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Methodenartikel

Ein Benchtop-Ansatz zur standortspezifischen Blut-Hirn-Barriere-Öffnung mit fokussiertem Ultraschall in einem Rattenmodell

4.4K Aufrufe

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DOI:

10.3791/61113

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13. Juni 2020

 ,  ,  , 
1Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Fokussierter Ultraschall mit Mikroblasenmitteln kann die Blut-Hirn-Schranke fokal und vorübergehend öffnen. Diese Technik wurde verwendet, um eine breite Palette von Agenten über die Blut-Hirn-Schranke zu liefern. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die lokalisierte Lieferung an das Nagetierhirn mit oder ohne MRT-Führung.

Zusammenfassung

Stereotaxic Chirurgie ist der Goldstandard für lokalisierte Medikamente und Gen-Lieferung an das Nagetier Gehirn. Diese Technik hat viele Vorteile gegenüber der systemischen Lieferung einschließlich präziser Lokalisierung auf eine Zielhirnregion und Reduzierung von Nebenwirkungen. Die stereotaxic-Chirurgie ist jedoch hochinvasiv, was ihre translationale Wirksamkeit einschränkt, lange Erholungszeiten erfordert und Herausforderungen bietet, wenn sie mehrere Hirnregionen ins Visier nimmt. Fokussierter Ultraschall (FUS) kann in Kombination mit zirkulierenden Mikroblasen verwendet werden, um die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in millimetergroßen Regionen vorübergehend zu öffnen. Dies ermöglicht die intrakranielle Lokalisierung systemisch gelieferter Agenten, die normalerweise nicht über die BBB verfügen können. Diese Technik bietet eine nichtinvasive Alternative zur stereotaxic-Chirurgie. Bislang ist diese Technik jedoch in neurowissenschaftlichen Laboratorien aufgrund des begrenzten Zugangs zu Geräten und standardisierten Methoden noch nicht weit verbreitet. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen Benchtop-Ansatz für die FUS BBB-Öffnung (BBBO) zu bieten, der erschwinglich und reproduzierbar ist und daher von jedem Labor problemlos übernommen werden kann.

Einleitung

Trotz der vielen Entdeckungen in der grundlegenden Neurowissenschaft, die Anzahl der neu auftretenden Behandlungen für neuroentwicklungs- und neurodegenerative Erkrankungen bleibt relativ begrenzt1,2. Ein tieferes Verständnis der Gene, Moleküle und zellulären Schaltkreise, die an neurologischen Störungen beteiligt sind, hat vielversprechende Behandlungen vorgeschlagen, die beim Menschen mit aktuellen Techniken nicht realisierbar sind3. Effektive Behandlungen sind oft durch die Notwendigkeit begrenzt, gehirndurchdringlich und standortspezifisch4,5,6,7,8. Die bestehenden Methoden der lokalisierten Medikamentenabgabe in bestimmte Hirnregionen (z. B. Die Abgabe per Injektion oder Kanüle) sind jedoch invasiv und erfordern eine Öffnung im Schädel9. Die Invasivität dieser Operation verhindert die routinemäßige Verwendung der lokalisierten Lieferung in das menschliche Gehirn. Darüber hinaus sind Gewebeschäden und die daraus resultierenden Entzündungsreaktionen allgegenwärtige Konfounds für grundlegende und präklinische Studien, die auf intracerebrale Injektion10angewiesen sind. Die Fähigkeit, nicht-invasiv Agenten über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu liefern und sie auf bestimmte Hirnregionen zu zielen, könnte einen enormen Einfluss auf die Behandlung von neurologischen Störungen haben und gleichzeitig ein leistungsfähiges Prüfwerkzeug für die präklinische Forschung bieten.

Eine Methode des gezielten Transports über die BBB mit minimalen Gewebeschäden ist transkraniell fokussierter Ultraschall (FUS) zusammen mit Mikroblasen, um die BBB11,12,13,14,15,16fokal und vorübergehend zu öffnen. FUS BBB Eröffnung hat in jüngster Zeit Aufmerksamkeit für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, Schlaganfall und Gliom durch die Lokalisierung von Therapeutika auf Hirnregionen wie neurotrophe Faktoren17,18,19, Gentherapien20,21,22, Antikörper23, Neurotransmitter24, und Nanopartikel25,26,27,28,29. Mit seinem breiten Anwendungsspektrum und seiner nichtinvasiven Natur30,31ist die FUS BBB Öffnung eine ideale Alternative zu routinemäßigen stereotaxic intrakraniellen Injektionen. Darüber hinaus können aufgrund seiner aktuellen Anwendung beim Menschen30,32, präklinische Untersuchungen mit dieser Technik als hochgradig translational angesehen werden. Die Eröffnung der FUS BBB ist jedoch aufgrund mangelnder Zugänglichkeit noch keine weit verbreitete Technik in der Grundlagenforschung und präklinischen Forschung. Daher bieten wir ein detailliertes Protokoll für einen Benchtop-Ansatz zur Eröffnung von FUS BBB als Ausgangspunkt für Labore, die an der Etablierung dieser Technik interessiert sind.

Diese Studien wurden entweder mit einem hochleistungsluftgestützten FUS-spezifischen Ultraschallwandler oder einem mit geringer Leistung gedämpften fokussierten Ultraschall-Immerauchwandler durchgeführt. Die Messumformer wurden von einem HF-Leistungsverstärker für reaktive Lasten und einem Standard-Tischfunktionsgenerator angetrieben. Details zu diesen Artikeln finden Sie in der Tabelle der Materialien.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Fokussierte Ultraschall-Fahrgeräte-Setup

  1. Verwenden Sie 50 Ohm koaxiale BNC-Kabel, um (1) den Eingang des Ultraschallwandlers an den Ausgang des HF-Verstärkers und (2) den Eingang des HF-Verstärkers an den Ausgang des Funktionsgenerators anzuschließen.
  2. Stellen Sie den Funktionsgeneratormodus einmal pro Sekunde mit einem 1%-Betriebszyklus auf einen sinusförmigen Burst ein.
    1. Für den gedämpften 1 MHz Low-Power-Tauchwandler mit einem 0,8-Zoll-Brennweitenabstand, der mit einem 50 dB HF-Verstärker verwendet wird, stellen Sie die Starteinstellungen auf: 1 MHz Sinuswelle, 1 V Peak to Peak, 10k-Zyklus, 1 s Intervall (oder Periode).
    2. Für den luftgestützten 1,1 MHz Hochleistungswandler stellen Sie die Anfangseinstellungen auf: 1,1 MHz Sinuswelle, 50 mV Peak to Peak, 11k Zyklen, 1 s Intervall.
      HINWEIS: Betreiben Sie die Messumformer nur dann, wenn sie unterGetaucht sind. Legen Sie keine Hand oder ein anderes Körperteil am Ultraschallfokus oder berühren Sie das Wandlergesicht während der Bedienung.

2. Fokussierte Ultraschall-Tisch-Setup

  1. 3D-Druck den stereotaxic Rahmen und den stereotaktischen Rahmenhalter.
  2. Schließen Sie den Messumformer mit einer Klemme an, die ein PVC-Rohr hält (Abbildung 1a). Schrauben Sie die Klemme auf den X-Achsenschlitten und verriegeln Sie sie mit einer Flügelmutter.
    1. Wenn Sie den Hochleistungs-Ultraschallwandler verwenden, befestigen Sie ihn mit einem abgestimmten Magnetpaar am PVC-Rohr. Stellen Sie sicher, dass ein Magnet ein Loch und der andere einen passenden Vorsprung hat. Schließen Sie den Boden des PVC-Rohrs und befestigen Sie einen der Magnete mit Epoxid daran (siehe Abbildung 1b).
    2. Befestigen Sie den zweiten Magneten mit Epoxid an der oberen Mitte des Hochleistungs-Ultraschallwandlers. Stellen Sie sicher, dass es sich in der Mitte des Messumformers befindet (Abbildung 1c).
  3. Wenn Sie den Hochleistungs-Ultraschallwandler verwenden, machen Sie einen Zeiger, um den XYZ-Positionierer zu nichtig zu machen. Die Spitze dieses Zeigers zeigt die Position im Raum des Mittelpunkts des Messumformers an, wenn der Ultraschallwandler am XYZ-Positionierer befestigt ist. Machen Sie einen Zeiger aus einem 18 G Nadelschnitt, der die Länge des Brennweiten des Messumformers plus die Dicke des Messumformers ist (Abbildung 1d).
    1. Tragen Sie Epoxid auf einen dritten Magneten auf (dieser Magnet paart sich auch mit dem PVC-Kappenmagneten) und befestigen Sie es an der Spitze des Zeigers. Der Zeiger kann dann an dem Magneten am PVC-Rohr für XYZ nulling befestigt werden (Abbildung 1d).
  4. Wenn Sie den Low-Power-Tauchaufnehmer verwenden, drucken Sie die Datei für den Zeiger und den Montageclip in 3D.
    1. Befestigen Sie den Stromabnehmer mit geringem Stromverbrauch am PVC-Rohr, indem Sie den Montageclip auf das PVC-Rohr schneiden und den Messumformer in den Ring einlegen (Abbildung 1f).
  5. Machen Sie ein Wasserbad, indem Sie Stücke aus Acrylfolie zusammenkleben, die in der Lage sein werden, auf dem Kopf des Tieres über dem stereotaktischen Rahmen zu ruhen (Abbildung 1e).
    1. Schneiden Sie eine Öffnung in den Boden des Bades, die etwa die Größe des Kopfes des Tieres ist. Bedecken Sie das Loch im Wasserbad mit einem Polyimidband.
      HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass Wasser nicht um das Polyimidband ausläuft, da es das Fell der Ratte benetzen und Unterkühlung verursachen kann.
  6. Machen Sie eine MRT-Fiducial, indem Sie eine dünnschalige Kunststoff- oder Glaskugel mit einem 4 mm Durchmesser dünnen Kunststoff oder Glaskugel mit einer MRT-sichtbaren Flüssigkeit (z. B. Vitamin E Öl) füllen und versiegeln. Legen Sie es in den MRT-Fiducial-Halter auf der rechten Seite des 3D-gedruckten stereotaxic-Rahmens (Abbildung 2a).
  7. Sichern Sie den 3D-gedruckten Rahmenhalter an einem guten Ort für die Tierpositionierung am XYZ-Positionierer fest. Schieben Sie die Lasche am rostralen Ende des Rahmenhalters in den passenden Kanal auf der Y-Achsenschiene und sichern Sie sie mit stellaturen Schrauben(Abbildung 1h,rote Pfeile).
  8. Um den XYZ-Positionierer zu fahren, installieren Sie den USB-zu-Seriell-Konverter auf einem Computer, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen und den Konverter anschließen. Installieren Sie die Laufzeitumgebung und die Motorcontroller-Software auf dem PC.
    1. Stellen Sie sicher, dass der richtige serielle Anschluss in der Software ausgewählt ist, indem Sie den USB-zu-Seriell-Konverter in der Dropdown-Steuerung für die Portauswahl auf dem Frontpanel der Controller-Software auswählen. Schließen Sie den USB-zu-Seriell-Konverter über ein 9-poliges serielles Crossover-Kabel (z. B. RS232-Nullmodemkabel) an die Schrittmotor-Controller-Box an.
    2. Führen Sie die Controller-Software aus, um zu testen, ob die Schrittmotoren unter Softwaresteuerung angetrieben werden können. Dieser Schritt kann die Unterstützung des lokalen IT-Supports erfordern.

3. Intrakranielles Targeting-Verfahren

HINWEIS: Männliche Sprague Dawley Ratten mit einem Gewicht von 250-350 g wurden für diese Experimente verwendet. Die Tiere hatten freien Zugang zu Wasser und Ratten-Chow und wurden auf einem 12:12 h-Licht:Dunkel-Zyklus gepflegt.

  1. Setzen Sie das Tier unter Anästhesie (3% Isofluran mit Sauerstoff) und überprüfen Sie auf die fehlende Reaktion auf die Zehenprise. Legen Sie dann den Katheter wie unten beschrieben ein.
    1. Erwärmen Sie den Schwanz mit einer Lampe zu machen ist einfacher, die Vene zu treffen. Achten Sie darauf, das Tier nicht zu überhitzen oder den Schwanz zu verbrennen.
    2. Sobald das Tier schläft (reagiert nicht auf eine Zehenklemme), legen Sie den 24 G Schwanz Venenkatheter, der verwendet wird, um Mikroblasen, Evans blauer Farbstoff (EBD), Gadobutrol MRT Kontrast, wenn mit MRT, und das experimentelle Mittel von Interesse liefern. Sobald die Vene getroffen ist, wird Blut die Hülle füllen, langsam die innere Nadel entfernen, während die Hülle weiter in die Vene geschoben wird.
      HINWEIS: Sehen Sie sich eine Anleitung wie Stuart und Schroeder33 an, wenn Sie zum ersten Mal die Rattenschwanzvene-Injektionen vornehmen.
    3. Wenn es keinen Blutfluss gibt, bewegen Sie langsam die Katheterscheide aus der Vene, um zu testen, ob die Nadel durch die Vene gestochen haben könnte. Wenn Blut fließt, wenn der Katheter leicht zurückgezogen wird, dann ging zuerst Poke durch die Vene und die Katheterplatzierung muss an einer anderen Stelle am Schwanz neu gestartet werden, die rostral zum vorherigen Standort ist.
  2. Füllen Sie den Katheterstecker mit Einer Linie und schrauben Sie den Katheterstecker in das Ende des Katheteranschlusses, sobald sich der Port mit Blut gefüllt hat. Wickeln Sie das Laborband vorsichtig um den Katheter und den Schwanz, um es an Ort und Stelle zu halten. Beginnen Sie mit einem kleinen Stück an der Spitze und arbeiten Sie in kaudaler Richtung, so dass das Ende des Kathetersteckers freigelegt wird.
  3. Stecken Sie die Anästhesielinie an den Anästhesieanschluss am stereotaxic-Rahmen (Abbildung 2a) und fixieren Sie den Kopf des Tieres in den Rahmen, indem Sie den Mund auf die Bissstange legen und die Ohrstangen in beide Gehörgänge führen, und ziehen Sie dann die Stellschrauben fest. Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Tiere sicher und eben ist.
  4. Bewegen Sie das Tier in das MRT-Bett und verbinden Sie die Anästhesielinie mit dem Nasenkegel. In diesem Protokoll wurde eine 9,4 T Kleinbohrtier-MRT verwendet.
  5. Sammeln Sie koronale und axiale T2-gewichtete Bilder, die das gesamte Gehirn sowie die MRT-Fiducial (Abbildung 2b) für Koordinatenmessungen erfassen. Geben Sie dem lokalen MRT-Physiker oder Der Technologie die folgenden Informationen an, damit er das MRT-Protokoll erstellen kann.
    1. Für koronale Bilder(Abbildung 2b oben) verwenden Sie die folgenden Parameter: Anzahl der Bilder: 27, Breite: 62,2 mm, Höhe: 62,2 mm, Tiefe: 37,97 mm, Voxel-Größe: 0,24 x 0,24 x 1,41 mm3.
    2. Für axiale Bilder(Abbildung 2b unten) verwenden Sie die folgenden Parameter: Anzahl der Bilder: 13, Breite: 61,47 mm, Höhe: 53,81 mm, Tiefe: 16,7 mm, Voxel-Größe: 0,41 x 0,21 x 1,29 mm3.
      HINWEIS: Es ist nicht notwendig, diese genauen Parameter zu haben, solange die koronale in der Ebene Auflösung ist nahe 0,25 mm und die Bilder decken das gesamte Gehirn und Treuhand.
  6. Sammeln Sie Koordinatenmessungen aus den obigen Bildern, indem Sie den Abstand vom MRT-Fiducial zur Hirnregion aufzeichnen, die mit FUS anvisiert wird.
    1. Auf dem Scanner, auf den koronalen Bildern, die in Schritt 3.5 gesammelt wurden, finden Sie das Bild, in dem der Treuhandstand das größte ist, was auf die Mitte des Treuhandhandels hinweist. Zeichnen Sie den Abstand von der Spitze des Treuhandlandes zur Hirnregion von Interesse in mm auf (die MRT-Software wird über ein Skalen- oder Punktmesswerkzeug verfügen, die lokale MRT-Technologie oder den Physiker konsultieren, wie dies zu tun ist) sowohl in medialer/lateraler Richtung als auch in dorsaler ventraler Richtung(Abbildung 2b, oben).
    2. Auf den in Schritt 3.5 gesammelten axialen Bildern finden Sie auf den axialen Bildern, die in Schritt 3.5 gesammelt wurden, das Bild, das die Spitze des Treuhandwesens zeigt, und messen den Abstand vom Zentrum des Treuhandbereichs zum Zielhirnbereich sowohl in dorsaler/ventraler Richtung als auch in medialer/lateraler Richtung(Abbildung 2b, unten).
    3. Vergleichen Sie die beiden medialen/lateralen Messungen und verwenden Sie, wenn sie unterschiedlich sind, den Durchschnitt. Diese Koordinatenmessungen werden später in Schritt 4.3 verwendet, um den FUS-Brennpunkt mit dem XYZ-Positionierer zum Zielhirnbereich zu führen.
  7. Sammeln Sie MRT-Prescan-Bilder. Vergleichen Sie diese Bilder mit den Bildern, die nach der Eröffnung von FUS BBB gesammelt wurden (Abbildung 4). T1-gewichtete Bilder werden später verwendet, um BBB-Öffnung zu visualisieren, T2-gewichtete Bilder werden später verwendet, um sicherzustellen, dass nach der FUS-Behandlung keine Gewebeschäden aufgetreten sind34.
    1. Verwenden Sie für T1-gewichtete Axialbilder folgende Parameter: Breite: 30 mm, Höhe: 51,2 mm, Tiefe: 3,0 mm, Voxelgröße: 0,23 x 0,2 x 0,23 mm3, Anzahl der Bilder: 13.
    2. Verwenden Sie für T2-gewichtete Axialbilder folgende Parameter: Breite: 30 mm, Höhe: 51,2 mm, Tiefe: 2,6 mm, Voxelgröße: 0,2 x 0,2 x 0,2 mm3, Anzahl der Bilder: 13.
    3. Für T1-gewichtete koronale Bilder die folgenden Parameter verwenden: Breite: 30 mm, Höhe: 30 mm, Tiefe: 27 mm, Voxelgröße: 0,16 x 0,16 x 1 mm3, Anzahl der Bilder: 27.
    4. Für T2-gewichtete koronale Bilder die folgenden Parameter verwenden: Breite: 30 mm, Höhe: 30 mm, Tiefe: 27 mm, Voxelgröße: 0,12 x 0,12 x 1 mm3, Anzahl der Bilder: 27.
      HINWEIS: Wie in Schritt 3.5 müssen diese Bildparameter nicht genau die gleichen sein wie aufgelistet. Diese Bilder haben eine kleinere FOV und eine höhere Auflösung als die in Schritt 3.5 gesammelten.
  8. Halten Sie das Tier im stereotaxic Rahmen, schnell transportieren Sie das Tier vom MRT-Bett auf die Banktop FUS-Setup. Stellen Sie sicher, dass das Tier für den Transfer unter der Wirkung der Anästhesie schläft.
  9. Für längere Transferzeiten verwenden Sie eine Box für die Übertragung, die groß genug ist, um das Tier und den Rahmen zu passen. Mit dem anästhesien Stecker noch befestigt, legen Sie das Tier und Rahmen in der Box und lassen Sie die überschüssige Isoflurane, um die Box für ein paar Minuten zu füllen. Ziehen Sie die Anästhesielinie ab und übertragen Sie sie schnell.

4. Fokussiertes Ultraschallverfahren

  1. Bei der Ankunft in der FUS-Tischeinrichtung, stecken Sie sofort die Anästhesielinie in den Nasenkegel und weiter laufen 1,5-3% Isofluran mit Sauerstoff. Tun Sie dies so schnell wie möglich, um das Aufwachen des Tieres zu vermeiden.
  2. Schieben Sie den Rahmen in den Rahmenhalter und schnappen Sie ihn fest ein. Verwenden Sie Clippers, um den Kopf des Tieres zu rasieren. Bürsten Sie überschüssiges Haar weg und tragen Sie Haarentferner Creme auf die Kopfhaut. 3 min sitzen lassen und mit Wasser und Gaze abwischen.
  3. Wenn MRT nicht für targeting verfügbar ist, verwenden Sie einen standardmäßigen (nicht 3D-gedruckten) stereotaktischen Rahmen, um die Zeigerposition zu bregma zu nicht zu nullen, indem Sie die Zeigerspitze zu Bregma berühren (dafür wird ein Kopfhautschnitt benötigt) und die Software für ungültig erklären oder die Koordinaten aufzeichnen. Bewegen Sie den XYZ-Wagen um 50 mm nach oben, indem Sie auf die Schaltfläche bis 50 in der Software klicken und den Zeiger gegen den Messumformer tauschen. Basierend auf einem Ratten-Gehirnatlas, wie zuvorbeschrieben 35, bewegen Sie sich zu den gewünschten Gehirnkoordinaten mit den Schritttasten in der Software. Wenn Sie diese Methode anstelle der MRT verwenden, fahren Sie mit Abschnitt 4.6 fort.
  4. Wenn Sie die MRT-Anleitung verwenden, fügen Sie den Zeiger an, und bewegen Sie den Zeiger an die Position des MRT-Fiducials (Abbildung 1d,g). Positionieren Sie den Zeiger ganz oben und in der Mitte des MRT-Fiducials (ein kleines Loch in der Oberseite des Treuhandhalters ist für das Zeigen vorgesehen). Klicken Sie auf die Nullposition-Schaltfläche, die der Punkt ist, von dem aus alle Entfernungen im MRT-Bild berechnet wurden.
  5. Entfernen Sie den Zeiger, und bewegen Sie den Positioner zu den medialen/lateralen Koordinaten und den rostralen/kaudalen Koordinaten. Heben Sie den Positionierer nach oben, indem Sie die Taste bis 50 drücken, um die Platzierung des Wasserbades und des Ultraschallgels zu ermöglichen. Wenn der obere Teil des Z-Achsen-Verfahrwegs erreicht ist, wird die Nullposition ungültig. Die dorsale/ventrale Koordinate wird nach dem Einschließen des Messumformers eingestellt.
  6. Tragen Sie Ultraschallgel auf die Kopfhaut des Tieres auf und legen Sie das Wasserbad über das Tier mit dem Polyimidbandfenster auf das Gel gedrückt. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Ultraschallgel befinden.
  7. Füllen Sie das Wasserbad mit entgastem Wasser.
  8. Wenn Sie den Hochleistungswandler verwenden, senken Sie den Positionierer, so dass sich der Magnet direkt über dem Wasser befindet. Befestigen Sie den Messumformer am Positionierer, indem Sie den Messumformer vorsichtig in einen Winkel ins Wasser senken, um zu verhindern, dass Luftblasen unter dem Gesicht gefangen werden und die Magnete anschließen.
  9. Wenn Sie den Low-Power-Tauchaufnehmer verwenden, senken Sie den Positionierer direkt über dem Messumformerclip ins Wasser. Schneiden Sie dann den Messumformer an Ort und Stelle, indem Sie ihn langsam in einem Winkel ins Wasser senken, um zu verhindern, dass Luftblasen unter dem Gesicht gefangen werden.
    HINWEIS: Ein transparentes Bad ist hilfreich, wenn man unter dem Wandlergesicht nach Blasen sucht.
  10. Senken Sie den Positionierer auf die dorsale/ventrale Koordinate.
  11. Schalten Sie den HF-Leistungsverstärker ein.
  12. Injizieren Sie 1 ml/kg 3% Evans Blaufarbstoff (EBD), indem Sie die Nadelspitze in den Katheterstecker stecken und injizieren. Lassen Sie es für 5 min zirkulieren.
  13. Aktivieren Sie die Mikroblasen, indem Sie sie heftig mit dem Blasenschüttler schütteln.
    1. Bereiten Sie 5x die Dosis von 30 l/kg Mikroblasen (Blase conc. 1,2 x 1010/ml) in 0,2 ml Saline vor, um die 2 FUS-Behandlungen und die Schläuche im 18 G geflügelten Infusionsset zu berücksichtigen. Wenn die Ratte beispielsweise 200 g wiegt, dann füllen Sie die Spritze mit 18 G Nadelspitze mit 30 l Mikroblasen in 1 ml Saline.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, 18 G Nadelspitzen für die Aufnahme und Injektion mit dem geflügelten Infusionsset zu verwenden.
    2. Invertieren Sie die Spritze mehrmals, um eine gleichmäßige Verteilung von Mikroblasen zu erhalten. Dann befestigen und füllen Sie den geflügelten Infusionssatz. Positionieren Sie die Spritze auf der Infusionspumpe und stellen Sie die Infusionspumpe auf 0,2 ml bei einer Rate von 6 ml/h ein. Dies wird eine langsame Infusion der Mikroblasen über die 2-min FUS-Exposition ermöglichen.
    3. Setzen Sie die geflügelte Nadel in den Katheterstecker ein.
  14. Führen Sie zunächst die Infusionspumpe aus, warten Sie 3 s und starten Sie die FUS-Behandlung, indem Sie die Ausgangsaktivierungstaste am Funktionsgenerator drücken (mit der Bezeichnung "auf" auf dem Funktionsgenerator in der Tabelle der Materialien). Wiederholen Sie diese zwei Mal pro Region mit 5 min dazwischen, damit die Mikroblasen entfernt werden können.
    1. Drücken Sie die Ein-Taste erneut am Funktionsgenerator, um die FUS-Behandlung zu stoppen, wenn die Infusionspumpe nach 2 min stoppt.
    2. Warten Sie 5 min, bis die Mikroblasen zu löschen sind. Dann beginnen Sie die Infusion und die zweite FUS-Behandlung.
    3. Unmittelbar nach der zweiten FUS-Behandlung, injizieren Gadbutrol Kontrast (bei Verwendung von MRT) und das Erreger von Interesse, zum Beispiel, virale Partikel. Das Gesamtvolumen aller Mittel sollte 5 ml/kg nicht überschreiten.
      HINWEIS: Der Zeitpunkt der Lieferung (z. B. vor oder nach der Eröffnung von FUS BBB) des Interessenvertreters kann je nach verwendetem Agenten variieren.
  15. Schalten Sie den HF-Leistungsverstärker aus und transportieren Sie das Tier sofort zurück zum MRT.

5. MRT-Bestätigung der BBB-Eröffnung

  1. Wenn keine MRT verfügbar ist, fahren Sie mit Abschnitt 6 fort, und verwenden Sie den EBD-Ausdruck, um die BBB-Öffnung zu bestätigen.
  2. Legen Sie das Tier wieder auf das MRT-Bett an der exakt gleichen Stelle wie in Schritt 3.7 und stecken Sie die Anästhesielinie ein.
  3. Sammeln Sie die MRT-Post-Scans mit den gleichen Bildgebungsparametern, die in Schritt 3.7 verwendet werden, um die Verbesserung der Gadobutrol-MRT im Bereich der BBB-Öffnung zu visualisieren (Abbildung 3b,e).

6. Perfusion und Gewebesammlung

  1. Durchdringen Sie das Tier mit kaltem 4% Formalin, bis das Blut völlig klar läuft.
  2. Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie in 4% Formalin oder PFA bei 4 °C über Nacht. Als nächstes legen Sie das Gehirn in 30% Saccharoselösung, bis das Gehirn sinkt (ca. 2-3 Tage). Schließlich in flüssigem Stickstoff oder auf Trockeneis einfrieren und bei -80°C bis zum Kryosektionen lagern.
  3. Einfrieren Sie das Gehirn in OCT und nehmen Sie Kryosektionen.
  4. Fix- und Coverslip-Abschnitte für die Fluoreszenzmikroskopie. EBD-Erregungsspitzen bei 470 und 540 nm und Emissionsspitzen bei 680 nm. Coverslip mit DAPI-Montagemedium, um die gesamte zelluläre Morphologie zu visualisieren.

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Ergebnisse

Hier zeigen wir, dass fokussierter Ultraschall mit Mikroblasen eine lokalisierte BBB-Öffnung mit den oben angegebenen Parametern sowohl mit dem Low-Power-Tauchwandler (Abbildung 3) als auch mit dem FUS-Wandler (Abbildung 4) induzieren kann. Zunächst wurde in frühen Experimenten der Low-Power-Tauchwandler auf eine Gehirnhälfte entweder anterior (Abbildung 3b) oder medial (Abbildung 3a) ausgerichtet. Die ...

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Diskussion

Hier beschrieben wir einen Benchtop-Ansatz zur mikrobubbleunterstützten FUS BBB-Öffnung mit alternativen Ansätzen, einschließlich zweier verschiedener Messumformer und Methoden für intrakranielles Targeting mit und ohne MRT-Führung. Um die MRT-geführte FUS BBB-Öffnung im Labor zu etablieren, besteht derzeit die Möglichkeit, hervorragende gebrauchsfertige Geräte zu erwerben, die hochstandardisierte und reproduzierbare Ergebnisse mit benutzerfreundlichen Schnittstellen liefern. Viele Labore sind jedoch nicht auf die Kosten...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Forschung wurde teilweise durch ein NSF EPSCoR Research Infrastructure Stipendium an die Clemson University (1632881) unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Forschung teilweise vom Civitan International Research Center, Birmingham, AL unterstützt. Die Autoren danken der Nutzung der Dienste und Einrichtungen der University of Alabama in Birmingham Small Animal Imaging Shared Facility Grant [NIH P30 CA013148]. Die Autoren würdigen Rajiv Chopra für seine Unterstützung und Anleitung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BlasenschüttlerLantheus Medical ImagingVMIXVIALMIX, Aktivierungsgerät zur Aktivierung von Definity-Mikrobläschen
Katheterstopfen / InjektionskappeSAI-InfusionstechnologienTeilenummer:IC-Katheterstopfen / Injektionskappe
Evans blauer FarbstoffSigmaE2129-10GEvans blauer Farbstoff
FunktionsgeneratorTektronixAFG3022BZweikanal, 250MS/s, 25MHz
FUS-Schallkopf, 1,1 MHzFUS InstrumentsTX-1101 MHz MRT-kompatibler sphärisch fokussierter Ultraschallschallkopf mit Hydrophon
Heizkissen für Mäuse und RattenKent ScientificPS-03Heizkissen - PhysioSuite für Mäuse und Ratten
InfusionspumpeKD Scientific780100KDS 100 Legacy Einzelspritzen-Infusionspumpe
KaptonbandGizmo Dorkshttps://www.amazon.com/dp/B01N1GGKRC/
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Immersionsgeber mit geringem Stromverbrauch, 1 MHzOlympusV303-SUImmersionswandler, 1 MHz, 0,50 Zoll. Elementdurchmesser, Standardgehäuseausführung, gerader UHF-Stecker, F = 0,80 Zoll PTF-Magnetsätze
WINOMOhttps://www.amazon.com/dp/B01DJZQJBG/
ref = cm_sw_em_r_mt_dp_U_JYQ7DbM32E5QC		WINOMO 15 mm Einnähen Magnetische Taschenverschlüsse zum Nähen Scrapbooking - 10 Sätze
HF-VerstärkerE& IA07575W
SchwanzvenenkatheterBD382512/ Fisher Artikel: NC122851324g BD Insyte Autoguard abgeschirmte IV-Katheter (nicht geflügelt)
Ultraschall Kontrast MikrobläschenLantheus Medical ImagingDE4, DE16 DEFINITY(Perflutren Lipid Microsphere)
UltraschallgelAquasonichttps://www.amazon.com/dp/B07FPQDM4F/
ref=cm_sw_em_r_mt_dp_U_D6Q7Db3J9QP7P		Ultraschall Gel Aquasonic 100 Transmission 1 Liter Quetschflasche
Geflügelte Infusionssets, 22ga.Fisher Healthcare22-258087Terumo Surflo Winged Infusion Sets
MotorsteuerungssoftwareN/AN/Abenutzerdefinierte Software in LabView zur Steuerung der Velmex-Motorsteuerungs-Laufzeitumgebung
für die MotorsteuerungssoftwareNational InstrumentsLabView Runtime Engine Version 2017 oder besserhttps://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html
3-Achsen-Lineartischantrieb (XYZ-Positionierer)Velmex-Schrauben
VelmexMB-1BiSlide-Schraube 1/4-20x3/4" Innensechskantschraube (10er-Pack), Menge:3
MotorsteuerungVelmexVXM-3Steuerung, 3-Achsen-programmierbare Schrittmotorsteuerung, Menge:1
MontageplattenVelmexMC-2Cleat, 2 Loch BiSlide, Menge:6
MontageplattenVelmexMC-2Cleat, 2 Loch BiSlide, Menge:2
USB zu Seriell KonverterVelmexVXM-USB-RS232USB zu RS232 Serielles Kommunikationskabel 10ft, Menge:1
x-Achse LineartischVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, Verfahrweg=10 Zoll, 2 mm/U, Grenzen, NEMA 23, Menge:1
x-Achse SchrittmotorVelmexPK266-03A-P1Vexta Typ 23T2, Einwellen-Schrittmotor, Menge:1
Y-Achsen-LineartischVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, Verfahrweg=10 Zoll, 2 mm/U, Grenzen, NEMA 23, Menge:1
Y-Achsen-SchrittmotorVelmexPK266-03A-P1Vexta Typ 23T2, Einwellen-Schrittmotor, Menge:1
Z-Achsen-DämpferVelmexD6CL-6.3FD6CL Dämpfer für Typ 23 Doppelwellen-Schrittmotor Motor, Menge:1
Z-Achsen-LineartischVelmexMN10-0100-M02-21BiSlide, Verfahrweg=10 Zoll, 2 mm/U, Grenzwerte, NEMA 23, Menge:1
Z-Achsen-SchrittmotorVelmexPK266-03B-P2Vexta Typ 23T2, Doppelwellen-Schrittmotor, Menge:1
3D-druckbare Dateien
Halterung und Zeigerfür Tauchwandlerhttps://www.tinkercad.com/things/cRgTthGXSRq
Stereotaktischer Rahmenhttps://www.tinkercad.com/things/ilynoQcdqlH
Stereotaktischer Rahmenhalterhttps://www.tinkercad.com/things/aZNgqhBOHAX
9,4T Kleinboreier-MRTBrukerBruker BioSpec 94/20ParaVision Version 5.1
AAV9-hsyn-GFPAddgene
Creme-HaarentfernerChurch & DwightNair Creme
Gadobutrol MRT-KontrastmittelBayerGadavist (Gadobutrol, 1mM/mL)
Stereotaktischer RahmenStoelting#51500nicht MRT-kompatibel schlüsselfertiges
FUS-VerabreichungsgerätFUS InstrumentsRK-300gebrauchsfertig MRT-kompatibles FUS für Nagetiere

Referenzen

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