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Methodenartikel

Intratracheale Instillation von Stammzellen bei Term Neonatal Ratten

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DOI:

10.3791/61117

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4. Mai 2020

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1Department of Pediatrics, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 2Department of Pediatrics, Taipei Medical University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Described ist ein Protokoll zur Durchführung einer intratrachealen Transplantation von mesenchymalen Stromalzellen (MSCs) durch intratracheale Injektion bei neonatalen Ratten. Diese Technik ist eine klinisch praktikable Option für die Abgabe von Stammzellen und Medikamenten in die Lungen der neonatalen Ratte, um ihre Wirksamkeit zu bewerten.

Zusammenfassung

Eine längere Exposition gegenüber hohen Sauerstoffkonzentrationen führt zu Entzündungen und akuten Lungenverletzungen, die der menschlichen Bronchopulmonaldysplasie (BPD) ähneln. Bei Frühgeborenen ist BPD eine hauptverkomplikation trotz des frühen Einsatzes von Tensidtherapie, optimalen Beatmungsstrategien und nichtinvasiver Positivdruckbelüftung. Da Lungenentzündung spielt eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese von BPD, Kortikosteroid Verwendung ist eine mögliche Behandlung, um es zu verhindern. Dennoch, systemische Kortikosteroid Behandlung wird in der Regel nicht für Frühgeborene aufgrund langfristiger Nebenwirkungen empfohlen. Präklinische Studien und klinische Studien der Phase I zeigten, dass die Anwendung von mesenchymalen stromalen Zellen (MSCs) bei hyperoxiainduzierten Lungenverletzungen und bei Frühgeborenen sicher und machbar ist. Intratracheale und intravenöse MSC-Transplantation schützt nachweislich vor neonatalen hyperoxischen Lungenverletzungen. Daher hat sich die intratracheale Verabreichung von Stammzellen und kombinierte Tensid- und Glukokortikoidbehandlung als eine neue Strategie zur Behandlung von Neugeborenen mit Atemwegserkrankungen herauskristallisiert. Das Entwicklungsstadium der Rattenlunge bei der Geburt entspricht dem in der menschlichen Lunge bei der 26-28-Wöchigen Schwangerschaft. Daher sind neugeborene Ratten geeignet, um die intratracheale Verabreichung an Frühgeborene mit Atemnot zu untersuchen, um ihre Wirksamkeit zu bewerten. Diese intratracheale Instillationstechnik ist eine klinisch praktikable Option für die Abgabe von Stammzellen und Medikamenten in die Lunge.

Einleitung

Zusätzliche Sauerstoff ist oft erforderlich, um Neugeborene mit Atemnot zu behandeln1. Jedoch, Hyperoxia-Therapie bei Säuglingen hat negative langzeitige Auswirkungen. Längere Exposition gegenüber hohen Sauerstoffkonzentrationen führt zu Entzündungen und akuten Lungenverletzungen, die der menschlichen Bronchopulmonaldysplasie (BPD)2ähneln. BPD ist eine hauptverkompliktige Hyperoxia-Behandlung, die trotz früher Tensidtherapie, optimaler Beatmungsverfahren und vermehrter Anwendung nichtinvasiver Positivdruckbeatmung bei Frühgeborenen auftreten kann. Während viele Behandlungsstrategien für BPD3berichtet wurden, kann keine bekannte Therapie diese Komplikation reduzieren.

Kortikosteroid-Einsatz ist eine mögliche Behandlung, um BPD zu verhindern, weil Lungenentzündung spielt eine entscheidende Rolle bei seiner Pathogenese. Jedoch, systemische Kortikosteroid-Therapie wird in der Regel nicht für Frühgeborene aufgrund von langfristigen Nebenwirkungen empfohlen4,5.

Mesenchymale Stromalzellen (MSCs) haben pluripotente Eigenschaften und können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren, einschließlich Knochen, Knorpel, Fettgewebe, Muskel und Sehnen6. MSCs haben immunmodulatorische, entzündungshemmende und regenerative Effekte7, und Tierstudien zeigen die therapeutischen Vorteile von MSCs und ihren sezernierten Komponenten bei Hyperoxia-induzierten Lungenverletzungen bei Nagetieren8,9. Intratracheale und intravenöse MSC-Transplantation schützt nachweislich vor neonatalen hyperoxischen Lungenverletzungen. Daher könnte die intratracheale Verabreichung von Stammzellen und eine kombinierte Tensid- und Kortikosteroidtherapie eine potenzielle Behandlungsstrategie zur Behandlung von Neugeborenen mit Atemwegserkrankungen sein. Präklinische Studien haben die intratracheale Verabreichung von Stammzellen und Adeno-assoziierten Viren bei neugeborenen Ratten10,11,12verwendet. Eine schrittweise Darstellung der Technik und in vivo-Tracking der transplantierten Stammzellen ist jedoch nicht verfügbar. Die neugeborene Ratte eignet sich für die Untersuchung der Auswirkungen der intratrachealen Verabreichung auf Frühgeborene mit Atemnot, da das sakkare Stadium der Rattenlunge bei der Geburt dem der menschlichen Lunge bei 26-28 Wochen Trächtigkeitentspricht. Eine wirksame Methode zur Verabreichung in die Rattentracheistin ist entscheidend für eine erfolgreiche Lungenverteilung. Die hier vorgestellte Technik ermöglicht die Untersuchung der intratrachealen Verabreichung von Zellen und/oder Medikamenten zur Behandlung von neonatalen Lungenerkrankungen unter Verwendung von Ratten als Modell für den Menschen.

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Protokoll

Dieses Verfahren wurde vom Animal Care and Use Committee der Taipei Medical University genehmigt.

HINWEIS: Menschliche MSCs, die stabil mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) und Galgengifengen (Fluc) transfiziert wurden, wurden von einem kommerziellen Unternehmen(Tabelle der Materialien)gewonnen.

1. Charakterisierung menschlicher MSCs mit Gelfeluzifase und grünem fluoreszierendem Protein

  1. Bewahren Sie menschliche MSCs, die mit GFP und Fluc transfiziert sind, in vollständigen Medien (minimale wesentliche mittlere Adler-Alpha-Modifikation [MEM], ergänzt mit 10 bis 15 % fetalem Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin, 1 ng/ml Basis-FGF und PSF) bei 37 °C mit gesättigter Feuchtigkeit und 5 %CO2. Durchgangszellen bei einem Zusammenfluss von 70 bis 90 %.
  2. Beobachten Sie MSCs unter einem Fluoreszenzphasenkontrastmikroskop (Abbildung 1A) und analysieren Sie die Expressionswerte von Fluc und GFP14.
  3. Charakterisieren Sie die MSCs, indem Sie den Ausdruck von CD-Markern einschließlich CD44, CD73, CD90, CD105 mithilfe der Durchflusszytometrie analysieren (Abbildung 1B). Induzieren Trilineage Differenzierung von Stammzellen zu Adipozyten, Chondrozyten, und Osteozyten, und bestätigen Trilineage Differenzierung (Abbildung 1C) von Von Kossa, Öl rot O, und Alcian blaue Färbung nach einem kommerziellen Protokoll15,16.

2. Anästhesisierung von Rattenwelpen

  1. Lassen Sie zeitlich datierte schwangere Sprague-Dawley-Ratten vaginal zu liefern.
  2. Entfernen Sie die Rattenwelpen am postnatalen Tag 5 aus dem Käfig.
  3. Anästhetisieren Sie die Rattenwelpen mit Gasanästhesie (d.h. 2% Isofluran) in einer Anästhesiekammer.
  4. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie, indem Sie Atmung und Reflexe überprüfen.
    HINWEIS: Die Atmung sollte flach werden und die Reflexe sollten abnehmen. Rattenwelpen bleiben mit dieser Isofluran-Konzentration mindestens 10 min unbewusst.

3. Intratracheale Instillation

  1. Nach der Beägung die Rattenwelpen auf einem intubationsständer von 60° anwinkelt zurückhalten und Welpen mit Labor-Etikettierungsband an allen vier Gliedmaßen an Ort und Stelle halten.
  2. Tragen Sie Klebeband unter der Nase auf, um den Kopf zu fixieren und den Hals für punktionstracheotomie zu lokalisieren.
  3. Desinfizieren Sie den Schnittbereich (d.h. Hals) mit einem 75% Alkohol-Prep-Pad.
  4. Machen Sie einen 0,3 cm vertikalen Mittellinienausschnitt über der Luftröhre mit Mikroschere, um eine Beschädigung der Karotisarterien zu vermeiden.
  5. Sezieren Sie die Fett- und Muskelschichten weg, um die Luftröhre mit gekrümmter Spitze verjüngte Pinzette ohne Haken zu lokalisieren.
  6. Halten Sie die Luftröhre mit der gekrümmten Spitze verjüngte Pinzette.
  7. Halten Sie eine 100-L-Spritze aufrecht und injizieren Sie während der Inspiratorei-Phase langsam 30 l normaler Saline (d. h. Kontrolle) oder 30 l Fluc-GFP-markierte MSCs (1 x 105 Zellen) in die Luftröhre.
  8. Schließen Sie den Schnitt mit einem 6-0 Seidenstich, binden Sie den Knoten so klein wie möglich und schneiden Sie die Enden so kurz wie möglich.
  9. Stellen Sie die Ratten unter Infrarotlicht oder auf ein Heizkissen, um warm zu halten und sie von der Anästhesie erholen zu lassen.
  10. Bestätigen Sie, dass die Ratten warm, rosa und in der Lage sind, sich spontan zu bewegen, bevor sie die Ratten in den Käfig zurückbringen.

4. Überwachung der Lungenverteilung von MsCs

  1. Um die transplantierten menschlichen MSCs zu verfolgen, injizieren sie die Ratten intraperitoneal mit Luziferin-Kaliumsalz in Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Dosis von 125 mg/kg Körpergewicht 15 min nach MSC-Injektion.
  2. Anästhesisieren Sie die Ratten mit 2% Isofluran durch Nasenkegel.
  3. Erfassen Sie sequenzielle Bilder in 5-15 s Intervallen 10 min nach der Luciferin-Verabreichung mit mittlerem Binning, 1 f/stop und einem 26 cm Sichtfeld mit einem Kleintier-Bildgebungssystem(Tabelle der Materialien).
  4. Quantifizieren Sie die Lumineszenzaktivität aus der Lunge basierend auf den automatischen Regionen von Interesse mit Bildgebungssoftware (Tabelle der Materialien)17.

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Ergebnisse

Die pulmonale Verteilung der intratrachealen Instillation von Stammzellen im Begriff neonatale Ratten wurde durch Gunfly-Luziferase (Fluc)-markierte Stammzellen bestimmt. MSCs wurden mit Fluc gekennzeichnet und durch lentivirale Transduktion mit grünem fluoreszierendem Protein markiert. Abbildung 1A zeigt einen hohen GFP-Ausdruck in menschlichen MSCs, und 93,7 % der Bevölkerung zeigten eine GFP-positive Expression, die durch Durchflusszytometrie erkannt wurde. MSCs waren gekennzeichnet durch...

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Diskussion

Neugeborene mit Atemnot benötigen häufig intratracheales Tensid und/oder Kortikosteroidbehandlung19. Klinische Studien der Phase I der menschlichen Phase i haben die8Sicherheit von intratrachealen MSCs bei Frühgeborenen 8 gezeigt. Diese Studien deuten darauf hin, dass die intratracheale Verabreichung von Medikamenten eine wichtige Option für Neugeborene mit Atemnot ist. Tiermodellstudien sind am hilfreichsten, wenn die Modellfunktionen direkt für den...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Studie wurde teilweise durch ein Stipendium der Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-0 SeideEthicon1916G
Alkohol Vorbereitung PadCSD3032
BD Stemflow hMSC AnalysekitBD Biosciences562245CD Marker
CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivektor für In Vivo ImagingSBIBLIV511PA-1
CryoStor10BioLife Solutions640222
Humane MSCsMeridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan
InfrarotlichtJING SHANGJS300T
IsofluranHalogenkohlenstoff26675-46-7
IVIS-200 Kleintier-BildgebungssystemCaliper LifeSciences, Hopkinton, MA
Luciferin-KaliumsalzPromega, Madison, WI
Mikroschere, geradeVannasH4240
Normale KochsalzlösungTAIWAN BIOTECH CO., LTD.113531Isotonische Natriumchloridlösung
RN-Nadel mit kleiner Nabe, 30 GaugeHamilton Company, Reno, NV7799-06
Spritze (100 & Mikro; l)Hamilton Company, Reno, NV81065
Xenogen Living Image 2.5 SoftwareCaliper LifeSciences, Hopkinton, MAN/A

Referenzen

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