Methodenartikel

Modell der ischämischen Herzkrankheit und videobasierter Vergleich der Kardiomyozytenkontraktion mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten

DOI:

10.3791/61104

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5. Mai 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren ein Modell der ischämischen Herzkrankheit mit Kardiomyozyten aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen, zusammen mit einer Methode zur quantitativen Bewertung von Gewebeschäden, die durch Ischämie verursacht werden. Dieses Modell kann eine nützliche Plattform für das Screening von Arzneimitteln und weitere Forschung endemische Herzkrankheiten bieten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ischämische Herzerkrankungen sind weltweit eine bedeutende Todesursache. Es wurde daher sehr viel erforscht, oft mit Kleintiermodellen wie Nagetieren. Die Physiologie des menschlichen Herzens unterscheidet sich jedoch deutlich von der des Nagetierherzens, was die Notwendigkeit klinisch relevanter Modelle zur Untersuchung von Herzerkrankungen unterstreicht. Hier stellen wir ein Protokoll zur Modellierung ischämischer Herzerkrankungen mit Kardiomyozyten vor, die sich von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-CMs) unterscheiden, und um die Schäden und funktionellen Beeinträchtigungen der ischämischen Kardiomyozyten zu quantifizieren. Die Exposition gegenüber 2% Sauerstoff ohne Glukose und Serum erhöht den Prozentsatz der verletzten Zellen, der durch Färbung des Zellkerns mit Propidiumjodid angezeigt wird, und verringert die zelluläre Lebensfähigkeit. Diese Bedingungen verringern auch die Kontraktilität von hiPS-CMs, wie durch die Verschiebungsvektorfeldanalyse von mikroskopischen Videobildern bestätigt. Dieses Protokoll kann darüber hinaus eine praktische Methode für personalisierte Arzneimittelscreenings bieten, indem es die Verwendung von HiPS-Zellen von einzelnen Patienten erleichtert. Daher kann dieses Modell der ischämischen Herzkrankheit, das auf iPS-CMs menschlichen Ursprungs basiert, eine nützliche Plattform für das Screening von Medikamenten und weitere Forschungen über ischämische Herzerkrankungen bieten.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die ischämische Herzkrankheit (IHD) ist weltweit als die häufigste Todesursache anerkannt und wurde 2016 auf mehr als neun Millionen Todesfälle geschätzt1. Die Prävalenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen nimmt weiter zu, und die Globalisierung scheint zur Prävalenz von Risikofaktoren für Herzkrankheiten in Entwicklungsländern beigetragen zu haben. Daher wird die Studie von IHD immer dringlicher2.

Experimentelle Modelle von Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind entscheidend für die Untersuchung der Mechanismen von Krankheiten, Genauigkeit der Diagnose, und die Entwicklung neuer Therapien. Viele Laboratorien haben mehrere experimentelle Modelle vorgeschlagen. Es ist von größter Bedeutung, ein Modell mit erheblichen Vorteilen zu wählen; Machbarkeit, Wiederholbarkeit und Ähnlichkeit mit menschlichen Krankheiten sind Schlüsselfaktoren bei der Auswahl von Herz-Kreislauf-Erkrankungen Modelle3. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs), die spezifische Kardiomyopathie-assoziierte Mutationen tragen, sind eine vielversprechende Alternative zu Tiermodellen4. Obwohl viele Strategien zur Induktion von Kardiomyozyten mit iPSCs5,6,7,8,9beschrieben wurden, bieten wir hier eine einfache Methode zur Herstellung eines IHD-Modells mit Kardiomyozyten, die sich von hiPSCs unterscheiden, bei denen eine mühsame Auswahl von Kardiomyozyten mit Markern nicht angewendet wird. Bei dieser Methode werden Kardiomyozyten funktionell durch die Analyse der spontanen Kontraktion ausgewählt.

Die Induktion von Kardiomyozyten mit HiPSCs vermeidet Tieropfer und technisch schwierige Operationen. Die Erstellung von Tiermodellen von IHD erfordert anspruchsvolle chirurgische Techniken10. Eine perfekte Simulation der verschiedenen pathophysiologischen Aspekte menschlicher Herzkrankheiten wie Herzfrequenz und Wirkungspotentiale aus der Physiologie von Nagetieren ist fast unmöglich. In Verbindung mit der Moral und Ethik der Verwendung von Tiermodellen ist die Entwicklung neuer experimenteller Modelle, die nicht Tiermodelle sind, unerlässlich. Kardiomyozyten, die von menschlichen iPS-Zellen unterschieden werden, imitieren besser den physiologischen Zustand des menschlichen Herzens. In diesem Protokoll erstellen wir ein Modell der IHD mit Kardiomyozyten, die von HiPS-Zellen (hiPS-CMs) abgeleitet sind. In unserem Modell führt der Entzug von Sauerstoff und Glukose zu einer Abnahme der kontraktilen Kraft und Der Lebensfähigkeit von hiPS-CMs. Unsere Methode bietet einen neuen Ansatz für das Modell IHD und zeigt eine neue Plattform für die Untersuchung dieser Krankheit.

Protokoll

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1. hiPSC Wartungskultur

  1. Mantel eine Sechs-Brunnen-Kulturplatte mit Laminin (Tisch aus Materialien).
    1. Verdünnung von Laminin in Phosphatgepufferter Saline (PBS) auf 0,5 g/ml.
    2. Verdünntes Laminin mit einem Volumen von 2,0 ml/Well in eine Sechs-Well-Platte geben.
    3. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 30 min.
  2. Entfernen Sie die Lamininlösung aus den Brunnen.
  3. Seed hiPSCs in 2 ml iPSC Wartungsmedium (Materialtabelle) auf die beschichteten Brunnen mit einer Dichte von 3 × 104 Zellen/gut ohne Trocknung der Oberfläche.
  4. Subkultur der hiPSCs.
    1. Bereiten Sie 0,5× Zelldissoziationsenzyme (Tabelle der Materialien) Lösung.
      1. Mischen Sie 10 l von 0,5 M Ethylendiamintetraestik (EDTA) und 10 ml PBS zu 0,5 mM EDTA/PBS.
      2. Verdünnen Sie 10 ml 1× Zelldissoziationsenzyme auf 0,5× durch Zugabe von 10 ml 0,5 ml EDTA/PBS.
    2. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus den Brunnen.
    3. Fügen Sie 2 ml/Gut PBS hinzu, um die Zellen zu waschen, und entsorgen Sie dann die PBS.
    4. Fügen Sie 800 l der 0,5× Zelldissoziationsenzyme hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 7 min bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator, der 5%CO2enthält.
      HINWEIS: 0,05% Trypsin-EDTA kann verwendet werden, um Zellen zu dissoziieren.
    5. Entfernen Sie vorsichtig die 0,5× Lösung der Zelldissoziationsenzyme.
    6. Waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS, und entsorgen Sie dann die PBS.
      HINWEIS: Seien Sie sanft, da sich die Zellen nach Zugabe von Zelldissoziationsenzymen leicht lösen können.
    7. Fügen Sie 1 ml iPS-Wartungsmedium(Materialtabelle) hinzu, das 10 m Y-27632 enthält.
      HINWEIS: Das Hinzufügen von Y-27632 erhöht die Überlebensrate von hiPSCs.
    8. Lösen Sie Zellen mit einem Zellschaber und sammeln Sie sie in einem 15 ml Zentrifugenrohr.
    9. Zählen Sie die Anzahl der Zellen. Passen Sie die Zelldichte auf 1,5 × 104 Zellen/ml an, indem Sie iPS-Wartungsmedium hinzufügen, das 10 M Y-27632 enthält.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine Zentrifugation, um Zellschäden zu verhindern.
    10. Samen 2 ml Zellgemisch auf der lamininbeschichteten Sechs-Brunnen-Platte (Enddichte: 3 × 104 Zellen/Well).
    11. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator, der 5%CO2enthält.
    12. Ersetzen Sie das Kulturmedium an den Tagen 1, 4, 5 und 6 durch iPS-Wartungsmedium ohne Y-27632.
  5. Subkultur der Zellen an Tag 7.
    HINWEIS: Subkultur der Zellen am Tag 7, um die zufällige Differenzierung von HiPSCs zu hemmen.

2. Induktion der kardialen Differenzierung von HiPSCs

  1. Mantel eine 96-Well-Kulturplatte mit Laminin (Tisch aus Materialien).
    1. Laminin mit PBS auf 1,675 g/ml verdünnen.
    2. Fügen Sie die verdünnte Lamininlösung zu einer 96-Well-Platte mit einem Volumen von 0,1 ml/Well hinzu.
    3. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 30 min.
  2. Seed-HiPSCs auf einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 3 × 104 Zellen/Well.
  3. Vermehrung von HiPSCs bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2.
    1. Ersetzen Sie das Medium einen Tag später durch 200 L/well iPS-Wachstumsmedium (Tabelle der Materialien).
    2. Ändern Sie das Medium jeden Tag für weitere 2–3 Tage, bis die Zellen 70 %–80 % Konfluenz erreichen.
  4. Anwenden von Differenzierungsmedien.
    1. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium und ersetzen Sie es langsam durch 200 L/Well des vorgewärmten Differenzierungsmediums A (Materialtabelle).
    2. Legen Sie die Platte bei 37 °C in einen befeuchteten Inkubator, der 5%CO2enthält.
    3. Nach 48 h das Medium ansaugen und langsam durch 200 l/Well des vorgewärmten Differenzierungsmediums B (Materialtabelle)ersetzen.
    4. Legen Sie die Platte bei 37 °C in einen befeuchteten Inkubator, der 5%CO2enthält.
      HINWEIS: Es ist äußerst wichtig, dass die Differenzierungsmedien frisch gehalten werden. Sie verlieren allmählich ihre Differenzierungswirkung, in der Regel innerhalb von zwei Wochen. Bei Bedarf ein frisches Medium aliquotieren und bei 20 °C lagern.
  5. Tragen Sie Cardiomyozyten-Wartungsmedium auf.
    1. Nach 48 h das Medium ansaugen und langsam durch 200 L/Well des vorgewärmten Kardiomyozyten-Wartungsmediums (Materialtabelle)ersetzen.
    2. Legen Sie die Platte bei 37 °C in einen befeuchteten Inkubator, der 5%CO2enthält.
    3. Ersetzen Sie das Cardiomyozyten-Differenzierungsmedium jeden zweiten Tag bis zum 30. Tag.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Dauer der Anwendung der Differenzierungsmedien A und B genau auf 48 h eingestellt ist, um die genaue Expressionssequenz der Gene zu gewährleisten, die für die Differenzierung erforderlich sind.

3. Exposition gegenüber Ischämie

  1. Entberauben Sie das Kulturmedium von Nährstoffen und Sauerstoff.
    1. Bereiten Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM) ohne Glukose und Serum vor.
    2. Aspirieren Kulturmedium aus den Brunnen der 96-Well-Platte mit hiPS-CMs.
    3. Fügen Sie das nährstoffreiche Medium mit einem Volumen von 200 l/well in die Brunnen.
  2. Legen Sie die Kulturplatte in einen hypoxischen Inkubator (Materialtabelle).
  3. Stickstoffgas einstecken und die interne Sauerstoffkonzentration bei 2% und dieCO2-Konzentration bei 5% für 24 h halten.
  4. Fahren Sie mit den gewünschten Analysen fort: z. B., Lebensfähigkeitstest, Beurteilung der Kontraktilität oder Bewertung von Zellschäden.

4. Bewertung der zellulären Lebensfähigkeit mit MTT-Assay

  1. Verwenden Sie das MTT-Assay-Kit (Tabelle der Materialien), um die Lebensfähigkeit von Zellen quantitativ zu bewerten.
    HINWEIS: Die Exposition gegenüber 1 mM Wasserstoffperoxid in DMEM für 1 h kann verwendet werden, um Zellen zu schädigen (positive Kontrolle). Die Exposition gegenüber 0 mM Wasserstoffperoxid in DMEM kann für die Negativkontrolle verwendet werden.
    1. Fügen Sie den Zellen mit einem sich wiederholenden Pipettiergerät 10 L MTT-Reagenz hinzu.
    2. Mischen Sie sanft für eine Minute auf einem Orbital-Shaker.
    3. Inkubieren Sie die Zellen für 3–4 h bei2 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator. Nach der Inkubation erscheint das in den Zellen produzierte Formazan als dunkle Kristalle im Boden der Brunnen.
    4. Nach dem Entfernen des Überstandes die unlöslichen Formazankristalle in 100 l Dimethylsulfoxidlösung (DMSO) auflösen. Diese Lösung löst die Formazankristalle auf und erzeugt eine violette Lösung.
      VORSICHT: DMSO kann Augen, Atemwege und Haut reizen. Tragen Sie geeignete Handschuhe und Augen-/Gesichtsschutz.
    5. Messen Sie die Absorption jeder Probe mit einem Mikroplattenleser bei einer Wellenlänge von 570 nm.

5. Beurteilung der Kontraktilität von iPS-CMs

  1. Wenn nicht installiert, erhalten Sie Particle Image Velocimetry ImageJ Plugin11 bei https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv und installieren.
  2. Zeichnen Sie die Videobilder von hiPS-CMs mit dem 4× Objektiv mit einem Phasenkontrastmikroskop für 10 s auf und speichern Sie sie als "analyze.avi". Für einen Vergleich der Kontraktilität zwischen vor und nach Ischämie, bestätigen Sie, dass der Ort des Interesses aufgezeichnet wird.
    HINWEIS: Ein Mikroskop mit einer automatisierten Stufe ist nützlich, um den Ort des Interesses zu zielen. Die Filmdatei sollte zur späteren Analyse im .avi-Format vorliegen. Wenn dies nicht der Fall ist, konvertieren Sie den Film in .avi.
  3. Erstellen Sie die Ordnerstruktur, wie in Abbildung 1angegeben. Ein Beispiel für "joblist.txt" ist in der Zusatzdatei angegeben.
  4. Analysieren Sie diskrete zweidimensionale Vektorfelder der Zellverschiebung.
    1. Starten Sie Fiji (ImageJ) Software12, gehen Sie zu Plugins > Makros > Bearbeiten und öffnen Sie "vector_analysis.ijm" (Supplementary Coding File).
    2. Klicken Sie auf Ausführen. Die Analyse wird automatisch durchgeführt.
      HINWEIS: Verschiebungsvektoren D(x,y) werden für alle 16 × 16 Pixel zwischen dem Referenzrahmen (dem ersten Frame) und allen nachfolgenden Frames (Frames 1 vs. 2, 1 vs. 3, 1 vs. 4 usw.) berechnet. Das Ergebnis wird für jeden Frame berechnet und als "vec_x.txt"(x ist eine Framenummer) gespeichert. Ein Vektor der maximalen Verschiebung, M(x, y), ist für jedes (x, y) Paar wie folgt definiert:
      figure-protocol-1
      wobei k die Rahmennummer darstellt, bei der | Dk (x,y)| = max [| D2 (x,y)|, | D3 (x,y)|, ..., | Dn (x,y)|] und n bezeichnet den letzten Frame. Das Ergebnis wird als "Max_vector.txt" gespeichert. | M(x, y)| stellt die maximale Verschiebung dar, die durch kardiomyozytenkontraktion am Analysepunkt (x, y) verursacht wird. Kontraktilitätswert C in beliebigen Einheiten wird wie folgt berechnet:
      figure-protocol-2
      Dieser Wert wird in Spalte 7, Zeile 1 im "Max_vector.txt" gespeichert. C stellt die Summe der Verschiebung für alle (x, y) dar. Je größer der Teil, in dem die Verschiebung aufgrund der Myokardkontraktion groß ist, desto größer ist der Wert von C. Das Vektorfeld der maximalen Verschiebung, M(x, y), wird mit einem Phasenkontrastbild des ersten Frames ("Phase_contrast.png") überlagert und als "Overlaid.png" gespeichert. Da die Größe des Verschiebungsvektors auf der Grundlage des ersten Frames des Videos berechnet wird, ist es vorzuziehen, dass sich die hiPS-CMs in der ruhenden diastolischen Periode für den ersten Frame befindet.

6. Bewertung von Zellschäden mittels Durchflusszytometrie

  1. Verdünnen Sie eine 1 mg/ml-Lösung von Propidiumjodid auf 1:1.000 in PBS.
  2. Färben Sie die freigelösten Zellen mit Propidiumjodid.
    1. Das Medium ansaugen und in ein entsprechend großes Zentrifugenrohr legen.
    2. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1.000 × g für 5 min, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, um Sedimentzellen nicht zu verlieren.
    3. Inkubieren Sie die Zellen mit der verdünnten Propidiumjodidlösung bei Raumtemperatur für 15 min im Dunkeln.
    4. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1.000 × g für 5 min, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, um Sedimentzellen nicht zu verlieren.
    5. Rekonstituieren Sie die Zellen in 1 ml PBS.
      HINWEIS: Es ist wichtig, freistehende schwimmende Zellen aus dem Medium zu sammeln, um Zellschäden genau zu quantifizieren.
  3. Stain befestigte Zellen mit Propidiumiodid.
    1. Waschen Sie angehängte Zellen zweimal mit PBS sanft, dann entsorgen Sie PBS.
    2. Inkubieren Sie die Zellen mit der verdünnten Propidiumjodidlösung für 15 min im Dunkeln.
    3. Aspirieren Sie die Propidiumjodid-Lösung.
    4. Lösen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin. Verschieben Sie die Zelllösung in ein Zentrifugenrohr.
    5. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1.000 × g für 5 min, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, um Sedimentzellen nicht zu verlieren.
    6. Rekonstituieren Sie die Zellen in 1 ml PBS.
  4. Mischen Sie die schwebenden und angehängten Zellen für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse.
  5. Übergeben Sie die Zelllösung durch einen 30-mm-Filter.
    HINWEIS: Das Übergeben der Zellen an einen Filter ist für eine genaue FACS-Messung sehr wichtig.
  6. Analysieren Sie die Proben mit einem FACS-System.

7. Immunostaining

  1. Fixieren Sie die Zellprobe.
    1. Aspirieren Sie das Kulturmedium.
    2. 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei Raumtemperatur hinzufügen.
    3. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
      HINWEIS: Für eine optimale Fixierung wird eine frische Paraformaldehydlösung empfohlen.
  2. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,2% Triton X-100 für 15 min, dann entsorgen Sie das Reagenz.
  3. Fügen Sie 3% Rinderserumalbumin hinzu, um die Zellen für 30 min zu blockieren.
  4. Wenden Sie primären Antikörper an.
    1. Entsorgen Sie die Rinderserumalbuminlösung von der Kulturplatte.
    2. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C.
    3. Entfernen Sie die Antikörperlösung.
    4. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
  5. Sekundärantikörper anwenden.
    1. Entsorgen Sie die PBS-Lösung von der Kulturplatte.
    2. Inkubieren Sie die Zellen mit sekundären Antikörpern für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
      HINWEIS: Primärer antikardialer Troponin T (TNNT2) Maus monoklonaler Antikörper wird bei einer Verdünnung von 1:750 in 3% BSA verwendet. Der Alexa Fluor 488-konjugierte sekundäre Ziege Anti-Maus-Antikörper wird auf 1:1.000 in 3% BSA verdünnt.
  6. Zusätzliche Färbung von Kern- und Aktinfasern.
    1. Entfernen Sie die Antikörperlösung.
    2. Inkubieren Sie die Zellen in Kernfärbung Reagenz (Tabelle der Materialien) und Actin Färbung Reagenz ( Tabelle derMaterialien) in PBS für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
      HINWEIS: 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder Hoechst 33342 können zur kernnuklearen Färbung verwendet werden.
    3. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
  7. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erfolgreich differenzierte Zellen zeigen spontane Kontraktion unter dem Mikroskop (Video 1). Typischerweise zeigen 50% der Brunnen eine spontane Kontraktion in <20 Tagen (Zusatzabbildung 1). Herzmarkerprotein (z.B. cTnT) kann zur Bestätigung einer erfolgreichen Differenzierung verwendet werden (Abbildung 2).

In der Regel weisen Zellen aus der ischämischen Gruppe eine geringere Lebensfähigkeit in MTT-Assays (Abbildung 3A) und Kontraktilität (Abbildung 3E,F, Ergänzende Abbildung 2) auf als Zellen aus normoxischer Kontrollgruppe. Außerdem ist das Verhältnis der propidiumiodid-positiven Zellen in der ischämischen Gruppe höher als in der Kontrollgruppe (Abbildung 3B–D), was auf höhere Zellschäden hindeutet.

figure-results-1
Abbildung 1: Ordnerstruktur für die Verschiebungsvektoranalyse mit imageJ.
"joblist.txt" beschreibt den Pfad zu Filmdateien in jeder Zeile. Wenn drei Dateien analysiert werden müssen, gibt es drei Ordner (movie1, movie2 und movie3), in denen "analyze.avi" (der Film von Interesse) platziert werden soll. Nachdem die Analyse mit dem Code "vector_analysis.ijm" durchgeführt wurde, werden in jedem Filmordner Dateien generiert (blau dargestellt). Die in jeder Datei gespeicherten Informationen werden im Haupttext ausführlich erläutert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Repräsentatives Bild der Kardialmarkerfärbung.
Expression des Herzmarkerproteins Herztroponin T (cTnT). Blau: 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), rot: actin, grün: cTnT. Inset: gestreifter Ausdruck von cTnT, der der Sarcomere-Struktur entspricht. Schuppenstange, 50 m. Diese Zahl wurde von Wei et al.13geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Repräsentative Bilder des Zelllebensfähigkeits-Assays, der Bewertung von Zellschäden und der Kontraktilität.
(A) Vergleich der zellulären Lebensfähigkeit (MTT-Assay). Eine höhere Absorption deutet auf eine höhere Lebensfähigkeit hin. n = 5 für jede Bedingung. (B, C und D) Flusszytometrieanalyse von Propidiumiodid (PI)-gefärbten Zellen. Ischämische Zellen weisen im Vergleich zur Kontrolle eine reduzierte Vorwärtsstreuungsintensität und erhöhte PI-Fluoreszenz auf. (D) Prozentsatz der PI-gefärbten Zellen in der Durchflusszytometrieanalyse. n = 3 für jede Bedingung. (E) Analyse der Kontraktilität von iPS-CMs mit ImageJ-Software. Die roten und blauen Vektoren zeigen die größten bzw. kleinsten Kontraktionen an. Schuppenstange, 100 m. (F) Quantitative Analyse der iPS-CM-Kontraktilität unter Verwendung von Code. n = 3 für die Kontrolle und n = 8 für ischämische Zustand. Fehlerbalken stellen einen Standardfehler des Mittelwerts dar. Für die statistische Analyse wurde ein ungepaarter zweischwanzer Schüler-T-Test durchgeführt. *: p < 0,05, **: p < 0,01. : p < 0.0001. Diese Zahl wird von Wei et al.13zitiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Differenzierte Zellen zeigen spontane Kontraktion unter dem Mikroskop. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Kaplan-Meier-Analyse des Prozentsatzes der Proben ohne spontane Kontraktion. 50% der iPS-CM-Proben zeigten eine Kontraktion am 20. Tag. Am 30. Tag zeigten 64,4 % der Proben eine Kontraktion. n = 83. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Beurteilung der Kardialkontraktilität. Skalierte Kontraktilität, die durch Division der Kontraktilität C durch die Anzahl der Analysepunkte (x, y) erreicht wurde, wurde für Kontroll- und ischämische Gruppen vor und nach der Exposition gegenüber 24 h Hypoxie dargestellt. n = 3 für die Kontrolle und n = 8 für ischämische Zustand. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Bewertung des Gehalts von Kardiomyozyten. Immunostainierung von Herzmarkerprotein auf einer 96-Well-Platte. Grün: cTnT, Blau: DAPI. Die Rate der differenzierten Zellen wurde auf 20,7 ± 9,6 % berechnet, indem die Fläche der cTnT-gefärbten Region durch die fläche der DAPI-gefärbten Region dividiert wurde. Skalenstange = 1 mm. n = 4 für Regelzustand. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Forscher verwenden häufig Labor-Kleintiermodelle, um IHD-Experimente durchzuführen. Hier haben wir ein Zellkulturmodell des menschlichen IHD entwickelt, um solche Experimente durchzuführen.

Das Hauptproblem, mit dem ein Benutzer dieses Protokolls konfrontiert sein kann, ist eine niedrige Rate differenzierter Kardiomyozyten. Es sollten mehrere Schritte unternommen werden, um die Rate der erfolgreichen Differenzierung zu verbessern: (a) beim Pipetieren sanft sein, da sich die Zellen nach Zugabe der Zelldissoziationsenzyme Reagenz leicht lösen, (b) die Zugabe von Y-27632 die Überlebensrate von iPS-Zellen beim Lösen erhöht und (c) das Timing von mittleren Veränderungen zu Beginn der Differenzierung genau 48 h auseinander liegen sollte, um eine kontrollierte Expression von Genen zu gewährleisten, die an der Differenzierung beteiligt sind.

In Bezug auf die extrazellulären Matrixproteine, die für die Beschichtung der Oberfläche der Kulturplatte verwendet werden, können andere Materialien als Laminin verwendet werden, die wir in diesem Protokoll verwendet haben. Zum Beispiel werden Matrigel14,15und Gelatine16,17 für die feederfreie Wartungskultur von hiPSCs verwendet. Nach Haraguchi et al. wurden auf Matrigel gesäte HiPSCs erfolgreich in Herzzellblatt18unterschieden.

Es gibt eine Reihe von früheren Studien über Kulturmodelle für die Krankheitsmodellierung mit Kardiomyozyten, die von hiPSCs abgeleitet sind. In Bezug auf die Modellierung der Ischämie-Reperfusionsverletzung, Manipulationen der zellulären Umgebung, wie Hyperkaliämie, Azidose, und Laktatakkumulation, wurden eingeführt19. Andere Methoden sind Zellpelleting zur Behinderung der Sauerstoffdiffusion20 und metabolische Hemmung mit Zyanid21. Im aktuellen Protokoll wurde eine Zellverletzung durch eine relativ einfache Methode erreicht, nämlich 24 h Entzug von Sauerstoff und Nährstoffen. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, genaue pathophysiologische Prozesse der ischämischen Herzkrankheit zu berücksichtigen, da es in der Tat Unterschiede zwischen der Krankheit in vivo und dem Krankheitsmodell des aktuellen Protokolls gibt, wie das Vorhandensein oder Fehlen einer dreidimensionalen zellulären Umgebung und Blut.

In Bezug auf den technologischen Aspekt der Bewertung der Kardiomyozytenfunktion berichteten Toepfer et al. über einen MatLab-basierten Algorithmus zur Bestimmung der Sarkomekontraktion und Entspannung in hiPS-CMs22. Smith et al. berichteten über eine fortschrittliche Methode der elektrophysiologischen Analyse von erregbaren Zellen mit hohem Durchsatz, die von hiPS-CMs abgeleitet wurden, mit hochentwickelten nanotopographisch gemusterten Multielektroden-Arrays23,24. Der Vorteil unseres Protokolls ist, dass es nur herkömmliche Software und Verbrauchsmaterialien wie imageJ-Software und 96-Well-Platten benötigt.

In Bezug auf den Sauerstoffgehalt im Herzen wird angenommen, dass der Sauerstoffdruck in venen, die das Herz erreichen, 40 mmHg25beträgt. Nach McDougal et al. wird der extrazelluläre Sauerstoffdruck unter Hypoxie auf <12,8 mmHg26geschätzt. Bei Anwendung der Methode rounds et al.27wird der Sauerstoffdruck im Kulturmedium (Salzgehalt: 35 °) unter dem hypoxischen Zustand (2% Sauerstoff) bei 37 °C, der mit dem aktuellen Protokoll behandelt wird, auf 14,9 mmHg berechnet, was höher ist als die obige Schätzung. Interessanterweise berichteten Al-Ani et al., dass es einen Gradienten des Sauerstoffdrucks im Kulturmedium gibt und der Sauerstoffdruck durch Zelltyp, Sädichte und mittleres Volumen28beeinflusst wird. Typischerweise ist die Sauerstoffkonzentration an der Unterseite der Kulturplatte, in der sich zellenbefinden, am niedrigsten. Daher würde die Wirkung der Tiefe im Kulturmedium den effektiven Sauerstoffdruck in der Nähe von hiPS-CMs weiter reduzieren. Um ausreichende Schäden an HiPS-CMs mit hypoxischem Zustand zu induzieren, muss sorgfältig auf die Tiefe des Mediums und die Dichte der Zellen geachtet werden.

Unser hiPS-CM-Modell, das sehr nah an den physiologischen Bedingungen menschlicher Herzmyozyten liegt, imitiert vorteilhafterweise menschliche IHD. Tiermodellbasierte Ansätze umfassen ethische, technische und akademische Fragen. Insbesondere in vivo-Modelle erfordern eine fortschrittliche Technik der Mikrochirurgie, um reproduzierbare Daten zu erreichen: z.B. Okklusion des vorderen absteigenden Zweigs der linken Koronararterie bei Nagetieren3. Das hier beschriebene hiPS-CM-Modell überwindet diese kritischen Barrieren und bietet eine nützliche, relevante und wiederholbare Plattform für Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Es sollten jedoch einige Einschränkungen beachtet werden. Ein offensichtlicher Unterschied zwischen iPS-induzierten Kardiomyozyten und normalen Kardiomyozyten ist das Fehlen von T-Tubules29, und wir haben keine humoralen Faktoren wie Gewebeschäden, die durch Leukozyten induziert werden, und die Aktivierung eines Komplementsystems in unsere Studie aufgenommen. Darüber hinaus sollte die Rate der differenzierten Kardiomyozyten in diesem Modell (20,7 ± 9,6 %, Zusatzabbildung 3) verbessert werden. Die jüngste Veröffentlichung von Halloin et al. beschreibt eine skalierbare, chemisch definierte Methode, um hiPS-CM Reinheit von >95% durch chemische WNT-Signalwegmodulatoren zu induzieren, ohne dass eine Auswahl durch Marker30erforderlich ist. Dennoch ist unser Modell der menschlichen IHD relativ einfach und klinisch anwendbar (z. B. Arzneimittelscreening mit patientenabgeleiteten iPS-Zellen). Unser Modell ist auch eine einzigartige Plattform, um Mechanismen, die IHDs zugrunde liegen, weiter aufzuklären.

Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Studie wurde von JSPS KAKENHI, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research), 17KK0168, unterstützt. Die Autoren danken central Research Laboratory, Okayama University Medical School für die Unterstützung von FACS.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz zur Aktinfärbung (ActinRed 555 ReadyProbes Reagenz)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAR37112
Antikardialer Troponin-T-AntikörperThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAMA5-12960
Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium (PSC Kardiomyozyten-Differenzierungskit)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
Zelldissoziationsenzyme (TrypLE Select)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA12563011
Differenzierungsmedium A (PSC Kardiomyozyten-Differenzierungskit)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
Differenzierungsmedium B (PSC Kardiomyozyten-Differenzierungskit)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
FACS Aria III SystemBD Biosciences, San Jose, CA, USA
FluoreszenzmikroskopKEYENCE, Osaka, JapanBZ-X710
Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 488 SekundärantikörperThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA28175
Menschliche iPS-ZellenRIKEN, Tsukuba, Japan201B7
Hypoxischer InkubatorSANYO, Osaka, JapanMCO-175M
iPSC-Wachstumsmedium (Essential 8 Medium)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA1517001
iPSC-Erhaltungsmedium (StemFit AK02N)Ajinomoto, Tokio, JapanRCAK02N
Laminin (iMatrix-511)Nippi, Tokio, JapaniMatrix-511
MTT-Assay-Kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit)Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA10009365
Reagenz zur Zellkernfärbung (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagenz)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAR37606
Triton X-100Nacalai Tesque, Kyoto, Japan35501-02

Referenzen

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