächsten Tagen durchlaufen die Spermatozyten 6 Entwicklungsstadien (S1-S6), wobei das Volumen stark zunimmt, ungefähr 20-fach1,2. Sie verändern auch ihre Kernmorphologie. Der Umriss des Kerns, der durch das Lamin Dm0 offenbart wird, wird unregelmäßig und zeigt tiefe Invaginationen1,3. Damit einher gehen umfangreiche Genexpressionsveränderungen und Modifikationen in der Chromatinorganisation1,4,5,6,7. Die Interphasenchromosomen sind im Stadium S4-S5 gut definiert und bilden drei verschiedene Massen, die den 2 wichtigsten bivalenten Autosomen und dem X-Y-Paar entsprechen, das an den Nukleolus angedockt ist.
Mad1 wurde ursprünglich als Schlüsselkomponente des mitotischen Checkpoints isoliert (überprüft in8). In der Interphase wird es als primär an der Kernhülle, aber auch im Nukleoplasmus9,10,11lokalisiert beschrieben. Bei Drosophila hoden berichteten wir, dass Mad1 im Nukleoplasma prominent ist, eng mit den beiden großen autosomalen Chromatinmassen und in geringerem Maße mit dem XY-Chromatin verbunden ist. Wir haben diese Chromatin-assoziierte Struktur als MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12definiert. Vier weitere Proteine waren mit MINTs in Spermatozyten assoziiert: das Nukleoporin Mtor/Tpr, das SUMO peptidase Ulp1, das mitotische Checkpointprotein Mad2 und eine Untereinheit eines Polycomb-ähnlichen Komplexes Raf212.
Um die Beschreibung von MINTs zu vervollständigen, mussten wir Antikörper verwenden und wurden mit den technischen Problemen konfrontiert, die im Allgemeinen bei der Immunfärbung im Hoden auftreten: eine schlechte Permeabilität, die zu einer signifikanten Ungleichmäßigkeit der Färbung in der Tiefe des Hodens, insbesondere in den großen Spermatozyten, führt. Szerschmierte Präparate erhöhten den Antikörperzugang, führten jedoch zu komprimierten Bildern, schränkten die 3D-Analysen ein und verhinderten die Messung der quantitativen Fluoreszenz, einschließlich der Kolokalisierung. Das Problem der Antikörperpenetration könnte auch durch Permeabilisierungsmittel wie 0,3% Na-Desoxycholat13angegangen werden, aber dieses Verfahren führte in unseren Händen nicht zu reproduzierbaren Ergebnissen. Da wir viele Co-Labeling-Experimente durchgeführt haben, haben wir versucht, das Permeabilisierungsprotokoll zu verbessern. Die Kombination von 1% NP40 plus Heptan führte zu mehr Reproduzierbarkeit, insbesondere bei der Untersuchung der großen Spermatozyten.
Dieses Protokoll führt die Fixierung und Immunfärbung von Hoden in Suspension durch, verbessert die Probenqualität sowie verbessert die Reproduzierbarkeit und macht sie für die konfokale Mikroskopie geeignet. Wir haben das Protokoll verwendet, um die räumlichen Beziehungen bestimmter Kernhüllenproteine mit den nukleoplasmatischen Strukturen großer Spermatozyten besser zu definieren. Diese Methode wird es ermöglichen, die Veränderungen, die die Spermatozytenentwicklung begleiten, besser zu überprüfen, zum Beispiel die dynamischen strukturellen Veränderungen des Kerns einschließlich Chromatin, Nukleoplasma und der Kernporen.
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Protokoll
1. Drosophila Hodensammlung
HINWEIS: Junge Männchen (0-15 h nach der Eklosion) sind notwendig, um diploide Keimzellen (dh Spermatogonie und Spermatozyten) zu untersuchen.
- Wählen Sie junge Fliegen so weit wie möglich aus, um Störungen durch die Entwicklung von Spermatiden zu minimieren.
- Anästhesieren Sie Fliegen durch kurze Exposition gegenüber Kohlendioxid und Übertragen auf ein Fliegenpad14,15.
- Unter einem Seziermikroskop (10-fache Vergrößerung) den Kopf mit einer Zette entfernen.
- 5 bis 10 enthauptete Fliegen auf 100 μL Ringer-Puffer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, vollständiger Proteininhibitor, pH 6,8) auf einen silikonbeschichteten Glasträger auf schwarzem Hintergrundträger übertragen.
- Verwenden Sie mit einem Seziermikroskop bei einer 40-fachen Vergrößerung ein Paar Einer Zange Nummer 5, um eine Fliege zwischen Thorax und Bauch zu halten, und ziehen Sie mit einer anderen Zange den Bauch vom Thorax weg. Isolieren Sie schnell die Hoden und das angrenzende Gewebe aus dem Fliegenkadaver15 und legen Sie einen neuen Tropfen Ringers Puffer auf denselben Objektträger.
- Sobald alle Hoden fertig sind, reinigen Sie die Hoden von den verbleibenden Geweben (Akzessodrüse und äußere Genitalien).
- Entfernen Sie überschüssigen Puffer aus dem Tropfen, der die sezierten Hoden enthält. Verwenden Sie in der Regel eine p200-Pipette mit einer 10-μL-Spitze, die auf einer 200-μL-Spitze angebracht ist. Dies ermöglicht die Entfernung des Flüssigkeitsüberschusses durch eine kleine Öffnung. Legen Sie einen Tropfen 4% Paraformaldehyd-Fixiermittel auf den Tropfen, der die sezierten Hoden enthält, und geben Sie die Hoden dann schnell in ein Röhrchen mit frischer Fixierlösung.
2. Paraformaldehyd-Fixierung
- Bereiten Sie 2 ml Fixierlösung kurz vor dem Gebrauch vor: 600 μL 4% Paraformaldehyd verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 30 μL NP40 20% plus 1200 μL Heptan in einem 2 mL silikonisierten Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 4% Paraformaldehyd in PBS, das in 600 μL Aliquoten hergestellt und bei -20 °C gelagert wird.
Achtung: Heptan und Paraformaldehyd sind giftig und sollten in einem Abzug gehandhabt werden. Entsorgen Sie diese gemäß den Vorschriften des Gastinstituts. - Übertragen Sie die Hoden mit einer p200-Mikropipette mit einer breiten Öffnungsspitze auf die PFA/NP40/Heptan-Lösung. Schütteln Sie den Schlauch 30 s lang von Hand auf und ab. Setzen Sie die Fixierung der Hoden auf einem Rotationsmischer bei Raumtemperatur für 30 minuten fort.
- Stoppen Sie den Rotationsmischer und legen Sie das Rohr in ein Rohrgestell, damit die Phasentrennung erfolgt und sich die Hoden am Boden des Rohres absetzen können.
- Entfernen Sie das gesamte Heptan und die Fixierlösung und spülen Sie die Hoden schnell dreimal mit 1x PBS aus.
- In ein sauberes 200 μL Einzelröhrchen überführen. Führen Sie alle Inkubationen in diesen kleinen Röhrchen durch, um die Menge der verwendeten Antikörper zu minimieren.
- Entfernen Sie überschüssigen Puffer mit einer 200 μL-Mikropipette, an der sowohl eine P200- als auch eine P10-Spitze angebracht sind. Achten Sie darauf, keine Hoden anzusaugen.
- Halten Sie die Hoden in 1x PBS auf Eis, bis alle Proben fertig sind.
3. Antikörperfärbung in Lösung
- Verwerfen Sie das PBS und lassen Sie die Hoden in 0,3% PBS-T für 30 minuten bei Raumtemperatur, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.
- Im selben Puffer plus 5% normales Ziegenserum (NGS) für 1 h vorinkubieren.
- 200 μL des primären Antikörpers verdünnt in 0,3% PBS-T plus 5% NGS ( Materialtabelle )werden hinzugefügt.
- Inkubieren Sie den primären Antikörper über Nacht bei 4 °C (oder Raumtemperatur) mit sanftem Rühren auf einer Wippe.
- 3 mal in 0,3% PBS-T für 15 min auf einer Wippe bei Raumtemperatur waschen. Lassen Sie die Hoden sich durch die Schwerkraft auf den Boden der Röhre absetzen.
- Fügen Sie 200 μL sekundären Antikörper hinzu, der 1:500 verdünnt ist, aus der dyLight-konjugierten Serie.
- Inkubieren Sie den sekundären Antikörper in einer dunklen Kammer für 4 h bei Raumtemperatur.
- In 0,3% PBS-T für 15 min auf einer Wippe bei Raumtemperatur waschen. Dann mit 0,2% PBS-T und 0,1% PBS-T wiederholen, jedes Mal für 30 minuten auf einer Wippe bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Reinigungsmittel abschließend in 1x PBS für 30 Minuten, um das Reinigungsmittel zu entfernen.
- 180 μL DAPI-Lösung bei 1 μg/ml in 1x PBS für 15 min hinzufügen. Die Stammlösung beträgt 10 mg/ ml inH2O. Vermeiden Sie die Herstellung von Stammlösung in PBS, die das DAPI-Färbesignal auf diffusem Chromatin in größeren Spermatozyten reduzieren kann.
- 3x für je 5 min waschen.
- Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um einen Kreis auf einem sauberen Dia zu zeichnen.
- Saugen Sie hoden an und legen Sie sie auf den Schlitten. Das Vorspülen der weiten Blendenspitze mit 0,1% PBS-T verhindert, dass die Hoden an der Spitze haften. Entfernen Sie überschüssiges PBS.
- Fügen Sie einen Tropfen (ca. 100 μL) Citifluor AF1 hinzu.
- Legen Sie vorsichtig einen Glasdeckel über das Gewebe und achten Sie darauf, dass Luftblasen nicht einfangen.
- Versiegeln Sie den Abdeckverschluss mit klarem Nagellack auf dem Schlitten.
- Beobachten Sie Objektträger auf einem Mikroskop.
4. Kolokalisationsanalysen
- Erfassen Sie konfokale Bilder. Wir verwendeten ein Zeiss LSM 710 Konfokalmikroskop (63x Plan Apochromatic Öl) mit einer z-Auflösung von 0,5 oder 1 μm.
- Wählen Sie verschiedene Zellen aus unabhängigen Hoden aus.
- Importieren Sie Bilder in Verarbeitungssoftware (z. B. Imaris).
- Definieren Sie den Kern durch manuelle Segmentierung, um die benachbarten Kerne auszuschließen. Verwenden Sie die Coloc-Software; Es sammelt die Pearson-Korrelationskoeffizienten (PCCs) innerhalb des gesamten Volumens zwischen 2 Fluorophoren.
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Ergebnisse
Das Haupthindernis für eine angemessene Färbung der Drosophila-Hoden ist die begrenzte Penetrabilität von Antikörpern, die teilweise durch die Verwendung von gequetschten Präparaten gelöst wurde, aber auf Kosten einer Einschränkung der 3D-Analysen (z. B. 3D-Darstellung oder Maß der Kolokalisierung). Das Verfahren ermöglicht eine einheitliche Kennzeichnung und bewahrt das Volumen aller Zellen des Hodens. Hier haben wir die Darstellung der Methode auf die 3D-Darstellung von S4-S5-Spermatozyten konzentriert, da diese die gr...
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Diskussion
Dieses Protokoll bietet eine Methode zur erfolgreichen Immunmarkierung von drosophila-Hoden bei Erwachsenen. Wie in anderen Verfahren berichtet, müssen junge Männer verwendet werden (wir haben sogar das Alter auf weniger als 20 Stunden nach der Eklosion verkürzt), um das Vorhandensein von sich entwickelnden Spermien zu minimieren, die die Spermatozyten behindern könnten. Die Dissektion sollte schnell sein und die Antikörperverdünnung muss angepasst werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis21,
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir danken P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura für Antikörper und A. Debec, den Lagerzentren Bloomington und Vienna für Fliegen. Danke an C. Jackson für Anregungen und anregende Diskussionen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Drosophila srains | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | Geschenk von A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, Frankreich) | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 15. Mai 2011; 124 (Teil 10): 1664-71. | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | Vienna Drosophila RNAi Center |
| Materials | |||
| DAPI | Thermo | D1306 | Stammlösung muss in H2O |
| Dumont # 5 Feinforseps hergestellt werden | Fine Science Tools | ||
| MBP Pipettenspitzen mit breiter Bohrung | Fisherbrand | 11917744 | Spitze mit großer Öffnung |
| Thermo Scientific 0,2 mL Einzelröhrchen | Thermo | AB-0620 | |
| 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen | Sigma | T3531-200EA | Silikonisierte 2ml Tube |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| Normales Ziegenserum (NGS) | Sigma | NS02L-1ML | |
| Paraformaldehyd 4% | Sigma | P6148-500G | Paraformaldehyd (4%) gelöst in PBS 1X ; aliquot um 600 ml |
| PBS 1X | Thermo | 14190094 | DPBS, kein Calcium, kein Magnesium |
| 0,1% (0,2 oder 0,3%) PBS-T | PBS 1X mit 0,1% (0,2 % bzw. 0,3%) Triton X-100 | ||
| Triton X-100, für die Molekularbiologie | Sigma | T8787 | |
| Antikörper | |||
| GFP Booster | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| Maus anti-Mtor | 1/40 Geschenk von J. Johansen, Iowa State University | ||
| Ratte anti-Nup62 | 1/200 Geschenk von H. Ohkura (University of Edinburgh, UK | ||
| Meerschweinchen anti-Ulp1 | 1/200 Geschenk von C. P. Verrijzer, Erasmus Universität, Rotterdam | ||
| Rabbit Anti-Raf2 | 1/200 Geschenk von C. P. Verrijzer, Erasmus Universität, Rotterdam | ||
| DyLight konjugierte Serie | 1/500 Esel Anti-(Meerschweinchen, Maus, Kaninchen oder Ratte) als zweite Antikörper |
Referenzen
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