Summary
Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.
Abstract
Lipoproteïnen uit proteobacteriën worden posttranslationeel gemodificeerd door vetzuren afgeleid van membraanfosfolipiden door de werking van drie integrale membraanenzymen, wat resulteert in getriacyleerde eiwitten. De eerste stap in de lipoproteïnemodificatieroute omvat de overdracht van een diacylglycerylgroep van fosfatidylglycerol naar het prolipoproteïne, wat resulteert in diacylglycerylprolipoproteïne. In de tweede stap wordt het signaalpeptide van prolipoproteïne gesplitst en vormt het een apolipoproteïne, dat op zijn beurt wordt gewijzigd door een derde vetzuur afgeleid van een fosfolipide. Deze laatste stap wordt gekatalyseerd door apolipoproteïne N-acyltransferase (Lnt). De lipoproteïnemodificatieroute is essentieel in de meeste γ-proteobacteriën, waardoor het een potentieel doelwit is voor de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële middelen. Hier wordt een gevoelige test voor Lnt beschreven die compatibel is met high-throughput screening van kleine remmende moleculen. Het enzym en de substraten zijn membraan-ingebedde moleculen; daarom is de ontwikkeling van een in vitro test niet eenvoudig. Dit omvat de zuivering van het actieve enzym in aanwezigheid van wasmiddel, de beschikbaarheid van alkynfosfolipiden en diacylglycerylpeptidesubstraten en de reactieomstandigheden in gemengde micellen. Om de activiteitstest te gebruiken in een high-throughput screening (HTS) opstelling, heeft directe uitlezing van het reactieproduct bovendien de voorkeur boven gekoppelde enzymatische reacties. In deze fluorometrische enzymtest wordt het alkyn-getriagyleerde peptideproduct fluorescerend gemaakt door een klikchemiereactie en gedetecteerd in een multiwell-plaatformaat. Deze methode is van toepassing op andere acyltransferasen die vetzuurhoudende substraten gebruiken, waaronder fosfolipiden en acyl-CoA.
Introduction
Bacteriële lipoproteïnen worden gekenmerkt door covalent gebonden vetzuren op hun amino-termini waardoor ze worden verankerd in membranen 1,2. Het volwassen deel van het eiwit is zeer divers in structuur en functie, waardoor de rol van lipoproteïnen in verschillende biologische processen in de bacteriële celenvelop wordt verklaard.
Lipoproteïnen worden gemodificeerd door fosfolipide-afgeleide vetzuren na inbrenging in het cytoplasmamembraan. De prolipoproteïnen bevatten een kenmerkend motief, de lipobox, die een invariant cysteïneresidu bevat dat wordt geacyleerd en het eerste aminozuur in het rijpe eiwit. De eerste stap van deze route wordt gekatalyseerd door prolipoproteïnefosfatidylglycerol::d iacylglyceryltransferase (Lgt), dat de diacylglycerylgroep overbrengt van fosfatidylglycerol naar het prolipoproteïne via een thioetherverbinding tussen diacylglyceryl en cysteïne. Signaal peptidase II (Lsp) splitst het signaalpeptide van diacylglyceryl prolipoproteïne, wat resulteert in een apolipoproteïne dat via zijn diacylglycerylgroep in het membraan is verankerd. De derde en laatste stap wordt gekatalyseerd door apolipoproteïne N-acyltransferase (Lnt), dat een vetzuur uit de sn-1-positie van fosfolipide toevoegt aan apolipoproteïne, wat resulteert in getriacyleerd rijp lipoproteïne (figuur 1)3. De Lnt-reactie is een pingpongreactie in twee stappen waarbij een stabiel thioester-acyl-enzymtussenproduct wordt gevormd. Het bijproduct van lysofosfolipide wordt vrijgegeven voorafgaand aan de acylering van het apolipoproteïnesubstraat in de tweede stap van de reactie.
De specificiteit van het fosfolipidensubstraat wordt bepaald in een Lnt-test op basis van de mobiliteitsverschuiving van N-acyldiacylglycerylpeptide op een hoog percentage Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Fosfolipiden met kleine polaire kopgroepen, verzadigd [sn-1] en niet-verzadigd [sn-2], hadden de voorkeur als substraten4. De gelverschuivingstest is niet geschikt voor uitgebreide kinetische studies van apolipoproteïne N-acyltransferase, noch voor HTS om remmende moleculen te identificeren. Klikchemie met behulp van alkynvetzuren is met succes gebruikt om lipoproteïnemodificatie in bacteriën5 en vetzuurmetabolisme in eukaryoten6 te bestuderen. Onlangs werd een in vitro test van Ras-palmitoylering gemeld om remmers te identificeren7.
In de hier beschreven methode wordt gezuiverde actieve Lnt in wasmiddel geïncubeerd met substraten in gemengde micellen om alkyn-getristacyleerd peptide te vormen dat vervolgens wordt gedetecteerd door fluorescentiespectrometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Enzym- en substraatvoorbereiding
- Zuivering van enzym
- Produceren en zuiveren van Lnt-enzym uit wasmiddel opgeloste membranen zoals eerder beschreven 4,8. In het kort, induceer expressie van het lnt-strep-gen, coderend voor Lnt met een C-terminal Strep-tag, bij OD600 van 0,6 met watervrij tetracycline (200 ng/ml) bij 37 °C gedurende 16 uur.
- Oogst cellen door centrifugeren bij 4.000 x g gedurende 10 minuten en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de celpellet in buffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) tot 100 OD600 eenheden per ml.
- Breek de cellen door twee passages door een Franse drukcelpers op 10.000 psi.
- Verwijder ongebroken cellen en vuil door centrifugeren bij 13.000 x g gedurende 20 minuten. Bewaar het supernatant en gooi de pellet weg.
- Centrifugeer het supernatant bij 120.000 x g gedurende 60 minuten en verzamel de membraanblaasjes (doorschijnende bruin gekleurde pellet). Gooi het supernatant weg.
- Verzacht de integrale membraaneiwitten uit de membraanpellet met 1% (w/v) n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) in buffer WA gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Centrifugeer en verwijder onoplosbaar materiaal bij 120.000 x g gedurende 30 minuten. Gebruik de supernatantfractie voor zuivering.
- Zuiver Lnt-strep op een affiniteitschromatografiekolom (zie Tabel van Materialen) en een S400-gelfiltratiekolom (zie Tabel van Materialen) zoals beschreven door Nozeret et al.8.
- Bewaar het gezuiverde enzym in buffer WA met 0,05% DDM en 10% glycerol bij -80 °C.
OPMERKING: Het enzym is meer dan 5 jaar stabiel.
- Bereiding van alkyn-fosfolipiden en gebiotinyleerde Fibroblast Stimulerende Ligand (FSL-1-biotine) substraten
- Aliquot 100 μL op maat gesynthetiseerde alkyn-POPE (1-hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine, zie Materiaaltabel) opgelost in chloroform in buizen van 1,5 ml.
- Prik de buisjes door met een spuit en verdamp de chloroform in een speed-vac bij RT gedurende 2 uur. Bewaar de droge fosfolipidemonsters bij -20 °C.
- Los alkyne-POPE vóór gebruik op in 0,1% Triton X-100 bij 500 μM. Voeg indien nodig een ultrasoon waterbad van 3 minuten toe in een ultrasoon waterbad bij RT om alkyne-POPE op te lossen.
- Resuspendeer FSL-1-biotine in water bij 445 μM.
OPMERKING: Beide oplossingen kunnen minstens 2 maanden bij -20 °C worden bewaard.
2. Buistest
OPMERKING: Stel op dag 1 de Lnt-reactie in 1,5 ml buizen in (stap 2.1) en bekleed 96 putplaten met streptavidin (stap 2.2).
- Bereiding van reagensmengsel en enzymatische reactie
- Meng voor een standaard Lnt-test alkyne-POPE (laatste 50 μM uit 500 μM-voorraad) en FSL-1-biotine (eindconcentratie van 50 μM uit een voorraad van 445 μM) in Lnt-reactiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 met 1% BSA) bij een eindvolume van 18 μL in buizen van 1,5 ml. Voer alle omstandigheden in drievoud uit.
- Soniceer het substraatmengsel (bereid in stap 2.1.1) gedurende 3 minuten in een ultrasoon waterbad en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten voorafgaand aan de toevoeging van Lnt-enzym (stap 2.1.3).
OPMERKING: MTSES (natrium (2-sulfonatoethyl)methaanthiosulfonaat), een thiolspecifiek reagens, remt Lnt8. Voeg 10 mM MTSES (100 mM stockoplossing in 100% DMSO) toe aan de reactiebuizen (stap 2.1.1) om te gebruiken als negatieve controlemonsters. Pas het volume van de Lnt-reactiebuffer aan zodat het totale volume 18 μL is. - Voeg actieve (1 ng/μL, overeenkomend met 17,2 nM) of inactieve Lnt (C387S) (2 μL van 10 ng/μL voorraad in buffer WA met 0,05% DDM) toe en meng met de substraten (stap 2.1.2) door op en neer te pipetteren.
- Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 16 uur in een thermomixer met verwarmd deksel.
- Streptavidin coating van 96 putplaten
- Bereid een stamoplossing van streptavidin in 2 mg/ml in H2O.
OPMERKING: Deze oplossing kan maximaal 6 maanden bij -20 °C worden bewaard. - Bereid uit de stamoplossing 10 μg/ml streptavidin in water als werkoplossing. Voeg 100 μL van de oplossing toe aan elk putje van de 96 putplaat. Bind streptavidin aan de plaat door een nacht bij 37 °C zonder deksel te broeden om de putjes aan de lucht te drogen.
- Bereid een stamoplossing van streptavidin in 2 mg/ml in H2O.
OPMERKING: Voer op dag 2 klikchemie uit (stap 2.3), bind het Lnt-reactiemengsel aan gestreepte platen (stap 2.4) en detecteer fluorescentie en analyseer de resultaten (stap 2.5).
- Klik-chemie reactie
- Bereid stamoplossingen van Azido-FAM (5 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride; 50 mM bereid in water), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine; 2 mM in tert-butanol:DMSO (4:1)) en CuSO4∙5H2O (50 mM vers bereid in H2O).
- Voer in de buizen van 1,5 ml die het in stap 2.1.4 bereide Lnt-reactiemengsel bevatten, klikchemie uit door de reagentia in de volgende volgorde toe te voegen: 0,2 μL voorraad Azido-FAM (eindconcentratie 50 μM), 0,4 μL voorraad TCEP (eindconcentratie 1 mM), 0,2 μL voorraad TBTA (eindconcentratie 0,02 mM).
- Vortex de oplossing voor 5 s. Voeg vervolgens 0,4 μL voorraad CuSO4 toe (eindconcentratie 1 mM). Vortex opnieuw voor 5 s. Incubeer de monsters in het donker bij RT gedurende 1 uur.
- Binding van het Lnt-reactiemengsel aan met streptavidin gecoate platen
- Was de putjes van de met streptavidin beklede platen na de nachtelijke incubatie vanaf stap 2.2.2 3x met 200 μL PBS-T1 (PBS met 0,05% Tween-20).
OPMERKING: Streptavidin-platen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of droog worden bewaard bij 4 °C. - Breng 18 μL uit het klikchemiemengsel uit stap 2.3.3 over naar een putje in een 96 goed gestreepte plaat en voeg 100 μL PBS-T1 toe om N-acyl-FSL-1-biotine-FAM-product aan streptavidinplaten te binden.
- Gebruik biotine-fluoresceïne (0,26 μM uit een voorraad van 3,1 mM in DMSO) als positieve controle voor streptavidinbinding en fluorescentie-uitlezing.
- Incubeer de platen bij RT gedurende 1 uur in het donker in een thermomixer, schuddend bij 300 tpm.
- Voer handmatige wasstappen uit van de 96 putplaten met een meerkanaals elektronische pipet als volgt: zes wasbeurten met 200 μL PBS-T2 (PBS met 1% Tween-20), drie spoelingen met een pipet, drie wasbeurten met 200 μL PBS, drie spoelingen met een pipet.
- Was de putjes van de met streptavidin beklede platen na de nachtelijke incubatie vanaf stap 2.2.2 3x met 200 μL PBS-T1 (PBS met 0,05% Tween-20).
- Fluorescentie detectie en analyse
- Voeg 200 μL PBS toe en noteer de fluorescentie bij 520 nm in een fluorescentiemicroplaatlezer. Sla resultaten op in spreadsheetsoftware.
OPMERKING: Biotine-fluoresceïne wordt gebruikt als een positieve controle voor streptavidinbinding en fluorescentiedetectie bij 520 nm. Een reproduceerbare uitlezing van 30.000-40.000 A.U. met 0,26 μM biotine-fluoresceïne wordt verwacht. Alle monsters worden in drievoud geanalyseerd, inclusief controles. - Bereken de standaarddeviatie voor elke reactie en bereken P-waarden voor negatieve controles en positieve monsters met behulp van ongepaarde t-test met behulp van statistische software.
- Voeg 200 μL PBS toe en noteer de fluorescentie bij 520 nm in een fluorescentiemicroplaatlezer. Sla resultaten op in spreadsheetsoftware.
3. Multiwell plaat assay
OPMERKING: Zet op dag 1 de Lnt-reactie op in 384 putplaten (stap 3.1) en bekleed 384 putplaten met streptavidin (stap 3.2).
- Bereiding van reagensmengsel en enzymatische reactie
OPMERKING: De hoeveelheid reagentia en enzym is verminderd in vergelijking met de buistest en de Lnt-reactie wordt direct uitgevoerd in 384 putplaten. Dit maakt het gebruik van minder materiaal en een vermindering van stappen mogelijk die verder kunnen worden geautomatiseerd.- Meng de substraten als volgt: alkyn-POPE (eindconcentratie 50 μM uit 500 μM-voorraad) en FSL-1-biotine (laatste 50 μM uit 500 μM-voorraad) in Lnt-reactiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 met 1% BSA) bij een volume van 13,5 μL per reactie per put in een 384 putplaatformaat. Voer alle omstandigheden in drievoud uit. Bereken de totale hoeveelheid reagentia die nodig is voor het aantal uit te voeren reacties (d.w.z. 5.184 μL voor één 384 putplaat).
- Soniceer het substraatmengsel gedurende 3 minuten in een ultrasoon waterbad.
- Aliquot 13,5 μL van het substraatmengsel per put in een plaat met 384 putten.
OPMERKING: Als negatieve controle kan 10 mM MTSES (625 mM stockoplossing in 100% DMSO) per put worden toegevoegd. Pas het volume van de Lnt-buffer (stap 3.1.1) aan om een eindreactievolume van 13,5 μL te bereiken. - Incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten voorafgaand aan de toevoeging van Lnt enzym (stap 3.1.5).
- Voeg 0,5 ng/μL (overeenkomend met 8,6 nM) actief Lnt-enzym of inactieve variant (C387S) (1,5 μL uit 5 ng/μL voorraad in buffer WA met 0,05% DDM) toe in Lnt-reactiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) aan elk putje met het reactiemengsel uit stap 3.1.3. Meng reagentia door op en neer te pipetteren. Het totale reactievolume is 15 μL.
- Sluit de plaat af met plastic folie voor multiwell platen.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 16 uur in een thermomixer met verwarmd deksel.
- Streptavidin coating 384 putplaten
- Gebruik 75 μL streptavidin (10 μg/ml in H2O) uit stap 2.2.2 om putjes van een 384 putplaat te coaten. Laat streptavidin aan de plaat binden door een nacht bij 37 °C zonder deksel te broeden om de putjes aan de lucht te drogen.
OPMERKING: Voer op dag 2 klikchemie uit (stap 3.3), bind het Lnt-reactiemengsel aan gestreepte platen (stap 3.4), detecteer fluorescentie en analyseer de resultaten (stap 3.5).
- Klik-chemie reactie
- Bereid stamoplossingen van Azido-FAM (1,2 mM in DMSO), TCEP (tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride; 24 mM bereid in H2O), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine; 0,48 mM in tert-butanol:DMSO (4:1)) en CuSO4∙5H2O (24 mM vers bereid in H2O).
- Combineer de drie klikchemische reagentia: een mengsel van Azido-FAM (eindconcentratie 50 μM), TCEP (1 mM final) en TBTA (0,02 mM final), elk bij 0,75 μL in eindvolume van 2,25 μL per putje. Bereken het vereiste volume per 384 putplaat (d.w.z. gebruik 864 μL wanneer alle putten van de 384 putplaat worden gebruikt). Meng krachtig.
- Voeg 2,25 μL van de reagensoplossing per putje rechtstreeks toe aan de voltooide Lnt-reactie in de 384 putplaat uit stap 3.1.7.
- Mix door op en neer te pipetteren met een meerkanaals elektronische pipet.
- Voeg CuSO4 toe (0,75 μL uit 24 mM voorraad voor een eindconcentratie van 1 mM) en meng door op en neer te pipetteren met een meerkanaals elektronische pipet.
- Incubeer bij RT gedurende 1 uur in het donker.
- Binding van Lnt-reactiemengsel aan 384 putplaten met streptavidincoating
- Was de putjes van de met streptavidin beklede platen na de nachtelijke incubatie vanaf stap 3.2.1 1x met 85 μL PBS-T1.
- Breng 11 μL van de klikchemiereactie over van elke put van de incubatieplaat vanaf stap 3.3.6 naar de met streptavidin gecoate plaat uit stap 3.4.1 om het N-acyl-FSL-1-biotine-FAM-product aan de streptavidinplaten te binden.
- Voeg 64 μL buffer PBS-T1 toe.
- Neem biotine-fluoresceïne (0,19 μM uit een voorraad van 3,1 mM in DMSO) op als controle voor binding aan gestreepte putten met streptavidin.
- Incubeer de 384 putplaten bij RT gedurende 1 uur in het donker in een thermomixer, schuddend bij 300 tpm.
- Was de platen met een geautomatiseerde platenwasser als volgt: 10 wasbeurten met 85 μL PBS-T2, platen worden tussen de wasbeurten geschud; 5 wasbeurten met 85 μL PBS, platen worden tussen de wasbeurten geschud.
- Fluorescentie detectie en analyse
- Voeg PBS (85 μL) toe en registreer fluorescentie in een fluorescentiemicroplaatlezer bij 535 nm.
- Analyseer gegevens zoals beschreven (stap 2.5.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de Lnt-reactie wordt het sn-1 vetzuur uit fosfolipiden overgebracht op een diacylglycerylpeptide, wat resulteert in volwassen getrianacyleerd peptide8. De hier beschreven in vitro Lnt-test is ontworpen om fosfolipiden met een alkynvetzuur (alkyn-POPE) en FSL-1-biotine als substraten te gebruiken, wat resulteert in de vorming van alkyn-FSL-1-biotine. Bij een klikchemiereactie met azido-FAM moet dit product fluorescerend worden gelabeld en gedetecteerd door fluorescentiespectrometrie (figuur 2).
De reactiecondities werden geoptimaliseerd voor maximale fluorescentie-uitlezing bij 520 nm in een plaatlezer. Bij 1 ng/μL enzym werd volledige omzetting van FSL-1-biotine waargenomen8 (figuur 3). Negatieve controles omvatten reacties zonder enzym, met een inactieve variant van het enzym (actieve site mutant C387S), of met thiol-specifieke remmer MTSES die resulteren in lage fluorescentiedetectie. Biotine-fluoresceïne gebonden efficiënt aan streptavidin-gecoate platen en werd gebruikt als een interne controle voor maximaal fluorescentiesignaal. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoudige en standaarddeviatieberekeningen en statistische analyse toonde aan dat de test gevoelig en reproduceerbaar was.
Om een HTS-test te ontwikkelen om te screenen op kleine molecuulremmers van Lnt, werd de hoeveelheid reagentia verminderd en werden de reacties direct uitgevoerd in 384 putplaten. Verder werden wasstappen geautomatiseerd met behulp van een platenwasser (zie Materiaaltabel). Wat de buistest betreft, was de reactie gevoelig en reproduceerbaar, met een significant verschil tussen de negatieve controle (C387S) en het actieve enzym (Lnt) (figuur 4). In HTS bepaalt de Z'-factor of een respons in een test groot genoeg is voor screeningsdoeleinden9 en wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking:
Waarbij S het gemiddelde signaal is, B het achtergrondsignaal en σ de standaarddeviatie.
De gemiddelde Z'-factor was >0,6 voor de Lnt-test uitgevoerd in HTS-formaat met behulp van 384 putplaten, wat suggereert dat de test voor screening van kleine moleculen voor Lnt-remming uitstekend was.
Figuur 1: Enzymatische reacties bij posttranslationele modificatie van lipoproteïne in proteobacteriën. De opeenvolgende stappen werden gekatalyseerd door Lgt10, Lsp11 en Lnt12,13,14 in het cytoplasmatische membraan. PGN: peptidoglycaan, SP: signaalpeptide, LB: lipobox, geconserveerd motief met Cys+1 en gemodificeerd met vetzuren en het eerste aminozuur in rijp lipoproteïne, PG: fosfatidylglycerol, G-1-P: glycerol-1-fosfaat, PE: fosfatidylethanolamine, lysoPE: lyso- fosfatidylethanolamine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische weergave van de fluorometrische enzymtest voor apolipoproteïne N-acyltransferase (Lnt). De substraten FSL-1-biotine (geel) en alkyn-POPE (blauw) werden gemengd met gezuiverd Lnt-enzym opgelost in wasmiddel. De reactie werd uitgevoerd in gemengde micellen bij 37 °C (stap 1). Het alkyn-FSL-1-biotineproduct werd gelabeld met fluoresceïne (oranje) door klikchemie (stap 2) en gedetecteerd in een fluorescentieplaatlezer bij binding aan gestreepte platen (stap 3). De figuur is een aangepaste versie van Figuur 1B gepubliceerd door Nozeret et al.8 volgens de Creative Commons licentie (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Fluorescentiedetectie van Lnt-activiteit in 96 putformaat. Lnt-reacties werden uitgevoerd in buizen bij 37 °C gedurende 16 uur. Na fluorescerende etikettering door klikchemie en binding aan gestreepte platen, werd fluorescentie gemeten met fluorescentiespectrometrie. Biotine-fluoresceïne (biotine-fluo 0,26 μM) werd gebruikt als controle voor fluorescentie. Buffer was alleen reactiebuffer. Monsters die wijzen op alkyn-POPE (50 μM), FSL-1-biotine (50 μM) en substraten (mix van alkyn-POPE en FSL-1-biotine, elk 50 μM) bevatten geen enzym. Negatieve controles omvatten remming met MTSES (10 mM) en een inactieve variant van Lnt (C387S). Lnt enzym werd toegevoegd bij 1 ng/μL. Standaarddeviaties werden berekend voor n = 3 experimenten. ** P-waarde < 0,005. Excitatie bij 494 nm, bandbreedte 5 nm en emissie bij 520 nm, bandbreedte 5 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Fluorescentie-uitlezing van de Lnt-reactie in 384 putplaat compatibel met HTS. Enzymatische Lnt-reacties werden uitgevoerd in 384 putplaten bij 37 °C. Biotine-fluoresceïne (biotine-fluo 0,19 μM) werd gebruikt als controle voor fluorescentie. Buffer was reactiebuffer met DMSO. Negatieve controles omvatten remming met MTSES (10 mM) en een inactieve variant van Lnt (C387S). Lnt enzym werd toegevoegd bij 0,5 ng/μL. Standaarddeviaties werden berekend voor n = 3 experimenten. P-waarde < 0,0005. Excitatie bij 485 nm, bandbreedte 20 nm en emissie bij 535 nm, bandbreedte 25 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol voor de Lnt-test, gebaseerd op fluorescentiedetectie van het getriagyleerde product, is gevoelig en reproduceerbaar. De specifieke en efficiënte binding van biotine aan streptavidin is een belangrijk element in de test. Het alkyne-POPE-substraat dat overblijft na voltooiing van de Lnt-reactie wordt ook fluorescerend gelabeld met FAM, maar wordt efficiënt verwijderd na binding aan de streptavidinplaten door meerdere wasstappen. Bovendien heeft toevoeging van DMSO geen invloed op de Lnt-activiteit en heeft het geen invloed op de test. Zowel substraat als enzym zijn zeer lipofiel en vereisen reactieomstandigheden in gemengde micellen. Technieken die afhankelijk zijn van oplosbare enzymen en substraten voor productdetectie, inclusief fluorescentiepolarisatie, zijn niet van toepassing8. De enige beperking van de test is de compatibiliteit van het enzym met alkynsubstraat, omdat de klikchemiereactie afhankelijk is van deze chemische groep.
Gelverschuivingstests zijn gemeld in eerdere studies om Lnt-activiteit te analyseren en om substraatspecificiteit te bepalen4. Met het huidige protocol, en parallel met fluorescentiespectrometrie, kan in-gel fluorescentiedetectie worden gebruikt om Lnt-activiteit8 te monitoren, hoewel dit formaat niet geschikt is voor HTS. De buistest is vooral interessant voor kinetische en vergelijkende studies van Lnt-mutanten. De specificiteit van fosfolipidensubstraat kan worden aangepakt met behulp van alkynfolipiden die worden verkregen door metabole etikettering van bacteriën met alkynvetzuren die zijn samengesteld uit verschillende ketenlengten en mate van verzadiging zoals beschreven8.
Het 384 putplaatformaat is compatibel met HTS-studies omdat een significant verschil wordt waargenomen tussen actief enzym en een substraatcontrole. Een gemiddelde Z'-factor van >0,6 werd berekend met de hier gepresenteerde geoptimaliseerde omstandigheden. De hoge reproduceerbaarheid van de test draagt bij aan de hoge Z'-factor. Voor succesvolle HTS wordt een Z'-factor boven 0,6 aanbevolen9. Wasstappen zijn efficiënt met het gebruik van een geautomatiseerde platenwasser. Andere stappen kunnen verder worden geoptimaliseerd, waaronder pipetteren van reagentia, waardoor grote bibliotheken van kleine moleculen kunnen worden gescreend.
Het protocol is van toepassing op andere acyltransferasen die vetzuurbevattende substraten gebruiken als alkyngroepen compatibel zijn met substraatherkenning door het enzym. Een recente studie naar de identificatie van specifieke remmers van eukaryote Palmitoyl Acyl Transferase (PAT) beschrijft het gebruik van membraangebonden enzym en alkyne-acyl-CoA als substraat7. Palmitoylering van een klein gebiotinyleerd Ras-peptide werd waargenomen door click-chemie fluorogene detectie. Een pilotscreening in 384 putplaatformaat van deze test identificeerde specifieke remmers van PAT, wat suggereert dat substraten samengesteld uit alkynvetzuurgroep in combinatie met klikchemie en gevoelige fluorescentiedetectie een veelbelovende methode is voor doelgebaseerde HTS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Fabrice Agou en Alix Boucharlat van het Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) van Institut Pasteur Paris voor nuttige suggesties over het protocol, alle leden van de BGPB-eenheid voor ondersteuning en wetenschappelijke discussies, en Simon Legood voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk werd gefinancierd door Global Care Initiatives van het Institute Carnot Infectious diseases en het Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 en 16 CARN 0023-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
- Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L.
- Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
- Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
- Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
- Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
- Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
- Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
- Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
- Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
- Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
- Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).
