Live-Cell Imaging des Lebenszyklus des bakteriellen Raubtiers Bdellovibrio bacteriovorus mittels Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Überwachung des gesamten Lebenszyklus des raubtierlichen Bakteriums Bdellovibrio bacteriovorus mittels Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie in Kombination mit einem Agarosepad und zellbildenden Gerichten beschreibt.

Zusammenfassung

Bdellovibrio bacteriovorus ist ein kleines gramnegatives, obligates Raubbakterium, das andere gramnegative Bakterien abtötet, einschließlich schädlicher Krankheitserreger. Daher gilt es als ein lebendes Antibiotikum. Um B. bakteriovorus als lebendes Antibiotikum anzuwenden, ist es zunächst notwendig, die wichtigsten Stadien seines komplexen Lebenszyklus zu verstehen, insbesondere seine Proliferation in der Beute. Bisher war es schwierig, aufeinanderfolgende Phasen des raubtieren Lebenszyklus in Echtzeit zu überwachen. Präsentiert hier ist ein umfassendes Protokoll für die Echtzeit-Bildgebung des gesamten Lebenszyklus von B. bacteriovorus, vor allem während seines Wachstums innerhalb des Wirts. Dazu wird ein System aus einem Agarose-Pad in Kombination mit zellbildenden Schalen eingesetzt, bei denen sich die Raubzellen frei unter dem Agarose-Pad bewegen können, während immobilisierte Beutezellen Bdelloplasten bilden können. Die Anwendung eines Stammes, der eine fluoreszierend markierte Untereinheit der DNA-Polymerase III erzeugt, ermöglicht ferner die Überwachung der Chromosomenreplikation während der Reproduktionsphase des B. bakteriovorus Lebenszyklus.

Einleitung

Bdellovibrio bacteriovorus ist ein kleines (0,3–0,5 m x 0,5–1,4 m) gramnegatives Bakterium, das andere gramnegative Bakterien, einschließlich schädlicher Krankheitserreger wie Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, und Shigella flexneri^1,2,^3,beutet. Da B. bacteriovorus Krankheitserreger abtötet, gilt es als ein potenzielles lebendes Antibiotikum, das zur Bekämpfung bakterieller Infektionen eingesetzt werden kann, insbesondere solche, die durch multiresistente Stämme verursacht werden.

B. bacteriovorus weist einen besonderen Lebenszyklus auf, der aus zwei Phasen besteht: einer frei lebenden nicht-replikativen Angriffsphase und einer intrazellulären Reproduktionsphase (Abbildung 1). In der Freilebphase sucht dieses hochmotile Bakterium, das sich mit Geschwindigkeiten von bis zu 160 m/s bewegt, nach seiner Beute. Nach der Befestigung an der äußeren Membran der Beute gelangt es in das Periplasma^4,5. Während der interperiplasmischen Fortpflanzungsphase verwendet B. bacteriovorus eine Fülle hydrolytischer Enzyme, um die Makromoleküle des Wirts zu degradieren und für sein eigenes Wachstum wiederzuverwenden. Bald nach dem Eindringen in das Periplasma stirbt die Wirtszelle und bläht sich in eine kugelförmige Struktur namens Bdelloplast, in der sich die Raubzelle längt und ihre Chromosomen repliziert. Der Replikationsprozess beginnt am Replikationsursprung (oriC)⁶ und geht weiter, bis mehrere Kopien des Chromosoms vollständig synthetisiert wurden⁷. Interessanterweise folgt der Replikation jedes Chromosoms nicht die Zellteilung. Stattdessen erlänget sich das Raubtier zu einer langen, multinukleoiden und fadenförmigen Zelle. Bei Nährstoffmangel wird das Filament einer synchronen Septation unterzogen und Diegenzellen werden aus dem Bdelloplast⁸freigesetzt.

Bevor B. bacteriovorus als lebendes Antibiotikum gegen bakterielle Infektionen verwendet werden kann, ist es entscheidend, die wichtigsten Stadien seines Lebenszyklus zu verstehen, insbesondere diejenigen, die mit seiner Proliferation innerhalb der Beute zusammenhängen. Die Live-Zell-Bildgebung von B. bacteriovorus war aufgrund der verschiedenen morphologischen Formen des Raubtiers und seiner Beute während des komplexen Lebenszyklus eine Herausforderung. Bisher wurden die Wechselwirkungen zwischen B. bacteriovorus und seiner Wirtszelle hauptsächlich durch Elektronenmikroskopie und Schnappschussanalyse^2,9,10untersucht, die beide Einschränkungen haben, insbesondere wenn sie verwendet werden, um aufeinanderfolgende Stadien des räuberischen Lebenszyklus zu überwachen. Diese Methoden liefern hochauflösende Bilder von B. bakteriovorus Zellen und ermöglichen die Beobachtung eines kleinen Raubtiers während der Angriffs- oder Wachstumsphase. Sie erlauben jedoch keine Verfolgung einzelner B. bakteriovorer Zellen während der beiden Lebenszyklusphasen.

Hier wird ein umfassendes Protokoll zur Verwendung der Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie (TLFM) zur Überwachung des gesamten Lebenszyklus von B. bakteriovorusvorgestellt. Ein System, das aus einem Agarose-Pad besteht, wird in Kombination mit einer Zellbildschale verwendet, bei der sich die Raubzellen frei unter dem Agarose-Pad bewegen können, während die immobilisierten Beutezellen Inderoplasten bilden können (Abbildung 2). Diese Einrichtung wird auf der Grundlage spezifischer Stämme von E. coli und B. bacteriovoruserstellt, aber das Protokoll kann leicht an die individuellen Stämme eines Benutzers anpassen (z. B. mit verschiedenen Selektionsmarkern, Proteinen, die mit verschiedenen Fluorophoren verschmolzen sind usw.).

In diesem Fall wurde zur Visualisierung von B. bacteriovorus während der Angriffsphase ein spezifischer Stamm (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) konstruiert, der eine fluoreszierend markierte Version des zytoplasmischen Proteins PilZ (verfügbar in unserem Labor auf Anfrage)^{ausdrückt 7}. Dieser Stamm produziert zusätzlich DnaN (die Schiebeklemme), eine Untereinheit des DNA-Polymerase-III-Holoenzyms, die mit einem fluoreszierenden Protein verschmolzen wird. Dies ermöglicht die überwachung der kontinuierlichen DNA-Replikation innerhalb der Raubzellen, während sie innerhalb von Bdelloplasten wachsen.

Obwohl sich das beschriebene Protokoll und die für die Bildaufnahme verwendete Software auf ein invertiertes Mikroskop beziehen, das von einem bestimmten Hersteller bereitgestellt wird (siehe Tabelle der Materialien), kann diese Technik für jedes invertierte Mikroskop angepasst werden, das mit einer Umweltkammer oder einem anderen externen Heizhalter ausgestattet ist und zeitraffiver abbilden kann. Für die Datenanalyse können Benutzer jede verfügbare Software auswählen, die mit den einzelnen Ausgabeformaten kompatibel ist.

Abbildung 1: B. bakteriovorus Lebenszyklus in E. coli als Wirtszelle. Während der Angriffsphase sucht eine freischwimmende B. bakteriovore Zelle nach einer E. coli-Wirtszelle und heftet sie an. Nach der Invasion wird die Raubzelle im Periplasma der Beute lokalisiert, verändert die Form der Wirtszelle und bildet einen Bdelloplast. Die Fortpflanzungsphase beginnt mit der Bdelloplastbildung. Die Raubzelle verdaut die Beutezelle und verwendet einfache Verbindungen, um ihre eigenen Strukturen aufzubauen. B. bacteriovorus wächst als ein langes einzelnes Filament im Periplasma des Wirts. Wenn die Ressourcen der Beutezelle erschöpft sind, septiert das B. bakteriovorus Filament synchron und bildet Nachkommenzellen. Nachdem die Nachkommenzellen ihre Flagella entwickeln, lysieren sie den Bdelloplast. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

1. Herstellung von B. bakteriovorus Lysat zur mikroskopischen Analyse

1. In einem 250 ml-Kolben die Kokultur durch Kombination von 1 ml frischer 24-h-B.-B.-B.-B.-B.-Kultur (z. B. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) und 3 ml über Nacht Beutekultur (z.B. E. coli S17-1 pZMR100) mit 50 ml Ca-HEPES Puffer (25 mM HEPES, 2 mM CaCl₂ [pH = 7.6]) bei Bedarf mit Antibiotika ergänzt (hier 50 g/m Kanamycin). B. bacteriovorus
2. Die Cokultur für 24 h bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen/min inkubieren.
3. Prüfen Sie, ob die Beutezellen vollständig durch eine flüssig montierte Phasenkontrastmikroskopie lysiert werden. An dieser Stelle sollten zahlreiche motile Angriffsphase B. bakteriovorus Zellen vorhanden sein, und keine E. coli-Zelle oder Bdelloplast sollte sichtbar sein.
4. Filtern Sie die B. bakteriovorus Kultur durch einen 0,45 m Poren-Größenfilter, um alle verbleibenden Wirtszellen zu entfernen. Raubzellen (0,3–0,5 x 0,5–1,4 m) dringen frei in 0,45 m Poren ein, während Wirtszellen auf der Filteroberfläche zurückgehalten werden.
5. Drehen Sie das Filtrat 20 min bei 2469 x g und 30°C in einem 50 ml konischen Rohr, um Raubzellen zu sammeln. Das B. bakteriovorus Pellet in 3 ml Ca-HEPES-Puffer (auf eine endgültige OD₆₀₀ von ca. 0,2) wieder aufheben und bei 30 °C und 200 Umdrehungen pro Minute für 30 min inkubieren.

2. Vorbereitung von Wirtszellen für B. bakteriovorus Invasion

1. Verwenden Sie eine einzelne Kolonie des Wirtsstamms(E. coli S17-1 pZMR100 wird aufgrund verschiedener Zellgrößen empfohlen, die zur Bildung von ungleich großen Bdelloplasten führen), um 10 ml YT-Medium zu impfen (0,8% Bacto Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl [pH = 7,5]), die bei Bedarf mit Antibiotika ergänzt wurde (hier 50 g/mL Kanamycin). Kulturzellen über Nacht bei 37 °C und 180 Rpm.
2. Überträgt 2 ml E. coli-Kultur (OD₆₀₀ von 3,0) in ein 2 ml Reagenzglas und Zentrifuge bei Raumtemperatur (RT) und 2469 x g für 5 min. Setzen Sie das Pellet in 200 L Ca-HEPES-Puffer wieder aus.

3. Aufbau des Mikroskops (siehe Materialtabelle)

1. Vordem Vorwärmen einer mikroskopischen Kammer mit einem 100-fachen Öl-Eintauchobjektiv auf 30 °C für mindestens 1 h. Dieser Schritt ist erforderlich, um Fehler bei der Fokussierung während des Experiments zu vermeiden.
2. Schalten Sie sowohl die Mikroskopie- als auch die Mikroskopie-Automatisierung ein. Initialisieren Sie die Steuerungssoftware und wählen Sie die geeigneten Filter aus, um je nach Bedarf Hellfeld-/DIC/Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder zu erfassen (hier: BF-Bilder, GFP/mCherry-Polychromfilter und Emission/Erregung für mCherry und GFP).

4. Montage von Layouts für die Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie

1. Mischen Sie 200 mg niedrigfluoreszierende molekulare Agarose mit 20 ml Ca-HEPES-Puffer (1% endgantiöse Agarose-Konzentration) und lösen Sie die Agarose in einer Mikrowelle auf. Die Charge kann mehrmals nach der Erstarrung wiederverwendet werden, also wiederholen Sie einfach den Heizschritt.
2. Gießen Sie 3 ml geschmolzene Agarose in eine 35 mm Glasbodenschale (Tisch der Materialien). Lassen Sie die Agarose verfestigen.
3. Mit einem Labor-Mikrospachtel, entfernen Sie vorsichtig das Agarose-Pad von der 35-mm-Schale, ohne den Mittelpol des Agarose-Pads zu stören. Drehen Sie das Pad unten nach oben und legen Sie es in eine Petrischale Abdeckung (Abbildung 2).
4. Legen Sie 5 l konzentrierte E. coli Suspension auf das gekippte Pad und verteilen Sie Zellen im Mittelpol mit einer Impfschleife. Die konzentrierte B. bakteriovorus Suspension (OD₆₀₀ von 0,2) wird auf die E.coli-beschichtete Oberfläche aufgebracht. Verteilen Sie die Zellen nicht.
5. Das Agarose-Gel schnell auf die 35 mm Glasbodenschale (obere Seite nach unten) zurückgeben und dann mit einem Deckel abdecken. Entfernen Sie bei Bedarf Luftblasen, indem Sie den Agar vorsichtig gegen die Platte drücken.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des experimentellen Workflows. Das Agarose-Pad wird aus der 35-mm-Schale entfernt und gekippt, so dass die untere Seite nach oben zeigt. Frische Suspensionen von Raubzellen und über Nacht Kultur von Beutezellen werden auf dem gekippten Pad platziert, um die "untere" Seite zu beschichten. Das Agarose-Pad wird dann in seine ursprüngliche Ausrichtung gekippt und in der 35-mm-Schale wieder platziert, die in der Mikroskopkammer auf der invertierten Mikroskopstufe montiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Leitung der Zeitrafferfluoreszenzmikroskopie

1. Legen Sie die 35 mm Schale in den Petrischalenhalter, so dass sie sich im Laufe des Experiments nicht bewegt. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl (1.518 Brechungsindex) auf das Objektiv sowie den Boden der 35 mm Schale.
2. Montieren Sie den Halter auf die Bühne des invertierten Mikroskops in der Mikroskopkammer.
3. Richten Sie die Optionen in der Mikroskopsteuerungssoftware ein, um mehrere Bilder an mehreren Bühnenpositionen im Laufe der Zeit zu sammeln.
   1. Stellen Sie die Vergrößerung (100x) und die polychrome Linse (GFP/mCherry) ein. Mit einem Eyepiece und Brightfield (BF) finden Sie die Brennebene und öffnen Sie den Punktlisten-Manager.
   2. Wählen Sie mindestens 10 Sehenswürdigkeiten aus, indem Sie die Bühne verschieben und die Koordinaten für jede Position in der Mikroskopsoftware speichern, indem Sie auf die Schaltfläche Punkt markieren klicken. Vermeiden Sie Positionen in der Nähe von einander, um Photobleichungen und Phototoxizität zu verhindern. Drehen Sie das Kameraventil vom Okular auf den Monitor und kalibrieren Sie jeden Punkt, indem Sie die Fokusebene einstellen und im Punktlisten-Manager auf die Schaltfläche Punkt ersetzen klicken.
   3. Öffnen Sie den Experiment-Designer, und legen Sie alle experimentellen Parameter auf jeder Registerkarte wie folgt fest:
      1. Deaktivieren Sie die Z-Stapelbox.
      2. Wählen Sie Fluoreszenzkanäle und stellen Sie die optimalen Beleuchtungseinstellungen ein. Hier wurden folgende Einstellungen verwendet: für den mCherry-Kanal, mCherry Filtersätze (EX575/25; EM625/45), 50% Intensität und 200 ms Expositionszeit; für den GFP-Kanal, GFP-Filtersatz (EX475/28; EM525/48), 50% Intensität und 80 ms; und für die BF-Bilder, POL-Kanal, 5% Intensität und 50 ms.
      3. Wählen Sie Intervalle zwischen dem Erfassen von Bildern und der Gesamtzeit des Experiments aus. Hier wurden 5 min Intervalle über den 10 h-Zeitraum des Experiments durchgeführt.
      4. Aktivieren Sie die Fokuspflege für die gewählten Positionen (für das hier verwendete System, indem Sie das Kontrollkästchen Fokus beibehalten mit UltimateFocus markieren).
      5. Wählen Sie den Datenordner aus, in dem die Bilddateien automatisch gespeichert werden sollen.
      6. Überprüfen Sie alle Einstellungen in der Steuerung der Mikroskopsoftware, und starten Sie dann das Zeitrafferexperiment.
4. Überprüfen Sie nach der ersten Stunde des Experiments, ob alle Bühnenpositionen noch im Fokus stehen. Passen Sie den Fokus in Zeitintervallen zwischen der Bildaufnahme an, falls erforderlich.
5. Wenn das Zeitrafferexperiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Petrischale und verwenden Sie die 35 mm Schale mit einem Agarose-Pad nach dem Biosicherheitsprotokoll.
   HINWEIS: Alle Unterschritte nach Schritt 5.2 sind spezifisch für DeltaVision Elite-Benutzer. Forscher, die andere Systeme verwenden, müssen die Einstellungen an die einzelnen Systeme anpassen.

6. Verarbeitung von Zeitrafferbildern und Generierung von Filmen mit Fidschi-Software

1. Übertragen Sie experimentelle Daten auf einen Computer, der mit der Fidschi-Software geladen ist. Starten Sie das Fidschi-Programm und öffnen Sie ein Bild mit Datei | Öffnen Sie oder indem Sie einfach die Bilddatei nach Fidschi ziehen und ablegen.
2. Wählen Sie in denOptionen für die Stapelanzeige die Option Stapel mit Hyperstack anzeigen aus, klicken Sie in den Farboptionen auf Composite, und markieren Sie Autoscale.
3. Beurteilen Sie durch einen Bildlauf durch die Bildstapel, ob die Zellen und Bdelloplaste im Laufe des Experiments im Fokus blieben. Prüfen Sie, ob grüne fluoreszierende Flecken von DnaN-mNeonGreen innerhalb von B. bakteriovorus Zellen in Bdelloplasten während der wachstumsphase vorhanden sind, und stellen Sie sicher, dass alle Stadien des raubtierlichen Lebenszyklus visualisiert werden können.
4. Um eine bestimmte B. bakteriovorus Zelle/Bdelloplast zu analysieren, markieren Sie sie mit den Auswahlwerkzeugen im Fidschi-Menü (Rechteck, Oval , Polygon oder Freihand). Duplizieren der ausgewählten Region mithilfe von Image | Duplizieren oder mit Strg + Umschalt + D.
5. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast für jeden Fluoreszenzkanal wie folgt an:
   1. Um einen einzelnen Kanal auszuwählen, öffnen Sie Channel-Tools, indem Sie auf Bild | Farbe | Kanäle Werkzeuge oder Strg + Shift + Z, und wählen Sie den Kanal von Interesse (Kanal 1: mCherry, Kanal 2: mNeonGreen, Kanal 3: hellfeld).
   2. Anpassen der Helligkeit und des Kontrasts von Bildern im Fluoreszenzkanal, indem Sie das B&C-Menü in Bild | Anpassen | Helligkeit/Kontrast oder durch Klicken auf Strg + Umschalt + C.
6. Hinzufügen einer Maßstabsleiste mithilfe von Analyze | Werkzeuge | Skalenleiste. Fügen Sie den Zeitstempel zu den Bildern hinzu, indem Sie auf Bilder | Stapel | Zeit-Stempel.
7. Um geänderte Bilder zu speichern, gehen Sie zu Datei | Speichern Sie unter, und wählen Sie TIFF, um es als Bildsequenz zu speichern, AVI, um einen Film zu erstellen, oder PNG, um ein einzelnes Bild des aktuellen Frames zu speichern.

Ergebnisse

Das beschriebene TLFM-basierte System ermöglicht die rechtzeitige Verfolgung einzelner Zellen vonB. bakteriovorus (Abbildung 3, Film 1) und liefert wertvolle Informationen über jede Phase des komplexen Raublebenszyklus. Die PilZ-mCherry-Fusion ermöglicht die Kennzeichnung der gesamten Raubzelle in der Angriffsphase sowie der frühen Phase der Wachstumsphase (Abbildung 3). Der Übergang von der Angriffs- zur Replikphase wurde nicht nur dur...

Diskussion

Aufgrund des gestiegenen Interesses an der Verwendung von B. bacteriovorus als lebendes Antibiotikum sind neue Werkzeuge zur Beobachtung des raubtierlichen Lebenszyklus, insbesondere raubtier-pathogene Wechselwirkungen, erforderlich. Das vorgestellte Protokoll wird verwendet, um den gesamten B. bakteriovorus Lebenszyklus zu verfolgen, vor allem während seines Wachstums innerhalb des Hosts, in Echtzeit. Darüber hinaus ermöglichte die Anwendung eines Stammes, der fluoreszierend getaggte Betaklemme des DNA...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zentrifuge	MPW MED. INSTRUMENTS	MPW-260R	Rotor ref. 12183
CertifiedMolecular Biology Agarose	BIO-RAD	161-3100	Agarose mit niedriger Fluoreszenz für Agarose-Pad
Fiji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Open-Source-Bildverarbeitungspaket
Glasbodenschale 35 mm	ibidi	81218-200	unbeschichtetes Glas
Mikroskop	GE	DeltaVision Elite	Mikrotitertisch, Ultimate Focus Lasermodul, DV Elite CoolSnap HQ2 Kamera, SSI-Baugruppe FP DV, Kit obj. Oly 100x Öl 1,4 NA, Prisma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Minisart Filter 0,45 µ m	Sartorius	16555----------K	Celluloseacetat, steril, Luer-Lock-Ausgang
Start SoftWoRx	GE		Vom Hersteller bereitgestellte Bildgebungssoftware