In Utero Elektroporation von Multiadressierbaren Genom-integrierenden Farbe (MAGIC) Marker zur Individualisierung kortikaler Maus-Astrozyten

Laura Dumas; Solène Clavreul; Jason Durand; Edwin Hernandez-Garzon; Lamiae Abdeladim; Raphaëlle Barry-Martinet; Alicia Caballero-Megido; Emmanuel Beaurepaire; Gilles Bonvento; Jean Livet; Karine Loulier

doi:10.3791/61110

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Methodenartikel

In Utero Elektroporation von Multiadressierbaren Genom-integrierenden Farbe (MAGIC) Marker zur Individualisierung kortikaler Maus-Astrozyten

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DOI:

10.3791/61110

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21. Mai 2020

Laura Dumas^*¹ , Solène Clavreul^*² , Jason Durand¹ , Edwin Hernandez-Garzon³ , Lamiae Abdeladim⁴ , Raphaëlle Barry-Martinet² , Alicia Caballero-Megido¹ , Emmanuel Beaurepaire⁴ , Gilles Bonvento³ , Jean Livet² , Karine Loulier¹

¹Université de Montpellier, INSERM, Institut des Neurosciences de Montpellier, ²Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, ³Université Paris-Saclay, CEA, CNRS, MIRCen, Laboratoire des Maladies Neurodégénératives, ⁴Laboratory for Optics and Biosciences, Ecole polytechnique, CNRS, INSERM, IP Paris

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Astrozyten kacheln die Großhirnrinde gleichmäßig, was die Analyse ihrer komplexen Morphologie auf zellulärer Ebene schwierig macht. Das hier bereitgestellte Protokoll verwendet eine mehrfarbige Etikettierung basierend auf der in utero Elektroporation, um kortikale Astrozyten herauszuarbeiten und deren Volumen und Morphologie mit einer benutzerfreundlichen Bildanalyse-Pipeline zu analysieren.

Zusammenfassung

Protoplasmatische Astrozyten (PrA) in der Maus großhirnrinde sind eng nebeneinander gestellt, bilden eine scheinbar kontinuierliche dreidimensionale Matrix in Erwachsenenstadien. Bisher kann keine Immunfleckenstrategie sie herausgreifen und ihre Morphologie in reife Tiere und im Laufe der Kortikogenese segmentieren. Cortical PrA stammen von Vorläufern, die sich im dorsalen Pallium befinden und können leicht mit der Utero-Elektroporation integrativer Vektoren gezielt werden. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um diese Zellen mit der multiadressierbaren genomintegrierenden Farbe (MAGIC) Markers-Strategie zu kennzeichnen, die auf piggyBac/Tol2-Transposition undCre/lox-Rekombination beruht, um stochastisch unterschiedliche fluoreszierende Proteine (blau, cyan, gelb und rot) auszudrücken, die an bestimmte subzelluläre Kompartimente adressiert sind. Diese mehrfarbige Schicksalskartierungsstrategie ermöglicht es, in situ nahe gelegenen kortikalen Vorläufern vor Beginn der Gliogenese Kombinationen zu markieren und ihre Nachkommen, einschließlich Astrozyten, von embryonalen bis erwachsenen Stadien auf der Ebene der einzelnen Zellen zu verfolgen. Die halbkarsische Beschriftung, die durch die Anpassung der Konzentration von elektroporated Vektoren und Farbkontrasten erreicht wird, die von den Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers oder MM) bereitgestellt werden, ermöglichen es, Astrozyten zu individualisieren und ihr Territorium und ihre komplexe Morphologie trotz ihrer dichten anatomischen Anordnung herauszuarbeiten. Hier wird ein umfassender experimenteller Workflow vorgestellt, der die Details des Elektroporationsverfahrens, die Erfassung von Mehrkanal-Bildstapeln durch konfokale Mikroskopie und die computergestützte dreidimensionale Segmentierung enthält, die es dem Experimentator ermöglicht, einzelne PrA-Volumen und Morphologie zu bewerten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Elektroporation von MAGIC Markern eine bequeme Methode bietet, um zahlreiche Astrozyten einzeln zu beschriften und in verschiedenen Entwicklungsstadien Zugang zu ihren anatomischen Merkmalen zu erhalten. Diese Technik wird nützlich sein, um kortikale astrozyte morphologische Eigenschaften in verschiedenen Mausmodellen zu analysieren, ohne auf komplexe Kreuze mit transgenen Reporterlinien zurückzugreifen.

Einleitung

Astrozyten spielen zahlreiche wichtige Funktionen in der Gehirnentwicklung und Physiologie¹. Neben ihrer Rolle an der Blut - Hirn-Schranke, wo sie die Nährstoffaufnahme und den Blutfluss regulieren, tragen sie aktiv zur Synapsenbildung und -funktion bei und produzieren Neuromodulatoren, die die neuronale Aktivität und das Verhalten verändern können². Darüber hinaus trägt Astrozytendysfunktion zu einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen³. Astrozyten in der Großhirnrinde zeigen eine ausgeklügelte Morphologie, die einen umfassenden Kontakt mit neuronalen Prozessen ermöglicht. Diese Kontakte, di....