In Vivo Targeting von neuronalen Vorläuferzellen in Ferret Neocortex durch Utero Elektroporation

Nereo Kalebic; Barbara Langen; Jussi Helppi; Hiroshi Kawasaki; Wieland  B. Huttner

doi:10.3791/61171

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Methodenartikel

In Vivo Targeting von neuronalen Vorläuferzellen in Ferret Neocortex durch Utero Elektroporation

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DOI:

10.3791/61171

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6. Mai 2020

Nereo Kalebic¹^,² , Barbara Langen¹^,³ , Jussi Helppi¹ , Hiroshi Kawasaki⁴ , Wieland B. Huttner¹

¹Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, ²Human Technopole, ³Landesdirektion Sachsen, ⁴Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur genetischen Manipulation im embryonalen Frettchenhirn unter Verwendung der Utero-Elektroporation vorgestellt. Diese Methode ermöglicht die Ausrichtung von neuronalen Vorläuferzellen im Neocortex in vivo.

Zusammenfassung

Die Manipulation der Genexpression in vivo während der embryonalen Entwicklung ist die Methode der Wahl bei der Analyse der Rolle einzelner Gene während der Entwicklung von Säugetieren. In der Gebärmutterelektroporation ist eine Schlüsseltechnik für die Manipulation der Genexpression im embryonalen Säugetiergehirn in vivo. Ein Protokoll zur In-Utero-Elektroporation des embryonalen Neocortex von Frettchen, einem kleinen Fleischfresser, wird hier vorgestellt. Das Frettchen wird zunehmend als Modell für die Neocortex-Entwicklung verwendet, weil sein Neocortex eine Reihe anatomischer, histologischer, zellulärer und molekularer Merkmale aufweist, die auch bei menschlichen und nichtmenschlichen Primaten vorhanden sind, aber in Nagetiermodellen wie Maus oder Ratte fehlen. Bei der Utero-Elektroporation wurde am embryonalen Tag (E) 33, einem Midneurogenese-Stadium bei Frettchen, durchgeführt. In der Gebärmutter-Elektroporation zielt auf neuronale Vorläuferzellen, die die lateralen Ventrikel des Gehirns auskleiden. Während der Neurogenese, Diese Vorläuferzellen geben alle anderen neuronalen Zelltypen. Diese Arbeit zeigt repräsentative Ergebnisse und Analysen bei E37, Postnataltag (P) 1 und P16, entsprechend 4, 9 und 24 Tagen nach der Utero-Elektroporation. In früheren Stadien besteht die Nachkommenschaft der Zielzellen hauptsächlich aus verschiedenen neuronalen Vorläufersubtypen, während in späteren Stadien die meisten markierten Zellen postmitotische Neuronen sind. So ermöglicht die in der Utero-Elektroporation die Untersuchung der Wirkung genetischer Manipulation auf die zellulären und molekularen Merkmale verschiedener Arten von Nervenzellen. Durch seine Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen, in der Utero Elektroporation kann auch für die Manipulation von histologischen und anatomischen Merkmalen des Frettchen neocortex verwendet werden. Wichtig ist, dass alle diese Effekte akut sind und mit einer vom Benutzer bestimmten spatiotemporalen Spezifität durchgeführt werden.

Einleitung

Der Neocortex ist das äußere Blatt des Säugetier-Großhirns und der Sitz der höheren kognitiven Funktionen¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Um eine akute genetische Manipulation des Säugetierneocortex in vivo während der embryonalen Entwicklung zu erreichen, wurden zwei verschiedene Methoden untersucht: Virusinfektion⁶ und utero Elektroporation⁷. Beide Methoden ermöglichen eine effiziente Ausrichtung auf neokortikale Zellen, leiden aber unter einigen Einschränkungen. Der hauptvorteil....