Erzeugung humaner regulatorischer T-Zell-Klone

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Klonierung und Expansion von humanen regulatorischen T-Zellen zur Erzeugung von ultrahochreinen lebensfähigen humanen Treg mit stabiler Demethylierung in der Treg-spezifischen demethylierten Region (TSDR) und Treg-spezifischen phänotypischen Merkmalen.

Zusammenfassung

Humane regulatorische T-Zellen (Treg) sind aufgrund der aktuellen Methoden der Treg-Anreicherung notorisch schwer in hoher Reinheit zu isolieren. Diese Methoden basieren auf der Identifizierung von Treg durch mehrere aktivierungsabhängige zelluläre Oberflächenmarker mit unterschiedlichen Expressionsniveaus unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen. Populationen, die als "Treg" isoliert werden, enthalten daher oft eine beträchtliche Anzahl von Nicht-Treg-Effektorzellen (d.h. Teff), die die genaue phänotypische und funktionelle Charakterisierung dieser Zellen, ihre genomische und proteomische Charakterisierung, ihre zuverlässige Zählung in verschiedenen Gesundheits- und Krankheitszuständen sowie ihre Isolierung und Expansion zu therapeutischen Zwecken erschweren. Insbesondere Letzteres bleibt eine große Hürde, da die unbeabsichtigte Expansion von Effektorzellen, die sich in Treg-relevanten zellulären Kompartimenten (z. B. CD4⁺CD25⁺ T-Zellen) einnisten, die Treg-basierte Immuntherapie unwirksam oder sogar schädlich machen kann. In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, die die Probleme der populationsbasierten Isolierung und Expansion von Treg umgeht und zeigt, dass die Erzeugung von Treg-Kandidatenklonen mit der anschließenden Selektion, Kultivierung und Expansion von nur sorgfältig geprüften, monoklonalen Zellen die Erzeugung eines hochreinen Treg-Zellprodukts ermöglicht, das über viele Monate in Kultur gehalten werden kann, Dies ermöglicht die nachgelagerte Untersuchung dieser Zellen, auch für mögliche therapeutische Anwendungen.

Einleitung

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die In-vitro-Vermehrung von ultrahochreinem, klonalem humanem Treg zu ermöglichen. Die Isolierung von Treg-angereicherten Populationen und die anschließende Klonierung ermöglichen die Selektion der gewünschten Treg-Phänotypen und deren Erweiterung für die weitere Untersuchung der Biologie dieser Zellen, die Erforschung ihres potenziellen therapeutischen Nutzens und andere experimentelle nachgelagerte Anwendungen.

Die Klonierung von Treg führt zu einer deutlich besseren Treg-Reinheit als bei polyklonalen Isolations- und Expansionsansätzen. Dies ist auf den zuverlässigen, kontrollierten Ausschluss von T-Effektorzellen mit ähnlichen oder unterschiedlichen Phänotypen aus der gereinigten Population zurückzuführen, einschließlich FOXP3-exprimierender (FOXP3^intCD45RA^negCD25^int), Non-Treg und CD4⁺ CD25⁺ FOXP3-Teff ¹, unter anderem. Klonale Zelllinien, die auf diese Weise gewonnen werden, stehen nicht vor dem Problem des Überwachsens mit schnell expandierenden Nicht-Treg-Klonen, die eine sehr langfristige Expansion (d.h. mehrere Monate) und eine In-vitro-Kultur der Zellen praktisch unmöglich oder zumindest extrem schwierig machen. Klonale Treg ermöglichen auch eine umfassende Überprüfung ihrer phänotypischen Merkmale nach der Expansion, einschließlich durch Methoden, die als Standard für die Bewertung epigenetischer Merkmale anerkannt sind, die auf das bona fide natürliche Treg 1,2,3,4 beim Menschen hinweisen (z. B. stabile Demethylierung an der TSDR).

Die Treg-Expansion wurde hauptsächlich in Form einer polyklonalen Zellexpansion sowohl zu Untersuchungs- als auch zu therapeutischen Zwecken durchgeführt ^5,6,7. Die Problematik der Teff-Kontamination ist ein wesentliches Hindernis für die erfolgreiche Umsetzung von Treg-Zell-basierten Immuntherapieansätzen. Frühere Versuche, monoklonales Treg in der Literatur zu expandieren/zu erzeugen, sind rar und haben es nicht geschafft, die Aufrechterhaltung der Treg-Merkmale auf lange Sicht zu zeigen⁸.

Diese Methode ist für jeden interessant, der die zellulären, molekularen und metabolischen Eigenschaften von echten menschlichen Treg untersucht. Insbesondere das durch die Verwendung dieses Protokolls erzeugte hochreine Treg-Produkt eignet sich für Analysen mit genomischen Ansätzen. Angesichts der relativ niedrigen Expansionsraten, die für menschliche Treg im Allgemeinen charakteristisch sind, kann diese Methode für diejenigen, die eine schnelle Expansion einer großen Anzahl von Zellen anstreben, von begrenztem Nutzen sein. Angesichts der extrem hohen Reinheit des mit diesem Protokoll erzeugten Treg können jedoch kleinere Mengen von Treg eine ähnliche oder sogar bessere Wirksamkeit aufweisen als größere Expansionen polyklonaler Zelllinien, die Effektorzellen enthalten, die das gesamte suppressive Potenzial des erzeugten Produkts begrenzen.

Protokoll

Dieses Protokoll folgt allen institutionellen Richtlinien in Bezug auf die ethische Durchführung von Forschung, bei der menschliche Proben verwendet werden. Die Arbeit mit menschlichen Zellen und anderen menschlichen Blutprodukten muss mindestens in einer BSL-2-zertifizierten Umgebung erfolgen, die den BLS-2-Sicherheitsrichtlinien entspricht.

1. Voranreicherung von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes für CD4⁺CD127^loCD25^hi-Zellen

ACHTUNG: Verwenden Sie durchgehend sterile Technik. Entsorgen Sie scharfe Gegenstände sofort in einem geeigneten Behälter für scharfe Gegenstände. Bleichen Sie alles, was mit Blut und/oder Blutprodukten in Berührung gekommen ist, vor der Entsorgung. Arbeiten Sie in einer Biosicherheitswerkstatt.

1. Gewinnung von humanem peripherem Blut oder von Blutprodukten, die mit menschlichen Leukozyten (d. h. "Leukopaks") angereichert sind, aus peripheren Blutentnahmen oder Leukapherese. Zellen sofort bearbeiten.
   HINWEIS: Wenn die Lagerung über Nacht nicht vermieden werden kann, lagern und transportieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur (RT). Vermeiden Sie Kälte.
2. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) durch Gradientenzentrifugation über Dichtegradientenmedium, wie zuvor beschrieben⁹.
3. Zählen Sie PBMCs vorsichtig mit einem Hämozytometer oder Zellzähler. Wenn möglich, verwenden Sie mindestens 300 x 10⁶ PBMC, um mit der Treg-Isolierung fortzufahren.
4. Resuspendieren Sie PBMC in Isolationspuffer (2 % gepooltes humanes AB-Serum [PHS-AB] mit 1,5 mM EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS]) in einer Konzentration von 50 x 10⁶ Zellen/ml und fahren Sie mit der magnetischen Sortierung gemäß den Herstellerangaben des verwendeten Sortierkits fort. Verwenden Sie z. B. die magnetische Zellsortierung (Table of Materials) für die negative Isolierung einer CD4⁺CD127^lo T-Zellpopulation, gefolgt von der positiven Selektionssortierung für CD25⁺ -Zellen.
   HINWEIS: Für die magnetische Reinigung von Treg kann eine Vielzahl von Produkten verwendet werden, einschließlich säulenbasierter und säulenfreier Ansätze. Alternativ kann eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit Gating auf CD127^loCD25^hohen CD4⁺ T-Zellen durchgeführt werden. Eine vollständige Sterilität ist mit Standard-FACS-Geräten jedoch nicht möglich, was ein erhebliches Kontaminationsrisiko darstellt. Darüber hinaus können zelluläre Spannungen und Schäden, die durch das Fluidiksystem verursacht werden, nicht ausgeschlossen werden, und die Laserlaser des Instruments können die Ergebnisse beeinflussen.
5. Überprüfen Sie die resultierende Treg-angereicherte Population auf Reinheit durch Färbung auf CD4, CD3, CD127 und CD25 (Abbildung 1). Wählen Sie einen Anti-Human-CD25-Antikörper, der eine CD25-Bindungsdomäne erkennt, die sich von der im Sortierkit verwendeten unterscheidet, wie z. B. die in der Materialtabelle angegebene, um ein genaues Ergebnis zu erhalten. Färben und fixieren Sie Zellen unter Verwendung eines Standardprotokolls für die Oberflächenfärbung, wie es in Nowatzky et ^al.10 beschrieben ist.

2. Klonierung von Treg aus einer CD127^loCD25^hi vorangereicherten humanen CD4⁺ T-Zellsuspension

1. Resuspendieren Sie die Treg-angereicherten (CD4⁺CD127^loCD25^hi) Zellen, die in Schritt 1.4 in T-Zell-Medien ([TCM]; RPMI 1640, 5 % PHS-AB, 1 % Streptomycin/Penicillin, 1 % HEPES, 1 % nichtessentielle Aminosäuren und 1 % Glutamin) mit 300 IE/ml humanem rekombinantem Interleukin-2 (IL-2) (Materialtabelle) mit dem Ziel einer Konzentration von ~1-3 x 10⁶ Zellen/ml und Anzahl. Holen Sie sich mindestens drei separate Zellzählungen und berechnen Sie die durchschnittliche Zellzahl, bevor Sie fortfahren, da genaue Zählungen absolut entscheidend sind.
2. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension von Zellen in zwei Konzentrationen vor: (1) 3 Zellen/ml und (2) 6 Zellen/ml. Laden Sie fünf 96-Well-Platten mit rundem Boden mit 100 μl/Well Suspension 1 und fünf Platten mit Suspension 2. Achten Sie beim Laden der Platten sehr darauf, die Zellen in Schwebe zu halten, um eine Verteilung von 0,3 bzw. 0,6 Zellen/Vertiefung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Erhöhen Sie die Zellkonzentration nicht auf 1 Zelle/Well, da dies das Risiko erhöht, oligoklonale Zelllinien und keine echten Klone zu erhalten.
3. Präparation von Feederzellen aus frisch isolierten humanen allogenen PBMCs, die durch Dichtegradientenzentrifugation wie in Schritt 1.2 gewonnen wurden.
4. Bereiten Sie mindestens 10 x 10⁶ Feederzellen pro Klonierungsplatte für die Bestrahlung vor, indem humane allogene PBMCs in der TCM ohne IL-2 in einem 50 mL Polypropylenröhrchen in einer Konzentration von ~10 x 10⁶ PBMC/ml resuspendiert werden. Verschließen Sie die Röhre fest und bestrahlen Sie mit 35 Gy entweder in einem Gammastrahler oder einem röntgenbasierten Bestrahlungsgerät.
   HINWEIS: Die Bestrahlung löst die Sekretion großer Mengen von Zytokinen aus den Feedern aus, die die Proliferation von Teff erleichtern, aber die Treg-Expansion beeinträchtigen können. Diese werden anschließend durch Waschen entfernt.
5. Die Zellen werden bei 450 x g und RT für 5 min nach der Bestrahlung zentrifugiert und der Überstand aspiriert. Waschen Sie die Zellen durch Resuspendierung in der TCM ohne IL-2 mit mindestens dem 10-fachen des pelletierten Dosierzellenvolumens von Medien/PBS.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Expressionsprofil des humanen Leukozytenantigens (HLA) der zu klonierenden Spenderzellen zu bestimmen. Dies kann durch einfache Färbung für einen oder mehrere HLA-Typen erfolgen, die in der Population, aus der der jeweilige Spender stammt, häufig vorkommen (z. B. HLA-A2 oder HLA-A24). PBMC, die als Feederzellen verwendet werden, sollten dieses HLA nicht exprimieren, um eine Reidentifikation/Isolierung von Zielzellen aus Expansionskulturen vor der bestrahlungsinduzierten Apoptose der Feeder zu ermöglichen.
6. Resuspendieren Sie die bestrahlten und gewaschenen Feederzellen in der TCM mit 300 IE/mL IL-2 in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/mL.
7. Geben Sie Phytohämagglutinin-L (PHA-L) (Materialtabelle) in einer Konzentration von 4 μg/ml (2x die erforderliche Konzentration in Kultur) hinzu und fahren Sie schnell mit Schritt 2.8 fort.
8. Geben Sie 100.000 bestrahlte Feeder-Zellen in 100 μl TCM mit 4 μg/mL PHA-L und 300 IE/mL IL-2 zu den plattierten Treg-angereicherten Zellen, was zu einem Gesamtvolumen von 200 μl und einer PHA-L-Konzentration von 2 μg/mL in jeder Vertiefung führt. Gut mischen, indem Sie 5x auf und ab pipettieren. Die Expositionszeit der Feederzellen gegenüber PHA-L vor ihrer Zugabe zum Treg auf das absolut erforderliche Minimum begrenzen und bis zur Plattierung in Suspension halten.
   HINWEIS: Stellen Sie eine PHA-L-Konzentration von 2 μg/ml in der Kultur beim ersten Aussaatschritt sicher, verwenden Sie jedoch eine niedrigere Konzentration von 1 μg/ml bei der nachfolgenden Expansion von Treg-Klonen. Verwenden Sie durchgehend 300 IE/ml IL-2.
9. Inkubieren bei 37 °C. Wechseln Sie 50% der Medien mit TCM mit 300 IE/mL IL-2, aber ohne PHA-L an den Tagen 5-7.

3. Expansion von Treg und Erhaltung von Klonen in Kultur

1. Überprüfen Sie die Kulturen ab Tag 12 auf das Vorhandensein von Pellets proliferierender Zellen.
   HINWEIS: Es wird Pellets geben, die von Feederzellen gebildet werden, aber bei mikroskopischer Untersuchung erscheinen diese als kleine, runde, sterbende oder tote Zellen, während proliferierende T-Zellen größer sind, einen hellen Kontrast und ein gesundes Aussehen aufweisen und oft Cluster benachbarter Zellen bilden, die bei makroskopischer Untersuchung braun erscheinen.
2. Untersuchen Sie die Kulturen weiterhin alle 1-2 Tage. Isolieren Sie proliferierende vorläufige Klone, indem Sie sie auf einzelne Vertiefungen übertragen. Platzieren Sie jeden vorläufigen Klon auf einer einzigen 96-Well-Platte, um eine Kreuzkontamination eines bestimmten vorläufigen oder etablierten Klons durch versehentlichen Zelltransfer aus anderen Wells zu vermeiden.
3. Halten Sie die Zellen alle 2-3 Tage durch 50%ige Medienwechsel und teilen Sie sie nach Bedarf. Überwachen Sie die Zellen genau.
   HINWEIS: Das Verzögern von Medienwechseln und Teilung kann Zellen schädigen und eine "Überteilung" kann ihre Proliferation stoppen und zum Zelltod führen.
4. Restimulieren Sie die Zellen mit bestrahlten allogenen Feedern, wie in den Schritten 2.3-2.9 beschrieben, verwenden Sie jedoch niedrigere PHA-L-Konzentrationen (d. h. 1 μg/ml in der TCM mit 300 IE/ml IL-2). Restimulieren Sie, wenn die Zellgröße abnimmt und die Zellen rund werden, im Gegensatz zu einem länglichen Oval, was typischerweise nach 2-3 Wochen der Fall ist.
   HINWEIS: Bewahren Sie die ursprüngliche Klonierungskultur mindestens 6-8 Wochen lang auf. Viele der "frühen" Klone, die bei oder kurz nach 2 Wochen sichtbar werden, sind in der Regel keine echten Treg-Zellen, sondern schnell proliferierende Nicht-Treg/Teff-Zellen und fallen bei der Überprüfung mit größerer Wahrscheinlichkeit durch als "späte" Zellen, von denen einige mehr als 1 Monat brauchen, um sichtbar in Kultur zu erscheinen.

4. Überprüfung von vorläufigen Treg-Klonen

1. Beginnen Sie mit der Überprüfung von vorläufigen Klonen, sobald sie auf ~1 x 10⁶ Zellen proliferiert sind, auf Monoklonalität und TSDR-Methylierungsstatus.
2. Optional können Zellerweiterungen durch Färbung auf CD3, CD4, CD127 und CD25 voruntersucht werden, um die interessierenden (d. h. CD3⁺CD4⁺CD127^loCD25^hi) für die weitere Beurteilung zu identifizieren (Abbildung 2).
3. Etablierung der Monoklonalität durch Identifizierung des Vorhandenseins einer einzelnen Vβ-Kette im zellulären Produkt durch Vβ-Färbung unter Verwendung von Sätzen kommerziell erhältlicher Färbeantikörper (Materialtabelle; Abbildung 3) Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass mindestens 1 x 10⁶ Ereignisse erfasst werden, wenn Proben auf einem Durchflusszytometer durchgeführt werden, um eine zuverlässige Analyse zu gewährleisten, damit geringfügig kontaminierende Populationen nachgewiesen werden können. Verwende einen Viabilitätsfarbstoff.
4. Der TSDR-Methylierungsstatus am FOXP3-Locus wird von kommerziellen Anbietern oder intern bewertet^11,12. Erhalten Sie mindestens 1 x 10⁵ Zellen für adäquate Ergebnisse.
5. Sobald die Treg-Identität und Klonalität in den Schritten 4.3 und 4.4 bestätigt wurden, können die Zellen kryokonserviert oder für nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden.
   HINWEIS: Alternative, aber weit weniger zuverlässige Überprüfungsansätze sind die Bestimmung des Treg-Phänotyps durch FACS-Färbungen ^1,10 und in vitro oder in vivo Suppressionsassays^13,14. Vermeiden Sie eine übermäßige Abhängigkeit von Treg-Suppressionsassays¹³. Die Assays basieren typischerweise, aber nicht ausschließlich, auf der Kokultur von Treg in abgestufter Anzahl mit Responder-T-Zellen (d. h. PBMC oder gereinigten T-Zellen, manchmal Treg-depletiert) in Gegenwart von Antigen-präsentierenden Zellen Dritter oder CD3/CD28 mit Farbstoffverdünnung, die die Proliferation als Auslesung darstellt. Viele dieser Assays weisen schwerwiegende Einschränkungen auf und können den tatsächlichen Grad der durch Treg vermittelten Suppression entweder über- oder unterschätzen. Der TSDR-Methylierungsstatus ist nach wie vor das eindeutigste/zuverlässigste Maß für den Treg-Phänotyp oder die "Identität"^3,15,16. Beachten Sie, dass sich FOXP3 auf dem X-Chromosom befindet und bei Frauen ein X-Chromosom durch DNA-Methylierung inaktiviert wird, was die Ergebnisse der TSDR-Methylierungsanalyse beeinflusst.

5. Kryokonservierung von Treg

HINWEIS: Treg kann nach erfolgreicher Kryokonservierung mit DMSO und PHS-AB langfristig gelagert werden.

1. Bestimmen Sie die Anzahl der Kryofläschchen, die für die Kryokonservierung der Zellen erforderlich sind. Dies entspricht dem gesamten Endvolumen der zu kryokonservierenden Zellsuspension (in ml), da 1 ml pro Durchstechflasche eingefroren wird. Fügen Sie diesem Volumen eine Sicherheitsmarge von 10 % hinzu, um Verluste durch Pipettieren/Oberflächenspannung auszugleichen.
   HINWEIS: Zellen können in einem weiten Konzentrationsbereich kryokonserviert werden, typischerweise zwischen 0,1 und 100 x 10⁶ Zellen/ml.
2. Beschriften Sie die Kryofläschchen.
3. Lösung A (SA) erzeugen: 50 % RPMI und 50 % PHS-AB oder menschliches Plasma mischen. Wenn Plasma verwendet wird, bei 2.000 x g für 20 min bei 4 °C schleudern.
   HINWEIS: Das Volumen von SA sollte 75 % des gesamten endgültigen Volumens der zu kryokonservierenden Zellsuspension betragen, wie in Schritt 5.1 bestimmt.
4. Lösung B (SB) erzeugen: 60 % (v/v) PBS oder RPMI und 40 % (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) mischen.
   HINWEIS: Das SB-Volumen sollte 25 % des gesamten Endvolumens der zu kryokonservierenden Zellsuspension betragen, wie in Schritt 5.1 bestimmt.
5. Beide Lösungen auf 4 °C abkühlen lassen.
6. Bereiten Sie das Gefriermedium vor, indem Sie alles SB mit gleichen Teilen SA mischen und auf Eis legen.
7. Treg aus Schritt 4.5 bei 450 x g für 5 min bei 4 °C drehen. Medien aspirieren und verwerfen, Zellen im verbleibenden eiskalten SA resuspendieren und auf Eis halten.
8. Geben Sie das gekühlte Gefriermedium langsam 1:1 zu den in SA resuspendierten Zellen in einem großen Röhrchen auf Eis, während Sie das Röhrchen schütteln.
9. Schnell in Kryoröhrchen mit 1 ml/Fläschchen aliquotieren. Stellen Sie die Kryofläschchen sofort in eine Schrankbox bei RT und stellen Sie sie unverzüglich in einen -80 °C Gefrierschrank. Nach 24 h in die Flüssigkeit N₂ überführen.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Implementierung dieses Protokolls wird zur Generierung stabiler humaner regulatorischer T-Zell-Klone und -Linien führen.

Die Vorselektion/Voranreicherung von CD4⁺CD127^loCD25^hi-Zellen war eine einfache Methode, um eine Ausgangspopulation zu erhalten, die den größten Teil des menschlichen Treg enthielt (Abbildung 1A–C). Nicht alle Klone zeigten einen Treg-Phänotyp. Das Prescreening von Klonen durch M...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Vermehrung von hochreinen humanen regulatorischen T-Zellen durch die Isolierung, Expansion und sorgfältige Überprüfung von Zellen, die in einem auf begrenzenden Verdünnungs- und Feederzell-basierten Expansion aus Treg-haltigen Startpopulationen gewonnen wurden.

Kritische Schritte bei diesem Ansatz sind: 1) die Wahl einer geeigneten Ausgangspopulation. Im Allgemeinen enthält das CD127^loCD25 hi-Kompartiment von CD4^...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 &Mikro; m Stericup, 500 mL	Millipore	5500	Medienlagerung und -aufbereitung
100x nichtessentielle Aminosäuren	Gibco	11140-050	Medienkomponente
15 mL konische Zentrifugenröhrchen (50/Beutel, Karton à 500)	ThermoFisher Scientific	339650
1M HEPES	Gibco	15630-080	Medienkomponente
25 ml Single Well Pipettenbecken	Fischer Scientific	13-681-508
50 mL Konisches Zentrifugenröhrchen (25/Hülse)	ThermoFisher Scientific	339652
50x Penicillin Streptomycin Soln	Corning Corning	, 30-001-Cl	Medienkomponente
CryoTube Fläschchen Int Gewinde Rund Btm Starfoot PP Schraubverschluss Steril PP 1,8 mL	Nalge Nunc	377267
DMSO	Corning	25-950-CQC
EasySep Human CD25 Positive Selection Kit	Stemcell Technologies	18231	Alternativen sind FACS oder MACS säulenbasierte Sortierung
EasySep Human CD4+CD127low T-cell Pre-Enrichment Kit	Stemcell Technologies	19231	Alternativen sind FACS oder MACS säulenbasierte Sortierung
EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T cell Isolation Kit (Alternative zu Artikel 12)	Stemcell Technologies	18063	Alternativen sind FACS- oder MACS-säulenbasierte Sortierung
Ficoll	GE Healthcare	17-5442-03	PBMC-Aufreinigung aus peripherem Blut von Leukaphereseprodukten; Dichtegradientenmedium
Human AB Serum (PHS-AB)	Valley Biomedical Inc	HP1022	Medienkomponente
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, für UV-Anregung	Thermo Fischer	L-34962	Viability Farbstoff
Phytohämagglutinin-L (PHA-L)	Millipore/Sigma	11249738001	T-Zell-Stimulation
Rekombinantes IL-2 (z. B. PROLEUKINâ )	Prometheus-T-Zell-Stimulation		und -Wartung/ Medienkomponente
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Medienkomponente
Färbeantikörper für die Durchflusszytometrie (Treg-Phänotypisierung)	Siehe "Kommentare"	Siehe "Kommentare"	Färbeantikörper sind eingetragen in: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. Falls EasySep Humanes CD25-Positivauswahlkit verwendet wird, färben Sie es mit 2A3 oder BC96 Anti-CD25-Antikörper, z. B.: Brilliant Violet 421 Anti-Human-CD25-Antikörper (Biolegend; 302629)
TCR Vβ Repertoire-Kit; IOTest Beta Mark	Beckman Coulter	PN IM3497	Überprüfung von Erweiterungen für Monoklonalität
Gewebekulturplatte, 96 Well, U-Boden mit niedrigem Verdampfungsdeckel	Corning	353077