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Methodenartikel

Entdeckung von Treiber-Genen in kolorektalen HT29-abgeleiteten Krebs-Stamm-ähnlichen Tumorsphären

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DOI:

10.3791/61077

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22. Juli 2020

 ,  ,  , 
1Radiation Biology Research Center, Institute for Radiological Research, Chang Gung University, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, Chang Gung University, 3Department of Radiation Oncology, Chang Gung Memorial Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Mackay Memorial Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um die überexprimierten Treibergene zu entdecken, die die etablierten krebsstammähnlichen Zellen, die aus kolorektalen HT29-Zellen gewonnen wurden, aufrecht erhalten. RNAseq mit verfügbarer Bioinformatik wurde durchgeführt, um Genexpressionsnetzwerke zu untersuchen und zu untersuchen, um einen potenziellen Mechanismus zu erhellen, der am Überleben von gezielten Tumorzellen beteiligt ist.

Zusammenfassung

Krebsstammzellen spielen eine wichtige Rolle gegen klinische Therapien und tragen zum Tumorrückfall bei. Es gibt viele Onkogene, die an der Tumorgenesese und der Initiierung von Krebsstammeigenschaften beteiligt sind. Da die Genexpression bei der Bildung von Darmkrebs-abgeleiteten Tumorsphären unklar ist, braucht es Zeit, um die Mechanismen zu entdecken, die an einem Gen nach dem anderen arbeiten. Diese Studie zeigt eine Methode, um schnell die Treibergene zu entdecken, die am Überleben der darmkrebsstammzellen in vitro beteiligt sind. Kolorektal-HT29-Krebszellen, die den LGR5 exprimieren, wenn sie als Sphäroide kultiviert werden und eine Erhöhung der CD133-Stammtonmarker begleiten, wurden ausgewählt und in dieser Studie verwendet. Das vorgestellte Protokoll wird verwendet, um RNAseq mit verfügbarer Bioinformatik durchzuführen, um die überexprimierten Treibergene bei der Bildung von kolorektalen HT29-abgeleiteten stammähnlichen Tumorsphären schnell aufzudecken. Die Methodik kann schnell untersuchen und potenzielle Treibergene in anderen Krankheitsmodellen entdecken.

Einleitung

Darmkrebs (CRC) ist eine der Haupttodesursachen mit hoher Prävalenz und Sterblichkeit weltweit1,2. Aufgrund von Genmutationen und Amplifikationen wachsen Krebszellen ohne proliferative Kontrolle, was zum Zellüberlebenbeiträgt 3, Anti-Apoptose4und Krebsstamm55,6,7. Innerhalb eines Tumorgewebes ermöglicht die Tumorheterogenität Tumorzellen, sich anzupassen und während der therapeutischen Behandlungen zu überleben8. Krebsstammzellen (CSCs), mit einer höheren Rate an Selbsterneuerung und Pluripotenz als Differentialkrebsarten, sind hauptsächlich für Tumorrezidiv9,10 und metastasierendes CRC11verantwortlich. CSCs präsentieren mehr Arzneimittelresistenz12,13,14 und Anti-Apoptose-Eigenschaften15,16, also überlebende Tumor-Chemotherapien.

Hier wurde RNAseq durchgeführt, um den möglichen Mechanismus für den Stamminstand in den ausgewählten CRC-Stammzellen zu untersuchen, um differenziell exprimierte Gene in Tumorsphäroiden zu untersuchen. Die Krebszellen können Sphäroide (auch Tumorsphären genannt) bilden, wenn sie unter niedrigen Adhärenzbedingungen angebaut und durch Wachstumsfaktoren stimuliert werden, die dem kultivierten Medium hinzugefügt werden, einschließlich EGF, bFGF, HGF und IL6. Daher haben wir CRC HT29 Tumorzellen ausgewählt, die Chemotherapien mit einer Erhöhung der phosphorylierten STAT3 widerstehen, wenn sie mit Oxaliplatin und Irinotecon17behandelt werden. Darüber hinaus drückte HT29 höhere Stammhenmarker aus, wenn sie in den beschriebenen Kulturbedingungen kultiviert wurden. Das HT29-abgeleitete CSC-Modell exprimierte höhere Mengen an leucin-reichem, repeat-haltigem G-Protein-gekoppeltem Rezeptor 5 (LGR5)18, einem spezifischen Marker von CRC-Stammzellen19,20. Darüber hinaus ist CD133, der als allgemeiner Biomarker für Krebsstammzellen gilt, auch in der HT29-Zelllinie21stark exprimiert. Ziel dieses Protokolls ist es, Gruppen von Treibergenen in den etablierten krebsstammähnlichen Tumorsphären zu entdecken, die auf bioinformatischen Datensätzen basieren, im Gegensatz zur Untersuchung einzelner Onkogene22. Es untersucht mögliche molekulare Mechanismen durch RNAseq-Analyse, gefolgt von verfügbaren Bioinformatik-Analysen.

Die Sequenzierung der nächsten Generation ist eine hochdurchsatzbasierte, leicht verfügbare und zuverlässige DNA-Sequenzierungsmethode, die auf rechnerischer Hilfe basiert und zur umfassenden Darstellung von Treibergenen zur Steuerung von Tumortherapien verwendet wird23. Die Technologie wird auch zum Nachweis der Genexpression aus der umgekehrten Transkription einer isolierten RNA-Probe24verwendet. Beim Screening mit RNAseq haben die wichtigsten Gene, die mit der Therapie ins Visier nehmen sollen, jedoch möglicherweise nicht die höchste Expressionsdifferenz zwischen Versuchs- und Kontrollproben. Daher wurden einige Bioinformatik für die Klassifizierung und Identifizierung von Genen auf der Grundlage aktueller Datensätze wie KEGG25, GO26,27oder PANTHER28entwickelt, einschließlich Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 und NetworkAnalyst30. Dieses Protokoll zeigt die Integration von RNAseq und NetworkAnalyst, um schnell eine Gruppe von Genen in den ausgewählten HT29-abgeleiteten Sphäroiden im Vergleich zu elterlichen HT29-Zellen zu entdecken. Die Anwendung dieser Methode auf andere Krankheitsmodelle wird auch vorgeschlagen, um Unterschiede in wichtigen Genen zu entdecken.

Im Vergleich zur Untersuchung der individuellen Genexpression bietet eine Hochdurchsatztechnik Vorteile, um potenzielle Treibergene für die Tumorpräzisionsmedizin leicht zu finden. Mit nützlichen Datensätzen wie KEGG, GO oder PANTHER können spezifische Gene anhand der Krankheitsmodelle, Signalwege oder spezifischer Funktionen identifiziert werden, was eine schnelle Fokussierung auf bestimmte, wichtige Gene ermöglicht, wodurch Zeit und Forschungskosten gespart werden. Eine ähnliche Anwendung wird in früheren Studienverwendet 14,18,31. Insbesondere ist ein Tumor komplizierter, weil verschiedene Arten von Tumoren unterscheidende Gene und Wege für Überleben und Proliferation ausdrücken. Daher kann dieses Protokoll Gene aufnehmen, die verschiedene Tumortypen unter verschiedenen Umständen unterscheiden. Es besteht das Potenzial, wirksame Strategien gegen Krebs zu finden, indem man den Mechanismus der spezifischen Genexpression versteht.

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Protokoll

1. Zellkultur und Tumorsphärenbildung

  1. Kultur HT29-Zellen in einer 10 cm Schale, die Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Antibiotikum (P/S) enthält.
  2. Wachsen Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit unter aseptischen Bedingungen, bis sie 80% Konfluenz erreichen.
  3. Trypsinisieren Sie HT29-Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin für 5 min bei 37 °C und neutralisieren Sie das Trypsin folglich durch Zugabe von 2 ml DMEM mit 10% FBS und 1% P/S.
  4. Zählen Sie die HT29-Zellen mit einem Hämozytometer.
  5. Fügen Sie 2.000 Zellen/Gut zu einem niedrigen befestigten 6 Wellplatten mit 2 ml serumfreiem DMEM mit 1% P/S hinzu und werden mit 0,2% B27 ergänzt, 20 ng/ml des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), 20 ng/ml des Fibroblastenwachstumsfaktors (bFGF), 20 ng/ml Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) und 20 ng/ml Interleukin 6 (IL6).
  6. Wachsen Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit unter aseptischen Bedingungen.
  7. Fügen Sie alle 2 Tage 0,5 ml Krebsstammzellmedium hinzu, bis die Tumorsphären mindestens 7 Tage lang einen Durchmesser von >100 m messen.
  8. Beobachten und messen Sie den Tumorkugeldurchmesser mit einem invertierten Mikroskop mit einem digitalen Zellbildsystem.
  9. Wenn die Tumorsphären einen Durchmesser von >100 m erreichen, versuchen Sie die Tumorsphären mit 0,25% Trypsin für 5 min bei 37 °C und neutralisieren das Trypsin, indem man das 2-fache des Wachstumsmediums hinzufügt. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
  10. Zentrifugieren Sie bei 1.200 U/min für 10 min und entfernen Sie den Überstand.
  11. Inkubieren Sie 5 x 104 Zellen mit 2 l Anti-LGR5-PE und 2 l Anti-CD133-PE in 100 l DMEM einzeln für 30 min bei Raumtemperatur, schütteln bei 200 Rpm.
    HINWEIS: CD133 ist ein allgemeiner Krebsstammzell-Biomarker, der in HT29-Zellen stark exprimiert wird.
  12. Fügen Sie 900 L PBS hinzu und analysieren Sie den LGR5- und CD133-Ausdruck mithilfe der Durchflusszytometrie. Eine Änderung der Fluoreszenz im FL2-H-Kanal weist auf die Genexpression hin.

2. RNA-Isolation

HINWEIS: Verwenden Sie ein kommerzielles Kit (siehe Tabelle der Materialien) mit einer schnellen Spalte für die RNA-Isolierung nach den Anweisungen des Herstellers.

  1. Fügen Sie den geernteten Zellen (2 x 105 Zellen) 50 L PBS hinzu und setzen Sie sie mit Pipetten wieder auf.
  2. Fügen Sie 200 l Lysepuffer hinzu, der 2 l Beta-Mercaptoethanol enthält. Wirbel schnell und lassen Sie für 5 min stehen.
  3. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 16.000 x g für 10 min. Sammeln Sie den Überstand und mischen Sie mit 200 l 70% Ethanol.
  4. Verwenden Sie die beigefügte Säule, um das Lösungsmittel durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 1 min zu entfernen.
  5. Waschen Sie mit Waschlösung 1 und 2, um Nicht-RNAs durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 1 min vollständig zu entfernen.
  6. Zentrifuge wieder bei 14.000 x g für 2 min, um Restethanol zu entfernen.
  7. 50 l destilliertes Wasser, Zentrifuge bei 14.000 x g für 1 min hinzufügen und die Lösung sammeln.
  8. Messen Sie die RNA-Konzentration mit OD260 mit einem Spektralphotometer.
    RNA-Konzentration (g/ml) = (OD260) x (40 g RNA/ml) und OD260/OD280 > 2. RNA-Proben sollten eine RNA-Integritätsnummer (RIN) > 7 haben.

3. RNAseq Profiling und Bioinformatik-Analyse

HINWEIS: Die RNAseq-Analyse wurde kommerziell durchgeführt (siehe Materialtabelle), um die Differentialgene in den HT29-abgeleiteten Tumorsphären im Vergleich zu elterlichen HT29-Zellen zu untersuchen.

  1. Nutzen Sie kommerzielle Dienste für RNAseq-Schritte, einschließlich Bibliothekserstellung, Bibliotheksqualitätskontrolle und DNA-Sequenzierung.
  2. Der Datenbericht sollte wichtige Informationen enthalten, einschließlich der Leseanzahl, der log2-Faltänderung und des p-Werts. Wählen Sie die Differentialgene nach den folgenden Parametern aus: Gene mit einer > 1-Log2-Falzänderung mit Lesezahlen >100 in der HT29-Tumorsphärengruppe und Gene <-1-Log2-Falzänderung mit Leseanzahl >100 in der HT29-Elterngruppe. In diesem Fall wurde ein p-Wert < 0,05 als akzeptabel angesehen, und die Daten wurden verwendet (Tabelle 1).
    HINWEIS: Hier wurde eine Genanzahl >100 als Schwellenwert verwendet, um die Untersuchung eines bestimmten Gens fortzusetzen und seine Expression zu validieren.
  3. Verwenden Sie statistische Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien), um eine Heatmap anzuzeigen und überexprimierte Gene >1 und herunterregulierte Gene < 1 in log2-Faltenänderung zu identifizieren.
  4. Verwenden Sie R-Software, um das Volcano Plot mit x: log2 Faltenwechsel zu zeichnen; y: -log10 (p-Wert), um die Differentialgene anzuzeigen.
    1. Installieren der R-Bibliothek
      install.packages(library(calibrate))
    2. Lesen Sie die Daten in RStudio mit dem folgenden Programm:
      res <-read.csv("/Users/xxx.csv", header=T)
      kopf(res)
      with(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29", xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0"))
      with(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange>1), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="red"))
      with(subset(res, pvalue<.05 & log2FoldChange<(-1)), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="blue"))
      with(subset(res, pvalue>.05), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444"))
      abline(h=1.3, lty=2)
      abline(v=1, lty=2)
      abline(v=(-1), lty=2)
    3. Führen Sie den Lauf aus, um das Vulkandiagramm abzuerhalten.

4. Treiber-Gen-Auswahl

  1. Wählen Sie Single Gene Input in NetworkAnalyst aus.
  2. Kopieren und einfügen Sie die ausgewählten überexprimierenden Gene aus Tabelle 1 mit "menschlich" als Organismus und ID-Typ Official Gene Symbolangegeben.
    HINWEIS: Alternativ können Sie Ensembl Gene ID zum Kopieren und Einfügen verwenden.
  3. Fügen Sie die Daten ein, indem Sie auf Hochladen klicken und fortfahren, um sie mithilfe der Protein-Protein-Interaktion (PPI) nach genetischem PPI zu analysieren.
  4. Verwenden Sie die STRING interactome-Datenbank mit einem Konfidenz-Score-Cutoff von 900, um die Samengene zu zeigen, die die hochgeladenen Gene miteinander vernetzen. Die Samengene, die mit mehr einzelindividuellen Genen assoziiert sind, wurden als Treibergene ausgewählt, die an der Aufrechterhaltung der Bildung von HT29-abgeleiteten Tumorsphären beteiligt sein können.
    HINWEIS: Es gibt drei interactome-Datasets für die Verwendung: IMEx, STRING und Rolland. STRING enthält experimentellere Beweise für höheres Vertrauen. Mit niedrigeren hochgeladenen Genzahlen kann IMEx ausgewählt werden, um die Treibergene in den interactome-Netzwerken vorherzusagen und aufzunehmen.
  5. Wählen Proceed Sie In der Zuordnungsübersicht fortfahren aus.
  6. Wählen Sie Weiß im Hintergrund und Force Atlas im Layout-Regler aus.
  7. Wählen Sie PANTHER BP, um die Upregulation-Gengruppe zu analysieren.
    HINWEIS: Dies zeigt, dass HSPA5 in dieser Studie für Die Anti-Apoptose in den HT29-abgeleiteten Tumorsphären verantwortlich war (Abbildung 3A). Um das spezifische Funktionsfeld einzugrenzen, kann die KEGG-, GO- oder PANTHER-Klassifikation alternativ verwendet werden, um die spezifischen Treibergene auszuwählen.

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Ergebnisse

Um das Modell für die Untersuchung des Mechanismus in Krebsstammzellen zu etablieren, wurden kolorektale HT29-Zellen verwendet, um die krebsstammartigen Tumorsphären in vitro in einer Low-Attachment-Platte zu kultizieren, die B27, EGF, bFGF, HGF und IL6 enthält. Die Tumorsphären >100 m im Durchmesser wurden in 7 Tagen gebildet (Abbildung 1A). Die Tumorsphären wurden zu einzelnen Zellen trypsinisiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um LGR5- und CD133-Expression zu erkennen. LG...

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Diskussion

In dieser Studie wurden kultivierte Krebsstamm-ähnliche Tumorsphären als Modell zur Analyse von RNAseq-Daten mit verfügbarer Bioinformatik verwendet. Für ein Krankheitsmodell wurden HT29-abgeleitete Tumorsphären verwendet. Da die Tumorsphären eine Arzneimittelresistenz gegen Tumortherapien haben, kann das etablierte Modell verwendet werden, um die detaillierten Mechanismen der Resistenz zu untersuchen, indem Unterschiede in der Genexpression untersucht werden. Darüber hinaus bietet die Genomtechnologie mit RNAseq mit ver...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine relevanten finanziellen Angaben.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Radiation Biology Core Laboratory des Institute for Radiological Research, Chang Gung Memorial Hospital, für die technische Unterstützung. Diese Studie wurde durch Stipendien des Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1J0321), des Cheng Hsin General Hospital (CHGH 106-06) und des Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 und MMH-106-61) unterstützt. Die Förderstellen hatten keinen Einfluss auf die Gestaltung der Studie und die Datenerhebung, Analyse und Interpretation von Daten oder auf das Schreiben des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
iRiS Digital Cell Imaging SystemLogos Biosystems, IncI10999zur Beobachtung der Bildung von Tumorsphären
DurchflusszytometrieBD biosciencesFACSCaliburzum Nachweis von LGR5 und CD133 in den Tumorsphären
Anti-LGR5-PEBiolegend373803LGR5 Detektion Reagenz
anti-CD133-PEBiolegend372803CD133 Detektion Reagenz
EGFGenScriptZ00333für die Kultivierung von Tumorsphären
bFGFGenScriptZ03116für die Kultivierung von Tumorsphären
HGFGenScriptZ03229für die Kultivierung von Tumorsphären
IL6GenScriptZ03034für die Kultivierung von Tumorsphären
PureLink RNA ExtraktionskitInvitrogen12183025Isolat Gesamt-RNA für die RNAseq-Analyse
RNAseq-LeistungBiotools, TaiwanDie RNAseq-Analyse wird kommerziell von Biotools, Ttaiwan
NetworkAnalystInstitute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canadahttp://www.networkanalyst.ca/
PrismGraphPad Softwaredurchgeführt, einer statistischen Analysesoftware

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