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Methodenartikel

Rekonstruktion von einzelligen angeborenen Fluoreszenzsignaturen durch konfokale Mikroskopie

2.3K Ansichten

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DOI:

10.3791/61120

⸱

27. Mai 2020

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 3Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur optischen Extraktion und Katalogisierung angeborener zellulärer Fluoreszenzsignaturen (d.h. zelluläre Autofluoreszenz) aus jeder einzelnen lebenden Zelle vorgestellt, die in einem dreidimensionalen Raum verteilt ist. Diese Methode eignet sich, um die angeborene Fluoreszenzsignatur verschiedener biologischer Systeme mit einzelliger Auflösung zu untersuchen, einschließlich Zellen von Bakterien, Pilzen, Hefen, Pflanzen und Tieren.

Zusammenfassung

Beschrieben wird hier die konfokale Reflexionsmikroskopie-assistierte Einzelzell-Angeborenenfluoreszenzanalyse (CRIF), eine minimal-invasive Methode zur Rekonstruktion der angeborenen zellulären Fluoreszenzsignatur jeder einzelnen lebenden Zelle in einer Population, die in einem dreidimensionalen (3D) Raum verteilt ist. Die angeborene Fluoreszenzsignatur einer Zelle ist eine Sammlung von Fluoreszenzsignalen, die von verschiedenen Biomolekülen innerhalb der Zelle emittiert werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass angeborene Fluoreszenzsignaturen verschiedene zelluläre Eigenschaften und Unterschiede im physiologischen Status widerspiegeln und eine reichhaltige Informationsquelle für die Zellcharakterisierung und -identifizierung darstellen. Angeborene Fluoreszenzsignaturen wurden traditionell auf Populationsebene analysiert, was eine klonale Kultur erforderte, aber nicht auf Einzelzellebene. CRIF eignet sich besonders für Studien, die eine 3D-Auflösung und/oder selektive Extraktion von Fluoreszenzsignalen einzelner Zellen erfordern. Da die Fluoreszenzsignatur eine angeborene Eigenschaft einer Zelle ist, eignet sich CRIF auch zur tagfreien Vorhersage des Typs und/oder physiologischen Status intakter und einzelner Zellen. Diese Methode kann ein leistungsfähiges Werkzeug für die optimierte Zellanalyse sein, bei der der Phänotyp jeder einzelnen Zelle in einer heterogenen Population direkt durch ihre Autofluoreszenzsignatur unter einem Mikroskop ohne Zellmarkierung beurteilt werden kann.

Einleitung

Verschiedene Biomoleküle innerhalb einer Zelle1 emittieren Autofluoreszenzsignale, und die angeborene Fluoreszenzsignatur einer Zelle besteht aus der Anordnung dieser Signale. Diese charakteristische Fluoreszenz spiegelt verschiedene zelluläre Eigenschaften und auch Unterschiede im physiologischen Status wider. Die Analyse der angeborenen Fluoreszenz ist minimal-invasiv und kann traditionelle, invasivere mikrobiologische Sonden ergänzen, die eine Reihe von Spuren von leichter metabolischer Modifikation bis hin zur vollständigen Zellzerstörung hinterlassen. Während traditionelle Techniken wie die Extraktion von DNA- oder Zellinhalten2,3, die fluoreszierende In-situ-Hybridisierung4 und die Einführung fluoreszierender Reportergene in das Genom bei der Bestimmung des Zelltyps oder des physiologischen Status wirksam sind, erfordern sie in der Regel entweder eine Manipulation der Zellen oder eine invasive Markierung.

Studien zur angeborenen Fluoreszenz verschiedener lebender und intakter mikrobieller Kolonien, einschließlich mikrobieller Kultursuspensionen5,6, aktiver Schlämme7, Säugetiergewebe8,9 und Säugetierzellen1,10, haben gezeigt, dass die angeborene Fluoreszenzanalyse eine tagfreie Analyse von Zelltypen und physiologischem Status erleichtert. Angeborene Fluoreszenzsignaturen wurden traditionell auf Populationsebene und nicht auf Einzelzellebene analysiert und erfordern daher eine klonale Kultur. Im Gegensatz dazu rekonstruiert und katalogisiert die hier beschriebene confokale Reflection microscopy-assisted single cell innate fluorescence analysis (CRIF)-Technik11 die angeborene zelluläre Fluoreszenzsignatur jeder einzelnen lebenden mikrobiellen Zelle. Darüber hinaus kann CRIF systematisch die angeborene Fluoreszenzsignatur einer einzelnen mikrobiellen Zelle innerhalb einer Population sammeln, die in einem dreidimensionalen (3D) Raum verteilt ist.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Probe

  1. Legen Sie eine 1 mm dicke Silikondichtung mit Vertiefungen auf einen Glasobjektträger.
  2. Legen Sie eine 1 mm dicke 0,8% (w/v) Agaroseplatte in die Vertiefung der Silikondichtung.
  3. Verdünnen Sie die Zelldichte einer beliebigen mikrobiellen Zellkultur auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD660) = 1,0.
  4. Geben Sie eine 5 μL Aliquot Zellsuspension auf die Agaroseplatte.
  5. Vorsichtig mit einem Glasdeckglas abdecken.

2. Aufbau eines Mikroskops

HINWEIS: Die CRIF-Technik kombiniert konfokale Reflexionsmikroskopie (CRM) und konfokale Mehrkanal-Mikrospektroskopie. CRM dient als Informationsquelle für die zelluläre Morphologie und räumliche Lokalisierung, die unabhängig von der zellulären angeborenen Fluoreszenz ist. Die konfokale Mehrkanal-Mikrospektroskopie liefert die spektrale Information der zellulären angeborenen Fluoreszenz. Im folgenden Protokoll wird jedes Bild, das mit CRM oder konfokaler Fluoreszenz-Mikrospektroskopie aufgenommen wurde, als CRM-Bild bzw. Mehrkanal-Konfokal-Mikrospektroskopie-Bild bezeichnet.

  1. Schließen Sie ein konfokales Mikroskop mit abgestorbenen Spektralkanälen an eine Photomultiplierröhre (PMT) oder einen GaAsP-Detektor an.
    HINWEIS: Diese Setups sind von mehreren Herstellern erhältlich.
  2. Statten Sie das Mikroskop mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) mit ausreichender Vergrößerung aus.
    HINWEIS: Für die Analyse von Bakterienzellen wird ein 63-faches Objektiv mit NA > 1,4 empfohlen.
  3. Statten Sie das Mikroskop mit einem Halbreflexionsspiegel (z. B. NT 80/20) aus, um CRM aufzunehmen, das auf der zellulären Streuung des einfallenden Lichts beruht, um die Zellmorphologie zu visualisieren.
  4. Für die konfokale Mehrkanal-Mikrospektroskopie ist das Mikroskop mit dichroitischen Spiegeln auszustatten. Verwenden Sie beispielsweise MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 oder MBS 488/543/633 für 405, 458, 488, 514, 543 bzw. 633 nm Anregung.
  5. Stellen Sie die Beleuchtungsstärke für jede Anregungswellenlänge mit einem Laserleistungsmesser ein. Halten Sie die Leistung unter dem Mikroskop durch Anregungswellenlängen konstant (z. B. verwenden Sie 50 μW mit dem 63-fachen Objektiv).

3. Bildaufnahme

  1. Stellen Sie die Lochgröße mit der Mikroskopsoftware auf 1 AE ein.
  2. Stellen Sie die Pixelverweilzeit (d. h. die Scangeschwindigkeit) für jede Anregungswellenlänge ein.
    HINWEIS: Eine zu lange Pixelverweildauer kann Zellen schädigen. Vermeiden Sie übermäßig lange Pixelverweilzeiten, um Fotoschäden an den Zellen zu minimieren. Für Bakterienproben ist normalerweise eine Pixelverweilzeit <55,6 μs/μm2 (wenn die Bestrahlungsstärke unter dem Mikroskop ~17 μW/cm2 beträgt) geeignet, um eine Wachstumshemmung zu vermeiden. Dieser Parameter kann je nach Organismus und Versuchsaufbau variieren.
  3. Legen Sie die Scanauflösung fest. Verwenden Sie für kleine Zellen wie Bakterien eine Scanfläche von 1.024 x 1.024.
  4. Stellen Sie den Z-Scanbereich so ein, dass der gewünschte Bereich abgedeckt ist.
    HINWEIS: Für Bakterien- und Hefezellproben, die auf einer Agaroseplatte verteilt sind, ist in der Regel ein Z-Scanning-Bereich von ~15 μm ausreichend.
  5. Stellen Sie den entstaubten Detektor so ein, dass er den sichtbaren Wellenlängenbereich erfasst (z. B. 416−691 nm). Verwenden Sie ein Spektralfenster von 8−10 nm.
  6. Erfassen Sie mehrkanalige konfokale Mikrospektroskopiebilder in einer Sequenz von der längsten bis zur kürzesten Anregungswellenlänge, um Z-Stacks von Fluoreszenzbildern zu erzeugen.
  7. Erfassen Sie CRM-Bilder.
  8. Speichern Sie die aufgenommenen Bilder als 16-Bit-TIFF-Dateien in einem Verzeichnis. Benennen Sie die Dateien mit der Namenskonvention XXXcYYzZZ.tif, wobei XXX die Anregungswellenlänge, YY die Detektorkanalnummer, ZZ die Z-Slice-Nummer und "c" und "z" Präfixe für die Detektornummer bzw. die Z-Slice-Nummer sind.
    1. Wenn beispielsweise ein konfokales Mehrkanal-Mikrospektroskopiebild mit einer Anregungswellenlänge von 405 nm, dem 1. Detektorkanal des Detektorarrays, aufgenommen wird und der 5. Schnitt des Z-Stacks ist, nennen Sie ihn "405c01z05.tif". Verwenden Sie für CRM-Bilder die Zeichenfolge "CRM" anstelle von XXX (z. B. "CRMc01z05.tif").
      HINWEIS: Entscheiden Sie, ob die 2D- oder 3D-Segmentierung für die Bilddaten am besten geeignet ist. Verwenden Sie eine 2D-Segmentierungsmethode in Situationen, in denen kleine Zellen auf eine 2D-Ebene beschränkt sind (z. B. Bakterienpopulation, die an einer Glasoberfläche haftet). Verwenden Sie die 3D-Segmentierungsmethode in Situationen, in denen die Zellpopulation in einem dreidimensionalen Raum verteilt ist (z. B. Biofilme und Gewebeproben) oder die Zellgrößen größer sind als die Dicke der optischen Scheibe (z. B. Hefezellen, Säugetierzellen). Informationen zur 2D-Segmentierung finden Sie in Abschnitt 4. Informationen zur 3D-Segmentierung finden Sie in Abschnitt 5.

4. 2D-Bildanalyse

  1. Statten Sie einen Arbeitsplatz mit Bildanalysesoftware (z. B. MATLAB) aus.
  2. Führen Sie eine Zellsegmentierung und Rekonstruktion von einzelligen angeborenen Fluoreszenzsignaturen durch.
    1. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software.
    2. Doppelklicken sie und öffnen Sie eines der bereitgestellten Skripte "Script2D.m".
    3. Wechseln Sie zur Registerkarte Editor , und klicken Sie dann auf Ausführen. Ein Ordnerauswahlfenster sollte angezeigt werden.
    4. Wählen Sie das in Schritt 3.8 erstellte Verzeichnis aus und klicken Sie dann auf Öffnen , um fortzufahren. Ein Dialogfeld, in dem Sie zur Eingabe des Segmentierungsparameters aufgefordert werden, wird automatisch angezeigt.
      HINWEIS: Wählen Sie zu Testzwecken den bereitgestellten Datensatz aus ("Sample_2D"). Das Beispiel-Dataset wird als komprimierte Datei bereitgestellt und sollte im Voraus extrahiert werden.
    5. Geben Sie die Segmentierungsparameter ein: Schwellenwert der Bildbinarisierung (0−1) für die Bildbinarisierung = 0,45, Oberer Schwellenwert für einen Zellbereich (in Pixeln) = 200, Unterer Schwellenwert für einen Zellbereich (in Pixeln) = 10 und Anzahl der Detektoren = 32. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
      HINWEIS: Diese Parameter müssen je nach Bildqualität möglicherweise angepasst werden.
    6. Ein neues Bildfenster mit einem CRM-Bild sollte angezeigt werden. Wählen Sie einen beliebigen Hintergrundbereich (d. h. einen Bereich, in dem Zellen fehlen) aus, der für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden soll. Zeichnen Sie ein Rechteck innerhalb des CRM-Bildes durch Ziehen mit der Maus. Doppelklicken Sie innerhalb des ausgewählten Bereichs, um die Auswahl zu bestätigen.
    7. Suchen Sie ein neues Verzeichnis mit dem Namen Signatur in demselben Verzeichnis, das in Schritt 4.2.4 ausgewählt wurde.
      HINWEIS: Der bereitgestellte Code erstellt dieses Verzeichnis automatisch. Das Verzeichnis "Signatur" speichert die angeborene Fluoreszenzsignatur jeder mikrobiellen Zelle innerhalb einer Population als .png Dateien, die nach einem gemeinsamen Präfix "Signatur" fortlaufend nummeriert sind.

5.3D Bildanalyse

  1. Statten Sie einen Arbeitsplatz mit der Bildanalysesoftware (Table of Materials) aus.
  2. Führen Sie eine Zellsegmentierung und Rekonstruktion von einzelligen angeborenen Fluoreszenzsignaturen durch.
    1. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software.
    2. Doppelklicken Sie auf das bereitgestellte Skript "Script3D.m" und öffnen Sie es.
    3. Wechseln Sie zur Registerkarte Editor , und klicken Sie dann auf Ausführen. Ein Ordnerauswahlfenster sollte angezeigt werden.
    4. Wählen Sie das in Schritt 3.8 erstellte Verzeichnis aus und klicken Sie dann auf Öffnen , um fortzufahren. Ein Dialogfeld, das zur Eingabe der Segmentierungsparameter auffordert, wird automatisch angezeigt.
      HINWEIS: Wählen Sie zu Testzwecken den bereitgestellten Datensatz aus ("Sample_3D"). Das Beispiel-Dataset wird als komprimierte Datei bereitgestellt und sollte im Voraus extrahiert werden.
    5. Geben Sie die Segmentierungsparameter ein: Schwellenwert für die Bildbinarisation (0–1) für die Bildbinarisierung = 0,01, Oberer Schwellenwert für ein Zellenvolumen (in Pixeln) = 1.000, Unterer Schwellenwert für einen Zellbereich (in Pixeln) = 20, X-Pixelgröße [μm/Pixel] = 0,26, Y-Pixelgröße [μm/Pixel] = 0,26, Z-Pixelgröße [μm/Pixel] = 0,42 und Anzahl der Detektoren = 32. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren. Ein Dialogfeld, in dem Sie aufgefordert werden, die Anzahl der Anregungswellenlängen einzugeben, wird angezeigt.
      HINWEIS: Diese Parameter müssen je nach Bildqualität möglicherweise angepasst werden.
    6. Geben Sie die Anzahl der Wellenlängen ein, die für die Bildaufnahme verwendet werden (wenn z. B. 405, 488, 561, 630 verwendet werden, geben Sie 4 in das Dialogfeld ein). Klicken Sie auf OK.
    7. Geben Sie die Anregungswellenlängen in einer Reihenfolge von der kürzesten (d. h. Feldname: Anregung Nr. 1) bis zur längsten Wellenlänge in die Dialogfelder ein. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren. Ein neues Image-Fenster, das ein CRM-Image anzeigt, sollte angezeigt werden.
    8. Wählen Sie den beliebigen Hintergrundbereich (d. h. den Bereich, in dem Zellen fehlen) aus, der für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden soll. Zeichnen Sie ein Rechteck innerhalb des CRM-Bildes durch Ziehen mit der Maus. Doppelklicken Sie innerhalb des ausgewählten Bereichs, um die Auswahl zu bestätigen.
    9. Suchen Sie das Verzeichnis Signatur in dem in Schritt 5.2.4 ausgewählten Verzeichnis.
      HINWEIS: Der bereitgestellte Code erstellt dieses Verzeichnis automatisch. Das Verzeichnis "Signatur" speichert die angeborene Fluoreszenzsignatur jeder einzelnen mikrobiellen Zelle innerhalb einer Population als .png Dateien, die nach einem gemeinsamen Präfix "Signatur" fortlaufend nummeriert sind.

6. Statistische Auswertung

HINWEIS: Führen Sie dimensionale Reduktionstechniken (z. B. Hauptkomponentenanalyse [PCA]) durch, um die Verteilung der Hyperspektren der Zellpopulationen zu visualisieren. Das bereitgestellte Skript (PCA.py) führt PCA für zwei Zellpopulationen (d. h. zwei Klassen) aus.

  1. Statten Sie einen Arbeitsplatz mit der Programmiersprache und den dazugehörigen Bibliotheken und Modulen aus (Tabelle der Materialien).
  2. Erstellen Sie ein leeres Verzeichnis im Laufwerk C (oder einem gleichwertigen Laufwerk) und nennen Sie das Verzeichnis "Parent_directory" (d. h. C:/ Parent_ Verzeichnis).
  3. Speichern Sie die Fluoreszenzsignaturen (z. B. die in Schritt 4.2.7 generierten .png Dateien) jeder der beiden Zellpopulationen in zwei separaten Verzeichnissen.
    HINWEIS: Die beiden Verzeichnisse sollten sich beide im "Parent_directory" befinden.

    C:/Parent_directory/
    figure-protocol-1putidaKT2440/
    figure-protocol-2 figure-protocol-3Signatur01.png
    figure-protocol-4 figure-protocol-5Signatur02.png
    figure-protocol-6 figure-protocol-7:
    figure-protocol-8putidaKT2442/
     figure-protocol-9Signatur01.png
     figure-protocol-10Signatur02.png
     figure-protocol-11:
  4. Laden Sie PCA.py in die "Parent_directory" herunter.
  5. Öffnen Sie die Befehlszeilenschnittstelle der Arbeitsstation.
  6. Geben Sie "python C:/Parent_directory/PCA.py" in die Befehlszeilenschnittstelle ein.
  7. Wählen Sie "Parent_directory", nachdem die Meldung "Zielverzeichnis auswählen" angezeigt wird.
  8. Suchen Sie im "C:/Parent_directory" nach "PCA.png", das einen resultierenden PCA-Plot enthält.

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Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt die typische einzellige Fluoreszenzsignatur einer Bakterienzelle, dargestellt als traditionelles Spektrumdiagramm (oben) und als Heatmap (Mitte). Abbildung 1B zeigt das Ergebnis einer genauen 2D-Zellsegmentierung, die dem ursprünglichen CRM-Bild einer Population von Bodenbakterien (Pseudomonas putida KT2440)12 überlagert wird. Die resultierenden angeborenen Fluoreszenzsignaturen für die Population sind in

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Diskussion

Es gibt zwei kritische Punkte in dieser Methode, die genau verfolgt werden müssen, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten: 1) Halten Sie die Laserleistung unter dem Mikroskopobjektiv durch Anregungswellenlängen und Experimente konsistent und 2) führen Sie eine genaue Zellsegmentierung durch.

Der erste Punkt ist besonders wichtig, wenn man die angeborene Fluoreszenzsignatur zwischen verschiedenen Experimenten vergleicht. Vermeiden Sie es, einfach die gleichen "prozentualen Ausgangseinstellun...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Diese Studie wurde zum Teil durch einen Zuschuss für die wissenschaftliche Forschung des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport und Technologie (18K04843) an Y. Yawata, den JST ERATO (JPMJER1502) an N. Nomura unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseWako Chemicals312-01193
StrahlteilerCarl Zeiss, NikonMBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 oder MBS 488/543/633 Strahlteiler (Carl Zeiss)
KonfokalmikroskopCarl Zeiss, NikonModell LSM 880 (Carl Zeiss), Modell A1R (Nikon)
DeckgläserMatsunami GlassC024601
ObjektträgerMatsunami GlasS011120
HalbreflexionsspiegelCarl Zeiss, NikonNT80/20
LaserleistungsmesserThorlabsPM400 (Leistungsmesspult) und S175C (Sensor)
LB BrothNacalai tesque20066-95Für Bakterienkulturen
BildanalysesoftwareThe MathWorksMATLAB Version 2019a oder höher, Image Processing Toolbox wird benötigt
MikroskopobjektivCarl Zeiss, Nikon440762-9904z.B. 63x Plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)
MikroskopsoftwareCarl Zeiss, NikonZEN (Carl Zeiss),NIS-Elemente (Nikon)
PBS(-)Wako Chemicals166-23555
ProgrammiersprachePython und Bibliotheken, Module (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) werden benötigt, um das mitgelieferte PCA-Skript auszuführen.
SilikondichtungThermoFisher ScientificP24744
WorkstationEmpfehlenswert ist eine Hochleistungs-Workstation mit diskreten GPUs.
Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) AgarMedium Sigma-AldrichY1500-250GFür Hefekulturen
YPD MediumSigma-AldrichY1375-250G

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

EinzelzellanalyseSpektralbildgebungFluoreszenzsignaturZellsegmentierungHauptkomponentenanalyseZ Stack Akquisemarkierungsfreie Ph notypisierungmikrobielle Population
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