Live-Cell Imaging des Lebenszyklus des bakteriellen Raubtiers Bdellovibrio bacteriovorus mittels Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Überwachung des gesamten Lebenszyklus des raubtierlichen Bakteriums Bdellovibrio bacteriovorus mittels Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie in Kombination mit einem Agarosepad und zellbildenden Gerichten beschreibt.

Zusammenfassung

Bdellovibrio bacteriovorus ist ein kleines gramnegatives, obligates Raubbakterium, das andere gramnegative Bakterien abtötet, einschließlich schädlicher Krankheitserreger. Daher gilt es als ein lebendes Antibiotikum. Um B. bakteriovorus als lebendes Antibiotikum anzuwenden, ist es zunächst notwendig, die wichtigsten Stadien seines komplexen Lebenszyklus zu verstehen, insbesondere seine Proliferation in der Beute. Bisher war es schwierig, aufeinanderfolgende Phasen des raubtieren Lebenszyklus in Echtzeit zu überwachen. Präsentiert hier ist ein umfassendes Protokoll für die Echtzeit-Bildgebung des gesamten Lebenszyklus von B. bacteriovorus, vor allem während seines Wachstums innerhalb des Wirts. Dazu wird ein System aus einem Agarose-Pad in Kombination mit zellbildenden Schalen eingesetzt, bei denen sich die Raubzellen frei unter dem Agarose-Pad bewegen können, während immobilisierte Beutezellen Bdelloplasten bilden können. Die Anwendung eines Stammes, der eine fluoreszierend markierte Untereinheit der DNA-Polymerase III erzeugt, ermöglicht ferner die Überwachung der Chromosomenreplikation während der Reproduktionsphase des B. bakteriovorus Lebenszyklus.

Einleitung

Bdellovibrio bacteriovorus ist ein kleines (0,3–0,5 m x 0,5–1,4 m) gramnegatives Bakterium, das andere gramnegative Bakterien, einschließlich schädlicher Krankheitserreger wie Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, und Shigella flexneri^1,2,^3,beutet. Da B. bacteriovorus Krankheitserreger abtötet, gilt es als ein potenzielles lebendes Antibiotikum, das zur Bekämpfung bakterieller Infektionen eingesetzt werden kann, insbesondere solche, die durch multiresistente Stämme verursacht werden.

B. bacteriovorus....

Protokoll

1. Herstellung von B. bakteriovorus Lysat zur mikroskopischen Analyse

1. In einem 250 ml-Kolben die Kokultur durch Kombination von 1 ml frischer 24-h-B.-B.-B.-B.-B.-Kultur (z. B. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) und 3 ml über Nacht Beutekultur (z.B. E. coli S17-1 pZMR100) mit 50 ml Ca-HEPES Puffer (25 mM HEPES, 2 mM CaCl₂ [pH = 7.6]) bei Bedarf mit Antibiotika ergänzt (hier 50 g/m Kanamycin). B. bacteriovorus
2. Die Cokultur für 24 h bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen/min inkubieren.
3. Prüfen Sie, ob die Beutezellen vollständig durch eine flüssig montierte Phasenkontrastmikroskopie lysiert werden.....

Ergebnisse

Das beschriebene TLFM-basierte System ermöglicht die rechtzeitige Verfolgung einzelner Zellen vonB. bakteriovorus (Abbildung 3, Film 1) und liefert wertvolle Informationen über jede Phase des komplexen Raublebenszyklus. Die PilZ-mCherry-Fusion ermöglicht die Kennzeichnung der gesamten Raubzelle in der Angriffsphase sowie der frühen Phase der Wachstumsphase (Abbildung 3). Der Übergang von der Angriffs- zur Replikphase wurde nicht nur dur.......

Diskussion

Aufgrund des gestiegenen Interesses an der Verwendung von B. bacteriovorus als lebendes Antibiotikum sind neue Werkzeuge zur Beobachtung des raubtierlichen Lebenszyklus, insbesondere raubtier-pathogene Wechselwirkungen, erforderlich. Das vorgestellte Protokoll wird verwendet, um den gesamten B. bakteriovorus Lebenszyklus zu verfolgen, vor allem während seines Wachstums innerhalb des Hosts, in Echtzeit. Darüber hinaus ermöglichte die Anwendung eines Stammes, der fluoreszierend getaggte Betaklemme des DNA.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zentrifuge	MPW MED. INSTRUMENTS	MPW-260R	Rotor ref. 12183
CertifiedMolecular Biology Agarose	BIO-RAD	161-3100	Agarose mit niedriger Fluoreszenz für Agarose-Pad
Fiji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Open-Source-Bildverarbeitungspaket
Glasbodenschale 35 mm	ibidi	81218-200	unbeschichtetes Glas
Mikroskop	GE	DeltaVision Elite	Mikrotitertisch, Ultimate Focus Lasermodul, DV Elite CoolSnap HQ2 Kamera, SSI-Baugruppe FP DV, Kit obj. Oly 100x Öl 1,4 NA, Prisma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Minisart Filter 0,45 µ m	Sartorius	16555----------K	Celluloseacetat, steril, Luer-Lock-Ausgang
Start SoftWoRx	GE		Vom Hersteller bereitgestellte Bildgebungssoftware