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Methodenartikel

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

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DOI:

10.3791/61138

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10. Juni 2020

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1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

CENP-A-Ubiquitylierung ist eine wichtige Voraussetzung für die CENP-A-Ablagerung am Zentromer, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist. Hier beschreiben wir die Analyse der Massenspektrometrie, um die Ubiquitylierung des MIT EYFP markierten CENP-A-Proteins (EYFP-CENP-A) zu identifizieren.

Zusammenfassung

Die Untersuchung der Struktur und Dynamik von Kinetochoren und Zentromern ist wichtig für das Verständnis der chromosomalen Instabilität (CIN) und der Krebsprogression. Wie die chromosomale Lage und Funktion eines Zentrimeros (d.h. die Zentromeridentität) bestimmt werden und an einer genauen Chromosomensegregation beteiligt sind, ist eine grundlegende Frage. CENP-A wird als Nicht-DNA-Indikator (epigenetische Simerung) der Zentromeridentität vorgeschlagen, und CENP-A-Ubiquitylierung ist für die CENP-A-Abscheidung am Zentromer erforderlich, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist.

Hier beschreiben wir die Massenspektrometrie-Analyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass die Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin aufgrund der EYFP-Tagging im CENP-A K124R mutierten Protein induziert wird. Lysin 306 (K306) Ubiquitylierung in EYFP-CENP-A K124R wurde erfolgreich identifiziert, was Lysin 56 (K56) in CENP-A durch Massenspektrometrieanalyse entspricht. Ein Vorbehalt wird bei der Verwendung von GFP/EYFP oder der Kennzeichnung von hochmolekularem Protein als Werkzeug zur Analyse der Funktion eines Proteins diskutiert. Aktuelle technische Grenzwerte werden auch für den Nachweis von ubiquitylierten Bändern, die Identifizierung von standortspezifischer Ubiquitylierung(n) und die Visualisierung der Ubiquitylierung in lebenden Zellen oder einer bestimmten Einzelzelle während des gesamten Zellzyklus diskutiert.

Die hier vorgestellte Methode der Massenspektrometrieanalyse kann auf humanes CENP-A-Protein mit verschiedenen Tags und anderen Zentromer-Kinetochor-Proteinen angewendet werden. Diese kombinatorischen Methoden, die aus mehreren Assays/Analysen bestehen, könnten Forschern empfohlen werden, die daran interessiert sind, funktionelle Rollen der Ubiquitylierung zu identifizieren.

Einleitung

In den meisten Eukaryoten müssen Spindelmikrotubuli an einer einzigen Region jedes Chromosoms, die als Zentromer bezeichnet wird, befestigt werden. Der Kinetochor ist ein Komplex von Proteinen, die sich am Zentromer befinden. Die Untersuchung des Timings der Bewegungen von Zentromer und Kinetochorei und der Struktur von Kinetochoren und Zentromeren ist wichtig für das Verständnis der Chromosomeninstabilität (CIN) und der Krebsprogression. Die wichtigsten Fragen sind, wie die chromosomale Lage und Funktion eines Zentrimers (d.h. die Zentromeridentität) bestimmt wird und wie sie an der genauen Chromosomensegregation beteiligt sind. Bei den meisten Arten definiert das Vorhandensein eines speziellen Nukleosoms, das ein spezifisches Histon-ähnliches Protein namens CENP-A enthält, die Zentromeridentität. Daher wird vorgeschlagen, dass CENP-A der Nicht-DNA-Indikator (epigenetische Markierung) der Zentrimeridentität ist. Es ist wichtig, den Mechanismus zu klären, wie CENP-A die Zentromeridentität beim Menschen definiert.

Das Holliday Junction Recognition Protein (HJURP) ist der CENP-A-spezifische Chaperon, der CENP-A in zentromere Nukleosomen1,2,3ablagert. Wir haben bereits berichtet, dass die CUL4A-RBX1-COPS8 E3 Ligase für die CENP-A-Ubiquitylierung auf Lysin 124 (K124) und Zentromerlokalisierung4erforderlich ist. Außerdem zeigten unsere Ergebnisse, dass die Zentromerrekrutierung von neu synthetisiertem CENP-A bereits bestehende, ubiquitylierte CENP-A5erfordert. So wurde ein Modell zur Verfügung gestellt, das darauf hindeutet, dass die CENP-A-Ubiquitylierung durch Dimerisierung zwischen Zellteilungen vererbt wird.

Im Gegensatz zu unseren Erkenntnissen und denen von Yu et al. wurden kürzlich negative Ergebnisse in Bezug auf das CENP-A und seine zentromere Lokalisierung veröffentlicht6. Der Artikel behauptete, dass CENP-A-Modifikationen an Lysin 124 (K124) für die Etablierung, Wartung und Langzeitfunktion menschlicher Zentromere entbehrlich sind, basierend auf ihren negativen Ergebnissen, die zeigen, dass die Mutation von K124R weder die CENP-A-Zentromer-Lokalisierungnoch dieZelllebensfähigkeit beeinflusst eklaten. In ihren Ergebnissen und Schlussfolgerungen gibt es jedoch genügend Raum für Debatten, und wir haben bereits in ihrer vorherigen Veröffentlichung7beschrieben, welches Problem es geben könnte. Es sollte darauf geachtet werden, dass sie Proteine mit CENP-A verschmolzen, die viel größere Molekulargewichte haben als die Größe des endogenen CENP-A: Z.B. verschmolzen sie 30 kDa verbessertes gelbes Fluoreszenzprotein (EYFP) zu 16 kDa CENP-A und analysierte EYFP-CENP-A K124R-Fusionsprotein in ihrem RPE-1 CENP-A-/F-Knockout-System.-/F Es wird nicht erwartet, dass K124-Ubiquitin direkt an HJURP auf der Grundlage struktureller Vorhersagen4bindet, jedoch wird die Zugabe von Mono-Ubiquitin einen Einfluss auf die Proteinkonformation von CENP-A haben. Das Protein der CENP-A-Konformation kann durch das Vorhandensein eines großen Fusionsproteins verändert werden, und diese Konformationsänderung kann die strukturellen Veränderungen verschleiern, die durch den Verlust der Ubiquitylierung verursacht werden. Wir schlagen vor, dass die Fusion von großformatigem Protein eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin als K124 in EYFP-CENP-A K124R Mutant induziert und diese Ubiquitylierung an einem anderen Standort den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp hemmt/maskiert. Beweise dafür, dass Ubiquitylierung bei unterschiedlichem Lysin im CENP-A K124R-Mutantenprotein mit einem großen Tag-Protein (EYFP) auftritt, wurde in unserer vorherigen Publikation8berichtet. Es wurde festgestellt, dass EYFP-Tagging eine Ubiquitination einer anderen Lysin-Site von EYFP-CENP-A K124R induziert und dass EYFP-CENP-A K124R Mutant an HJURP bindet. Infolgedessen hemmt/maskiert diese Ubiquitylierung an einem anderen Standort den ursprünglichen K124R-Einzelmutanten-Phänotyp, und sowohl EYFP-CENP-A WT als auch K124R-Mutationzeigten zeigten zentrominische Lokalisation (wir verwendeten und verglichen pBabe-EYFP-CENP-A WT und K124R Mutant, zusammen mit pBabe-EYFP-Steuerung). Die Ergebnisse zeigten, dass mit Flaggen markierte oder nicht markierte CENP-A K124R-Mutationen tödlich sind, aber durch eine Monoubiquitin-Fusion gerettet werden können, was darauf hindeutet, dass Die CENP-A-Ubiquitylierung für die Zelllebensfähigkeit unerlässlich ist.

In den letzten Jahren haben viele Studien verschiedene Assays entwickelt, um posttranslationale Modifikationen (PTMs) von CENP-A-Proteinen und anderen Zentromer-Kinetochor-Proteinen sowohl in vivo als auch in vitro9,10,11zu identifizieren. Analog zu den PTMs von Histonproteinen, die ein wichtiger Mechanismus zur Regulierung der Funktion von Chromatin sind, sind PTMs von zentromerem Chromatin-Komponenten auch an einem wesentlichen Mechanismus zur Regulierung der Gesamtstruktur und Funktion von Zentromeren beteiligt. Die meisten CENP-A PTM-Standorte sind spezifisch für CENP-A-haltige Nukleosomen, obwohl einige von ihnen in Histon H3 konserviert werden, was darauf hindeutet, dass eine Modifikation dieser Rückstände zur zentrominspezifischen Funktion beiträgt. PTMs von CENP-A einschließlich Phosphorylierung, Acetylierung, Methylierung und Ubiquitylierung wurden zuvor9berichtet, was darauf hindeutet, dass CENP-A einer Vielzahl von PTMs und ihren kombinatorischen Arrays auf seiner Amino-Terminus- und C-Terminus-Histon-Domäne unterworfen ist. Die Bedeutung von CENP-A Modifikationen in mehreren Funktionen wurde von vielen Gruppen, einschließlich unserer, deutlich. Diese Funktionen umfassen CENP-A-Ablagerungen an Zentromeren, Proteinstabilität und Rekrutierung des CCAN (konstitutives Zentromer-assoziiertes Netzwerk)9. Allerdings werden begrenzte Studien und Ergebnisse von CENP-A PTMs vorgeformt, wenn Vergleiche mit einem kanonischen Histon enden, die ihre Funktion direkt oder indirekt regulieren. Technische Berichte, die sich auf die Methodik zur Identifizierung dieser CENP-A-PTMs konzentrieren, sind ebenfalls begrenzt.

Da CENP-A-Ubiquitylierung für die CENP-A-Abscheidung am Zentromer12erforderlich ist, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung5vererbt wird und für die Zelllebensfähigkeit8unverzichtbar ist, wäre die Methode zur Identifizierung der CENP-A-Ubiquitylierung in Zukunft unerlässlich, um die funktionelle Aktivität, Positionierung und Struktur des Zentromers zu untersuchen. Daher beschreiben wir hier die Massenspektrometrieanalyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass das EYFP-Tagging eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin im CENP-A K124R Mutant protein8induziert. Protokolle anderer Kontrolltests und -analysen (Immunfluoreszenzanalyse, Kolonie-Auswuchs-Assay und In-vivo-Ubiquitylierungstest) werden ebenfalls vorgestellt, um die Ergebnisse der großen Massenspektrometrie-Analyse richtig zu diskutieren.

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Protokoll

1. Zellkultur und Retrovirus-Transfektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten

HINWEIS: EYFP-CENP-A wird aus pBabe-EYFP-CENP-A in einem ähnlichen Proteingehalt wie endogene CENP-A ausgedrückt. Das gesamte zelluläre CENP-A-Protein wird nach der Störung des CENP-A-/F-Allels durch Cre-Rekombiinase wie in den RPE-1 CENP-A-/- Zellen6durch dieses EYFP-CENP-A ersetzt.-/F

  1. Herstellung des überdeuchenen Überstandes mit Retrovirus mit 293T Verpackungszellen.
    1. Tag 0: 293T Verpackungszellen auf der 6-Well-Kulturplatte (1,0 x 106 Zellen/Brunnen) verteilen. Kulturzellen in glukosereichem DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 24 h.
      ANMERKUNG: Für optimale Ergebnisse bestimmen Sie empirisch die Zelldichte, die bei der Aussaat verwendet werden soll.
    2. Tag 1: Vorbereiten der Transfektionsreaktion um 23 h nach dem Ausbreiten (24 h Punkt ist 0 h Punkt der Transfektion). Transfektionsexpression Plasmid jedes pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) und pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (siehe Tabelle 1).
    3. Wählen Sie eine Kombination von Hilfs-/Verpackungsplasmiden aus, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, und fügen Sie sie den Röhrchen hinzu, die eines der oben aufgeführten Plasmide enthalten. Es gibt meistens diese 3 Kombinationen für Helfer/Verpackungsplasmide (Tabelle 2). Jede Kombination funktionierte in diesen Experimenten und zeigte eine ähnliche Transfektionseffizienz.
    4. Bereiten Sie 50 l reduziertes Serummedium vor und mischen Sie jeweils 2,0 g pBabe-EYFP (B3182), pBabe-EYFP-CENP-A WT (B3161) und pBabe-EYFP-CENP-A K124R (B3164) (siehe Tabelle 1) und fügen eine Kombination von Hilfs-/Verpackungsplasmiden hinzu, die in Tabelle 2 aufgeführt sind (siehe unten). Inkubieren Sie diese Mischung bei Raumtemperatur für 5 min. Diese Mischung ist Lösung A.
    5. Bereiten Sie weitere 50 l reduziertes Serummedium vor und mischen Sie 1,5 l Transfektionsreagenzien I bzw. II(Materialtabelle). Inkubieren Sie diese Mischung bei Raumtemperatur für 5 min. Diese Mischung ist Lösung B.
      HINWEIS: Optional nur 6,0 l Transfektionsreagenz III (Polyethylenimin [PEI]; 1,0 mg/ml) in Lösung B hinzufügen oder zusätzlich zu den Transfektionsreagenzien I und II in Lösung B(Materialtabelle)6,0 l Transfektionsreagenz III hinzufügen.
    6. Mischen Sie die Lösungen A und B zusammen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 min.
    7. Nachdem Sie die kultivierten Zellen einmal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie die Mischung der Lösungen A und B (d.h. DNA-Lipid-Komplex) direkt zu jedem Brunnen der 6-Well-Kulturplatte hinzu, die 500 l reduziertes Serummedium hat. Die Endkonzentration des Plasmids beträgt 3,3 g/ml.
    8. Nach der Inkubation der Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 4,5 h, ändern Sie das mittlere zu hochglukose DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin. 2 ml/Gut kulturmittel nach dem mittleren Wechsel in die 6-Well-Kulturplatte geben.
    9. Kultur die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 48 h nach der Transfektion. Führen Sie eine Retrovirus-Infektion am 3. Tag mit dem Überstand durch, der Retrovirus enthält.
  2. Retrovirus-Infektion von CENP-A-/F RPE-1-Zielzellen.
    1. Tag 2: Einen Tag vor der Infektion, verbreiten CENP-A-/F RPE-1 Zielzellen in der 6-Well-Kultur gut transfekt (2,25 x 105 Zellen/gut). Kulturzellen in DMEM: F12 mittel (Materialtabelle) mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.
      HINWEIS: Verbreitung von Zellen für Kolonie-Outgrowth-Assays, Immunfluoreszenz und Western-Blot-Analyse als Kontrolle. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, bestimmen Sie empirisch die Zelldichte, die bei der Aussaat verwendet werden soll.
    2. Tag 3 (Infektionstag des Virus): Bei 48 h nach Transfektion von 293T Verpackungszellen, sammeln Sie den Überstand enthaltenden Virus und filtern Sie durch 0,45 m Filter (verwenden Sie keinen 0,2 m Filter, der Virushülle schert). Es wird empfohlen, Polyethersulfonfilter (PES) zu verwenden.
    3. Infizieren Sie CENP-A-/F RPE-1-Zellen mit dem Virus. Für einen Brunnen der 6-Well-Kulturplatte 1 ml Frischmedien, 1 ml Virenüberstand und Polybren zu einer Endkonzentration von 8 g/ml hinzufügen. CENP-A-/F RPE-1-Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 4 Tage bis Tag 7 nach der Transfektion inkubieren.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit für das Zellwachstum von CENP-A-/F RPE-1 muss empirisch durch folgende Analysen für optimale Ergebnisse bestimmt werden.

2. Immunfluoreszenzanalyse von Zellen, die pBabe-EYFP-CENP-A enthalten

  1. Tag 7: 4 Tage nach der Retrovirus-Infektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten, entfernen Sie das Kulturmedium durch Aspiration. Einmal mit TBS (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 125 mM NaCl) spülen. Tragen Sie TBS auf die Seite der Kulturbrunnen auf, um eine Störung der Zelloberfläche zu vermeiden.
    HINWEIS: Der optimale Zeitpunkt für die Zellfixierung muss empirisch bestimmt werden. Immunfluoreszenzsignale sowohl von EYFP-CENP-A WT als auch K124R sind am Zentromer mindestens 4 Tage nach einer Retrovirus-Infektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten auch ohne Cre-Infektion nachweisbar (Daten nicht dargestellt, Abbildung 1C-E für die Daten mit Cre-Infektion).
  2. Führen Sie Methanolzellfixierung und Immunfluoreszenzfärbung wie zuvor beschrieben13durch.
  3. Als primäre Antikörper verwenden Sie einen Anti-GFP-Antikörper (1:1.000 Verdünnung) und einen Anti-CENP-B-Antikörper (Verdünnungsverhältnis von 1:200) für einen Zentromer-Positionsmarker in TBS, der 4% Ziegenserum enthält (siehe Tabelle der verwendeten Antikörper).
  4. Überschüssiges Montagemedium mit einem Papiertuch entfernen und die Ränder des Deckels im letzten Schritt mit Nagellack versiegeln.
  5. Siehe die zuvor beschriebene Methode13 zur Immunfluoreszenzbildbeobachtung, Erfassung, Quantifizierung und Analyse der verbleibenden Signale von EYFP-CENP-A am Zentromer.
  6. Bildaufnahme, Verarbeitung einschließlich Dekonvolution, Quantifizierung und Analyse mit den Softwares A oder Software B1 und B2 (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie optional Softwares C1-C3 (siehe Materialtabelle) für ein konfokales Laserscanmikroskop.
    HINWEIS: Siehe 2.6.1 in Ergänzenden Codierungsdateien für alle Befehle, die in Software A verwendet werden. Siehe 2.6.2 in Ergänzende Codierungsdateien für alle Befehle, die in den Softwares B1 und B2 verwendet werden.

3. Kolonie-Auswuchs-Assays mit pBabe-EYFP-CENP-A nach Retro-Cre-Virus-Infektion

HINWEIS: Der Grund für die Durchführung dieses Assays ist, die Zelllebensfähigkeit zwischen EYFP-CENP-A WT und K124R mutiert nach der Störung des CENP-A-/F-Alleels durch Cre Recombinase (nach dem Ersatz des gesamten zellulären CENP-A-Proteins) zu vergleichen.-/F

  1. Retrovirus-Transfektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten.
    1. Durchführung der Retrovirus-Transfektion-/F von CENP-A-/F RPE-1-Zellen, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Kulturzellen in DMEM: F12 medium mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin für 72 h nach der Virusinfektion.
    2. Drei Tage nach der Retrovirus-Infektion von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten (an Tag 6) fügen Sie Blasticidin S (10 g/ml) in Brunnen hinzu, die transfizierte Zellen enthalten, um sie für Kolonie-Auswuchs-Assay- und Kontrollexperimente zu verwenden. Zellen werden mindestens 14 Tage nach einer Virusinfektion in Gegenwart von Blasticidin S. das Medium mit Blasticidin S alle 5 Tage ändern.
      ANMERKUNG: Wenn Zellen etwa 80% Zusammenfluss erreichen, bevor sie für den Kolonietest (3.2.7. und 3.2.8) aussät werden, durchgehen Sie die Zellen im Verhältnis 1:2 und 1:5 durch Trypsinisierung und Beschichtung in einer 6-Well-Kulturplatte.
    3. Sammeln Sie Zellen für Western Blot an Tag 7, um die Proteinexpression von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten ohne Cre-Infektion zu bestätigen. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1B (Bahnen 1-4) dargestellt.
    4. Für Kolonie-Auswuchs-Assay mit Cre-Virus-Infektion, halten Sie die Zellen wachsen für 14 Tage nach der Virusinfektion in Gegenwart von Blasticidin S (d. h., wachsen Zellen in Blasticidin S mit Medium bis Tag 17 für die Ergebnisse hier vorgestellt).
  2. Retro-Cre-Virus-Infektion von pBabe-puro-Cre
    HINWEIS: Tag 0 in Schritt 3.2.1 entspricht Tag 13 von Abschnitt 3.1.
    1. Tag 0 bis Tag 3: Durchführung der Retrovirus-Transfektion vonCENP-A-/F RPE-1-Zellen unter Verwendung von pBabe-puro-Cre (B3027) als Expressionsplasmid (Details siehe Abschnitt 1). Stellen Sie sicher, dass Blasticidin S (10 g/ml) im Kulturmedium hinzugefügt wird.
    2. Tag 4: Trypsinize Zellen, um es von der Platte zu lösen. Platte 500 oder 5.000 Zellen in Dreifacharbeit in der 6-Well-Kulturplatte. Kulturzellen in DMEM: F12 mittel mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.
    3. Tag 5: Blasticidin S (10 g/ml) zum Kulturmedium hinzufügen. Für 5.000 oder 500 Zellen-Beschichtung wählen Sie Zellen mit Blasticidin S (10 g/ml) 3-24 Tage (bis Tag 14 in [3.2.7]) oder 3-28 Tage (bis Tag 18 in [3.2.8]) nach Virusinfektion von Konstrukten (pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukte).
      HINWEIS: In diesem Kolonie-Auswuchs-Assay wird die Transfektion von pBabe-puro-Cre zusammen mit der Transfektion von pBabe-EYFP-CENP-A hinzugefügt. Die Transfektion von pBabe-EYFP-CENP-A erfolgt in 3.1. Die Transfektion von pBabe-puro-Cre erfolgt in 3.2.1.
    4. Tag 10 (7 Tage nach retro-Cre-Virusinfektion): Sammeln Sie Zellen für die Western-Blotting-Analyse, um die Proteinerschöpfung des endogenen CENP-A nach retro-Cre-Virusinfektion und/oder Proteinexpression von pBabe-EYFP-CENP-A-Konstrukten am selben Tag 10 zu bestätigen.
    5. Führen Sie western Blotting durch, wie in Abschnitt 4 am selben Tag 10 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1B (Bahnen 5-7) dargestellt.
    6. Führen Sie eine Immunfluoreszenzanalyse (Abschnitt 2 oben) durch, um zu bestätigen, dass sowohl EYFP-CENP-A WT als auch K124R 7 Tage nach Inaktivierung des verbleibenden endogenen CENP-A-Alleels auf das Zentromer lokalisiert sind. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1C-1Edargestellt.
    7. Tag 14: Führen Sie den Kolonie-Auswuchs-Assay mit der Platte durch, die mit 5.000 Zellen gesät ist. Fixzellen für 10 min in Methanol und Fleck für 10 min in einer kristallvioletten Lösung (2,3% kristallviolett, 0,1% Ammoniumoxalat, 20% Ethanol (siehe Abbildung 2B). Zählen Sie die Anzahl der Kolonien, die die OpenCFU-Software verwenden (siehe Abbildung 2C).
    8. Tag 18: Verwenden Sie die platte mit 500 Zellen gesät. Fix- und Fleckenzellen, wie in Schritt 3.2.7 beschrieben (siehe Abbildung 2B). Zählen Sie die Anzahl der Kolonien (siehe Abbildung 2C).

4. Western Blot-Analyse mit pBabe-EYFP-CENP-A

HINWEIS: Siehe die zuvor beschriebene Methode13 für die Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die in Abbildung 1B und Abbildung 2A und Materialtabelle für EYFP-CENP-A-Proteine angegeben sind.

  1. Isolieren Sie Proteine, indem Sie die Zellen lysieren, die mit einer unterschiedlichen Virusinfektion gewachsen sind. Verwenden Sie dann 20 g Protein in einem Brunnen des SDS PAGE Gels. Übertragen Sie die Proteine auf eine PVDF-Membran, wie zuvor beschrieben13.
  2. Waschen Sie die Membran 3x nach Inkubationen mit primär-sekundären Antikörpern. Erkennen und analysieren Sie die Proteinbänder auf der Membran mit dem Infrarot-Bildgebungssystem und/oder dem Chemilumineszenz-Imager zur Immunoblot-Erkennung. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 1B und Abbildung 2Adargestellt.
    1. Informationen zum Erkennen und Analysieren der Proteinbänder finden Sie unter Schritt 4.2.1 in Ergänzenden Codierungsdateien.
    2. Verwenden Sie den Chemilumineszenz-Imager, um die Proteinbänder zu erkennen und zu analysieren, siehe Schritt 4.2.2 in Ergänzenden Codierungsdateien. Verwenden Sie für dieses System ein ultraempfindliches, verbessertes chemilumineszierendes Substrat (ECL) (Tabelle der Materialien).
    3. Optional verwenden Sie den westlichen Blot-Abisolierpuffer, um vorbebrütete Antikörper aus der PVDF-Membran zu entfernen und sie mit verschiedenen Antikörpern für die nächste Drehung der westlichen Analyse zu reblegen. Empirisch bestimmen Sie die optimierte Inkubationszeit und Temperatur.

5. Zellkultur,Transfektion und In-vivo-Ubiquitylierungs-Assays mit pQCXIP-EYFP-CENP-A

HINWEIS: Der Proteingehalt von EYFP-CENP-A, ausgedrückt aus dem pQCXIP-Vektor, ist um das 10-fache höher als der endogene CENP-A-Proteinspiegel. Die Verwendung dieses Vektors erleichtert die Immunpräzipitation einer höheren Menge der EYFP-CENP-A-Proteine, die Beobachtung der Ubiquitylierungsbänder von EYFP-CENP-A und die Identifizierung der Ubiquitylierung des EYFP-markierten CENP-A -Proteins (EYFP-CENP-A) durch Massenspektrometrieanalyse.

  1. Transfektion für In-vivo-Ubiquitylierungstests mit pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Samen 36,2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 Zellen in einer 10 cm Gewebekulturschale. Kulturzellen in glukosereichem DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.
      ANMERKUNG: Für optimale Ergebnisse bestimmen Sie empirisch die Zelldichte, die bei der Aussaat verwendet werden soll. Bereiten Sie mindestens 2 Gerichte für eine Immunpräzipitation (IP) Probe, um ein Minimum von 1 mg Gesamtprotein zu erhalten.
    2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 18 h.
    3. Bei 17 h nach der Aussaat die Transfektionsreagenzien vorbereiten.
    4. Herstellung von Lösung A durch Mischen von 6,7 g Plasmid jedes pQCXIP-EYFP (B3252), pQCXIP-EYFP-CENP-A WT (B3254), pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256) (Tabelle 1) in 335 l reduziertem Serummedium, und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren. Geben Sie allen Proben 6,7 g Plasmid von pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) hinzu.
      HINWEIS: Alle Vektoren sind in Tabelle 1aufgeführt.
    5. Lösung B durch Mischen von Transfektionsreagenzien I bzw. II in 335 l reduziertem Serummedium und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min.
      ANMERKUNG: Ein optionaler Schritt besteht darin, in Lösung B nur 40,2 l Transfektionsreagenz III (Polyethylenimin [PEI]; 1,0 mg/ml) hinzuzufügen oder zusätzlich zu den Transfektionsreagenzien I und II in Lösung B(Materialtabelle)40,2 l Transfektionsreagenz III hinzuzufügen.
    6. Mischen Sie die Lösungen A und B zusammen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 min.
    7. Nachdem Sie die kultivierten Zellen einmal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie die Mischung der Lösungen A und B (d.h. DNA-Lipid-Komplex) direkt zu jeder einzelnen 10 cm Gewebekulturschale hinzu, die 3,35 ml l reduziertes Serummedium hat.
      HINWEIS: Die Endkonzentration beträgt 1,67 g/ml Plasmid.
    8. Inkubieren Sie die Zellen im 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 für 4,5 h. Nach 4,5 h das mittlere zu hochglukose DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin ändern.
    9. Kultur die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 48 h nach der Transfektion. Sammeln Sie Zellen für die Zelllysatpräparation.
  2. Herstellung von Protein A Perlen gebunden mit Anti-GFP-Antikörper.
    1. Nehmen Sie 25 l (50% v/v) Protein A Perlen für eine Reaktion der Immunpräzipitation (IP). Mit Puffer A1 (Materialtabelle) mindestens 3x waschen, um EtOH zu entfernen, und 50% Lösung mit Puffer A1 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% Desoxycholat; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; komplettes EDTA-freies Protease-Inhibitor-Reagenz) herstellen.
    2. Fügen Sie den oben hergestellten Perlen 2,0 l Anti-GFP-Antikörper (Anti-76: Hausgemachteantikörper) hinzu und fügen Sie 10x Puffervolumen A1 hinzu, das mit dem Volumen der Netzperlen verglichen wird.
    3. End-to-End-Drehung bei 4 °C für 4-18 h durchführen. Die optimale Zeitlänge für die End-to-End-Rotation muss empirisch anhand der Effizienz der Immunpräzipitation bestimmt werden.
    4. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 100 x g für 1 min und entfernen Sie den ungebundenen Überstand. Fügen Sie Puffer A1 hinzu, um eine 50%-Lösung (v/v) der Perlen neu zu erstellen. Verwenden Sie 25 l (50 % v/v) dieser Lösung für eine Reaktion von IP.
  3. Immunpräzipitation (IP) mit Protein A Sepharose Perlen gebunden mit Anti-GFP-Antikörper.
    1. Lyse-Zellen, die in Schritt 5.1.9 in Puffer A1 durch Beschallung und Gefriertauprozess erhalten werden.
    2. Messen Sie die Proteinkonzentrationen und normalisieren Sie die Proteinmengen zwischen verschiedenen IP-Proben. Entfernen Sie 5 % der Probe aus jedem Rohr, das als 5% Eingangsprobe in SDS-PAGE ausgeführt wird.
      HINWEIS: Die 5%-Eingangsprobe kann in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert werden, wenn sie nicht innerhalb eines Tages geladen wird.
    3. Mischen Sie den Rest von 95% Lysat mit 25 l (50% v/v) Protein A Perlen gebunden an Anti-GFP-Antikörper, die in Schritt 5.2 hergestellt wurde. End-to-End-Drehung bei 4 °C für 4-18 h durchführen.
      HINWEIS: Die optimale Zeitlänge für die End-to-End-Rotation muss empirisch bestimmt werden.
    4. Zentrifugenprotein A Perlen mit dem protein gebunden (d.h. Immunpräcipitates) mit 100 x g für 1 min, und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Immunpräcipitate mit Puffer A1 durch Zentrifugieren bei 100 x g für 1 min. Führen Sie diesen Schritt 4x aus.
    5. Mischen Sie den 5% Input und den Rest von 95% Immunpräcipitates mit 2x und 4x SDS-PAGE Ladepuffer14, bzw. mischen. Kochen Sie diese beiden Proben für 5 min und laden Sie sie dann auf ein 10,0% denaturierendes SDS-Polyacrylamid-Gel für die Elektrophorese in verschiedenen Bahnen. Verwenden Sie größeres SDS-PAGE Gel (z.B. 17 cm x 15 cm) für die Elektrophorese. Wenn Proben in kleinerem Gel ausgeführt werden, ist es möglicherweise nicht möglich, klare/scharfe Ubiquitylierungsbänder zu beobachten.
    6. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse wie in Abschnitt 4 beschrieben unter Verwendung der im vorherigen Bericht8angegebenen Antikörper durch. Das Ergebnis ist in Abbildung 2Adargestellt.
    7. Verwenden Sie den westlichen Blot-Abisolierpuffer, um die vorbebrühten Antikörper aus der PVDF-Membran zu entfernen und sie mit verschiedenen Antikörpern für die nächste Runde der Western Blot-Analyse zu reblegen.

6. Massenspektrometrie zur Identifizierung der Ubiquitylierungsstelle des EYFP-CENP-A K124R-Mutanten

  1. Transfektion zur Massenspektrometrieanalyse mit pQCXIP-EYFP-CENP-A.
    1. Samen CENP-A-/F RPE-1 Zellen in einer 10 cm Gewebekulturschale. Überprüfen Sie, ob die Zelldichte 36,2 x 105 Zellen pro Schale beträgt. Kulturzellen in glukosereichem DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin. Bereiten Sie mindestens 20 Gerichte für eine Immunpräzipitationsprobe (IP) vor, um mindestens 10 mg Gesamtprotein zu erhalten (siehe 5.3).
      ANMERKUNG: Für optimale Ergebnisse bestimmen Sie empirisch die Zelldichte, die bei der Aussaat verwendet werden soll.
    2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 18 h. Bereiten Sie die Transfektionsreagenzien 23 h nach dem Ausbreiten vor (24 h Punkt ist 0 h Punkt der Transfektion).
    3. Bei 17 h nach der Aussaat die Transfektionsreagenzien und transfekten Zellen als (4.1.3) vorbereiten. Transfizierte Zellen haben pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) und pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R (B3256).
    4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5%CO2 für 48 h nach der Transfektion. Sammeln Sie Zellen für Zelllysate.
    5. Lysezellen im Puffer A1 und führen Immunpräzipitation als (5.2) und (5.3) durch. Führen Sie diese beiden Immunpräzipitationslysate wie folgt (6.1.6) und (6.1.7) aus.
      HINWEIS: Führen Sie die Probe in Standard-Tris-Glycin-Gelen aus (6.1.6). In (6.1.7) führen Sie die Probe in den handelsüblichen 4%-12% Bis-Tris-Proteingelen aus. Siehe auch Diskussion.
    6. Bewahren Sie eine Probe für 10 % der gesamten Immunpräcipitantien auf, um die EYFP-CENP-A-Ubiquitylierung zu bestätigen und die Position des ubiquitinierten EYFP-CENP-A, wie in Abschnitt 5 beschrieben, genau zu bestimmen. Führen Sie diese Probe in Standard-Tris-Glycin-Gelen aus. SDS-PAGE und Western Blot wurden als (5.3) aufgeführt.
    7. Bewahren Sie eine weitere Probe für 90 % der gesamten Immunpräzipitantien für die Massenspektrometrieanalyse auf. Führen Sie diese Probe in zwei Brunnen der handelsüblichen 4%-12% Bis-Tris Proteingele. Führen Sie Coomassie blaue Färbung mit Coomassie blau Lösung. Verbrauchen und schneiden Sie die Gelregion von 50-70 kDa (vermeintliche mono-Ub-EYFP-CENP-A K124R Region). Verwenden Sie diesen Gelbereich für die Analyse der Massenspektrometrie.
  2. Massenspektrometrieanalyse mit In-Gel-Verdauung.
    1. Jede Gelscheibe von Interesse in kleine Stücke (1 mm2) würfeln und in 0,5 ml proteinarme Röhrchen geben.
    2. Waschen Sie mit 100 l 50% (v/v) Acetonitril in 25 mM NH4HCO3, Wirbel 10-15 min, spin down, entsorgen Sie den Überstand, wiederholen 3x.
    3. Konzentrieren Sie die Probe mit einem Tischvakuumkonzentrator für 30 min, um die Gelstücke zu trocknen.
    4. Fügen Sie 10 l von 10 ng / L Sequenzierung Sequencing Grade Trypsin und lassen Sie die Gel-Stücke für 5 min rehydrieren.
    5. Fügen Sie 25 mM NH4HCO3 gerade genug, um die Gelstücke zu decken, verdauen bei 37 °C über Nacht.
    6. Übertragen Sie den verdauten Überstand in ein sauberes 0,65 ml silikonisiertes Rohr. 50% (v/v) Acetonitril/5% (v/v) Ameisensäure (30 l oder genug zur Abdeckung), Wirbel 10 min hinzufügen, drehen und in das gleiche Extraktionsrohr übertragen. Wiederholen Sie 3x.
    7. Den Gelstücken 10 l Acetonitril hinzufügen, 5 min wirbeln und nach unten drehen. Übertragen Sie den Überstand in dieselbe Röhre.
    8. Konzentrieren Sie die Proben mit dem Benchtop-Vakuumkonzentrator auf 2 l, fügen Sie der Probe 8 l 3% (v/v) Acetonitril /2% (v/v) Ameisensäure, Wirbel für 15 min und Spin down bei 16.000 x g für 30 min. Proben sind bereit für die Massenspektrometrieanalyse.
    9. Durchführen der MS-Datenerfassung mit LC-MS/MS mit einem flüssigen Chromatographiesystem (Materialtabelle) gekoppelt mit einem Massenspektrometrieinstrument (Materialtabelle).
    10. Injizieren Sie 8 l rekonstituierte Probe in eine Reverse-Phase-Flüssigkeitschromatographie (RPLC)-Säule.
    11. Trennen Sie die Peptide mit einem 2-80% Gradienten des Lösungsmittels B in 60 min. Stellen Sie sicher, dass der Gradient aus einem steigenden Prozentsatz des Lösungsmittels B von 2% auf 22% in 40 min, 22% bis 35% Lösungsmittel B in 12 min besteht, dann auf 80% Lösungsmittel B in 4 min klettert und schließlich in den letzten 4 min bei 80% Lösemittel B hält. Stellen Sie die Durchflussrate konstant auf 300 nL/min.
      HINWEIS: Lösungsmittel A enthält 0,1% Ameisensäure und 2% Acetonitril, Lösungsmittel B 0,1% Ameisensäure und 98% Acetonitril. Alle Konzentrationen werden als Volumen/Volumen angezeigt.
    12. Sammeln Sie Massenspektrometriedaten mithilfe des datenabhängigen Erfassungsmodus. Sammeln Sie kurz MS-Spektren in 350–1500 m/z für 250 ms. Wählen Sie die Top 50 intensiven Vorläufer mit Ladung 2–5 für weitere Fragmentierung. Sammeln Sie MS/MS-Spektren in 100–2000 m/z für 100 ms, ausschließen Vorläuferionen von der Wiederwahl für 15 s.
    13. Öffnen Sie für die Datenbanksuche die kommerzielle Software (siehe Tabelle der Materialien), um Massenspektrometriedaten auf dem Desktop zu analysieren.
    14. Um eine neue Suche zu machen, klicken Sie im oberen Menü auf die Schaltfläche "LC". Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Hinzufügen", um die ursprünglichen MS-Rohdatendateien hochzuladen.
    15. Wählen Sie "Human Protein ID" in der "Paragon-Methode" als Datenbanksuchmethode aus. Durchsuchen Sie die ursprünglichen MS-Rohdatendateien mit der UniProt Homo Sapiens-Datenbank (mit 160.566 Sequenzen, http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640).
    16. Legen Sie Suchparameter wie folgt fest: Trypsin als Verdauungsenzym auswählen, bis zu 3 fehlende Spalten, 4 Modifikationen und 2-5 Ladungen pro Peptid zulassen. Stellen Sie einen Massenfehler von bis zu 20 ppm für die erste Suche und 0,02 Da für fragmentierte Ionen ein. Geben Sie FDR-Schwellenwerte (False Discovery Rate) für Protein-, Peptid- und Modifikationsstellen von weniger als 1 % an. Legen Sie alle anderen Parameter in der Software auf Standardwerte fest (siehe Abbildung 3 für Massenspektrometrieanalyse).
    17. Klicken Sie auf die Schaltfläche"Speichern unter" rechts im oberen Menü, wählen Sie einen Ordner zum Speichern der Suchergebnisse aus, geben Sie den Suchnamen ein und klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern".
    18. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Prozess" auf der rechten Seite des oberen Menüs, um die Suche zu starten. Nach Dem Ende der Suche werden Daten mit dem eingegebenen Suchnamen automatisch in dem ausgewählten Ordner gespeichert. Die Daten können einfach durch Software F geöffnet werden.
    19. Um MS/MS-Spektren eines bestimmten Peptids zu erhalten, doppelklicken Sie auf die Suchergebnisse, um es von Software F zu öffnen. Klicken Sie zuerst auf das Protein in der Proteinliste oben im Menü, dann auf das Peptid in der Mitte des Menüs. Die MS/MS dieses Peptids wird unten im Menü angezeigt.
    20. Um MS/MS-Spektren zu exportieren und zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die MS/MS-Spektren am unteren Rand des Menüs, wählen Sie Kopieren aus und fügen Sie sie dann in eine geeignete Datei wie PPT oder doc. format ein.

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Ergebnisse

EYFP-CENP-A K124 Mutant zeigt Ubiquitylierung, Wechselwirkung mit HJURP, und keine Defekte in der Zentromerlokalisierung weder Zelltod. Hier wurde das von Fachinetti et al. (2017)6 gemeldete System neu konstituiert: In diploiden menschlichen (RPE-1) Zellen, die ein gestörtes und ein ''floxed'' CENP-A Allel (CENP-A-/F) tragen, wurde EYFP-CENP-A aus dem pBabe-EYFP Retrovirusvektor exprimiert. In diesem System könnte die Expression des endogenen CENP-A au...

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Diskussion

Hier beschrieben wir Methoden der Massenspektrometrie-Analyse, um die Ubiquitylierung von EYFP-CENP-A K124R Mutant zu identifizieren, was darauf hindeutet, dass das EYFP-Tagging eine Ubiquitylierung bei einem anderen Lysin im CENP-A K124R Mutant protein8induziert. In unseren Ergebnissen haben wir erfolgreich die Ubiquitylierung auf Lysin 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R identifiziert, was Lysin 56 (K56) in CENP-A durch Massenspektrometrieanalyse entspricht. Die hier beschriebene Massenspektrometrie...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Wir danken Chao-Jun Li vom Model Animal Research Center der Universität Nanjing für die Analyse der Massenspektrometrie. Wir danken Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa und aktuellen Forschern am Model Animal Research Center, der Nanjing University und dem Greehey Children es Cancer Research Institute für ihre hilfreiche Diskussion, experimentelle Beratung und Reagenzien. Wir danken Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago und Dawn S. Chandler für ihre großzügigen Reagenziengeschenke. Y.N. wurde vom Jiangsu Province ''Double-First-Class'' Construction Fund, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu Province 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) und National Natural Science Foundation in China (31970665) unterstützt. Diese Studie wurde teilweise durch das NGI-Stipendium R21 CA205659 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Equpiments/Tools
0,5 ml Protein-Röhrchen mit geringer BindungEppendorf022431064Für die massenspektrometrische Analyse
10-cm-ZellkulturschaleBIOFIL/JET, China70022410-cm-Gewebekulturschale (Yohei Lab, PN63)
6-Well-Zellkultur-ClusterFisher/Corning Incorporated07-200-836-Well-Kultur Platte
CentriVapLABCONCO-BenchtopVakuumkonzentrator für Vakuum trockene Peptide für die Massenspektrometrie
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μ mEksigent Technologies805-00120Säule für die Flüssigkeitschromatographie (RPLC) für die Massenspektrometrie-Analyse
HCX PL APO 100x Öl-TauchlinseLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X Öl-Tauchlinse
HCX PL APO 63x Öl-TauchlinseLeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X Öl-Tauchlinse
Immobilon-FL PVDF Transfer MembraneEMD MilliporeIPVH00010Für Western Blot
Leica DM IRE2 motorisiertes FluoreszenzmikroskopLeica-motorisiertesFluoreszenzmikroskop
Leica EL6000 kompakte LichtquelleLeicaExterne Lichtquelle für Fluoreszenzanregung
Micro Deckglas (22 mm x 22 mm)Surgipath105Deckglas (22 mm x 22 mm)
Modell V16-2 Polyacrylamid-GelelektrophoresegerätApogee Electrophoresis/CORE Life Sciences31071010Gelelektrophoresegerät I zur Anwendung größerer SDS-PAGE Gel
nanoLC.2DEksigentTechnologies-Flüssigkeitschromatographiesystem für die massenspektrometrische Analyse
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein GelsThermo Fisher NP0335BOXDie kommerziell erhältlichen 4%-12% Bis-Tris Proteingele für die massenspektrometrische Analyse
Olympus FLUOVIEW FV3000 konfokales Laser-Scanning-MikroskopLaser-Scanning-Mikroskop (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ Downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
ORCA-R2 Degitale CCD-KameraHamamatsuC10600-10B CCD-Kamera
PAP PenBinding SiteAD100.1Für eine wasserabweisende Barriere bei Immunfluoreszenzfärbungen
GEWEBE KULTURSCHALEN 10CMVWR25382-16610 cm Gewebekulturschale
Vertikale Elektrophorese für den Gellauf (große Größe)Junyi, ChinaJY-SCZ6+Gelelektrophoresegerät II zum Auftragen von größerem SDS-PAGE-Gel (Yohei lab, PE23)
VWR Mikro-Objektträger, mattiertVWR International48312-013Mikro-Objektträger
Primäre Antikörper
Anti-CENP-A-AntikörperStressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006Monoklonaler Maus-Antikörper
Anti-CENP-B-AntikörperNovus BiologicalsH00001059-B01PMonoklonaler Maus-Antikörper
Anti-GAPDHABCAMab37168Polyklonaler Kaninchen-Antikörper
Anti-GAPDHInvitrogenPA1987Polyklonaler Kaninchen-Antikörper
Anti-GFP-AntikörperANTI #76 (hausgemachter Antikörper)Polyklonaler Kaninchen-Antikörper
anti-HA (3F10)Roche11815016001Ratte monoklonaler Antikörper
anti-HJURPProteintech Group15283– 1-APKaninchen polyklonaler Antikörper
Anti-UbiquitinBethyl LaboratoriesA300-317A-1Kaninchen Polyklonale Antikörper
Reagenzien
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad500-0006Kommerzielles Proteinassay-Reagenz I zur Messung der Proteinkonzentration (kompatibel mit 0,1% SDS)
Branson SONIFIER 450Ultraschallgerät
Branson Ultrasonics Ultraschallgerät Mikrospitzenstufe, massiv, Gewinde 9,5 mmVWR Scientific Products Inc.33995-325Disruptorhorn für die Beschallung
Branson Ultrasonics Ultraschallgerät Microtip Tapered 6,5 mmVWR Scientific Products Inc.33996-185Microtip für die Beschallung
Puffer A1--20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM NaCl; 0,5 % Nonidet P-40; 0,5 % Desoxycholat; 0,5 % SDS; 1 mM EDTA; vollständiges EDTA-freies Proteaseinhibitor-Reagenz
Vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitor-CocktailRoche11-873-580-001Vollständiges EDTA-freies Proteaseinhibitor-Reagenz für Puffer A1
Coomassie brilliant blue R-250BBI Life SciencesCAS 6104-59-2Coomassie-blaue Lösung für die massenspektrometrische Analyse
Kristallviolett-Lösung (2,3 % Kristallviolett, 0,1 % Ammoniumoxylat, 20 % Ethanol)SigmaI-AldrichHT90132-1LFür die Koloniefärbung
DAPISIGMA-SLDRICHD9542Für die Kernfärbung
DMEM: F12 MediumATCC30-2006DMEM: F12 Medium
Fetal Rinderserum, zertifiziert, Hitze inaktiviert, aus den USALife Technologies/Gibco10082FBS (fötales Rinderserum)
DMEM mit hohem Glukosegehalt (Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium)Life Technologies/BioWhittaker12-604DMEM
Lipofectamin 3000Life Technologies/InvitrogenL3000Transfektionsreagenz I für die chemische Transfektion
Lipofectamin 3000, P3000 LösungLife Technologies/InvitrogenL3000Transfektionsreagenz II für die chemische Transfektion
MethanolFisherA412-4Fixierung fettfreies
Milchpulver (zugelassener Ersatz für Nelkenpulver)Fisher ScientificNC9255871 (Bestellnummer 190915; Los # 90629)Fettfreie Magermilch
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985Reduziertes Serummedium
p-PhenylendiaminSIGMA-SLDRICHP6001Zum Einbetten
von Medium Penicillin, Streptomycin; FlüssigkeitFisher/Gibco15-140Penicillin-Streptomycin
Poly-L-Lysin SOLUTIONSIGMA-SLDRICHP 8920Poly-L-Lysin, 0,1 % w/v, in Wasser
Polyethylenimin [PEI]; 1,0 mg/mlPolysciences23966 2Transfektionsreagenz III für die chemische Transfektion
Protein A-Sepharose CL-4B-KügelchenGE Healthcare/Amersham17-0963-03Protein A-Sepharose-CL-4B-Kügelchen für In-vivo-Ubiquitylierungsassays mit pQCXIP-EYFP-CENP-A
Restore Western Blot Stripping BufferThermo ScientificPI21059Western Blot Stripping Buffer I
Trypsin PromegaV5111SequenzierqualitätFür die massenspektrometrische Analyse
SuperSignal West Femto Substrat mit maximaler EmpfindlichkeitThermo34095Ultra-sensitives Substrat mit verbesserter Chemilumineszenz (ECL)
UltraPure DistilledWater Life Technologies/Invitrogen/Gibco10977Steriles Wasser in Gewebekulturqualität
Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6,85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)--Western Blot Stripping Buffer II
strong>Sekundärantikörper
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG LifeTechnologies/InvitrogenA11008Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgGLife Technologies/InvitrogenA11005Fluorophor-konjugierter Sekundärantikörper (Affinitätsgereinigter Sekundärantikörper)
Softwares
Acquisition FV31S-SW softwareOlympus-SofwareC1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ Downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
Analyse FV31S-DT SoftwareOlympus-Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ Downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)
cellSens Dimension Software Ver. 1. 18Olympus-SofwareC3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)
Image Studio Analysis Software Ver 4.0LI-COR Biosciences-SoftwareD
Molecular Imager Versadoc MP4000 SystemBio-Rad-Chemilumineszenz-Imager für den Immunoblot-Nachweis
Odyssey CLx Infrarot-BildgebungssystemLI-CORfür den Immunoblot-Nachweis
OpenCFU-Sicherheitsware--Für die Koloniezählung (http://opencfu.sourceforge.net/)
Openlab Version 5.5.2. Wissenschaftliche BildgebungssoftwareImprovision/PerkinElmer-SoftwareA
ProteinPilot Software Version 4.5AB SCIEX-SoftwareF für massenspektrometrische Analysen
Quantity One 1-D AnalysesoftwareBio-Rad-SoftwareE
TripleTOF 5600+ SystemAB SCIEX-Massenspektrometrie-Gerät
Volocity Version 6.3 3D-Bildanalysesoftware (Volocity Acquisition)PerkinElmer-SoftwareB1
Volocity Version 6.3 3D-Bildanalysesoftware (Volocity Quantification)PerkinElmer-SoftwareB2
Olympus-Konfokales < Biosciences-Infrarot-Bildgebungssystem

Referenzen

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Identifizierung der UbiquitylierungImmunpräzipitationsprotokollLC-MS/MS-AnalyseGel-ExzisionsmethodeTrypsinverdauProtein-A-BeadsAnti-GFP-AntikörperZentromeridentität
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