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Methodenartikel

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

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DOI:

10.3791/61173

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18. Mai 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 2Lester and Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, 3Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.

Zusammenfassung

Präklinische Modelle, die Tumorheterogenität und therapeutisches Ansprechen originalgetreu rekapitulieren, sind für die translationale Brustkrebsforschung von entscheidender Bedeutung. Immortalisierte Zelllinien sind leicht zu züchten und genetisch zu modifizieren, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, aber der selektive Druck der Zellkultur führt im Laufe der Zeit oft zu genetischen und epigenetischen Veränderungen. Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) rekapitulieren die Heterogenität und Arzneimittelreaktion menschlicher Brusttumoren originalgetreu. PDX-Modelle weisen eine relativ kurze Latenz nach orthotopischer Transplantation auf, die die Untersuchung der Brusttumorbiologie und des Arzneimittelverhaltens erleichtert. Die transplantierbaren gentechnisch veränderten Mausmodelle ermöglichen die Untersuchung der Immunität von Brusttumoren. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Methode, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, gefolgt von medikamentösen Behandlungen. Diese präklinischen Modelle bieten wertvolle Ansätze zur Untersuchung der Brusttumorbiologie, der Arzneimittelreaktion, der Biomarkerentdeckung und der Mechanismen der Arzneimittelresistenz.

Einleitung

Die meisten Brustkrebstodesfälle können auf wiederkehrende Erkrankungen zurückgeführt werden, die gegen konventionelle Therapien resistent sind1,2. Die Inter- und Intratumorheterogenität von Brustkrebserkrankungen trägt zur Therapieresistenz bei. Darüber hinaus kann tumorheterogenität die genaue Prognose beeinträchtigt und das Krankheitsmanagement herausfordern3,4. Die Identifizierung prädiktiver Biomarker für das Ansprechen wird die klinischen Ergebnisse von Patientinnen mit Brustkrebs signifikant verbessern. Obwohl die meisten Brustkrebsarten immunologisch "kalte" Tumoren sind, die wahrscheinlich nicht auf eine Immuntherapie ansprechen, haben sich Immun-Checkpoint-Inhibitoren in klinischen Studienals vielversprechend erwiesen 2,5. Zum Beispiel zeigte eine Phase-III-Studie ein verbessertes krankheitsfreies Überleben (DFS) und vorläufige Beweise, dass Atezolizumab (monoklonaler Antikörper gegen PD-L1) in Kombination mit nab-Paclitaxel einen Gesamtüberlebensvorteil im Vergleich zu nab-Paclitaxel allein bei Tumoren mit ≥1% PD-L1-Färbung bieten kann6. Die Entwicklung von Therapien, die Brusttumoren für eine Immuntherapie sensibilisieren, wird die Behandlungsschemata revolutionieren.

Präklinische Modelle, die die Heterogenität und das Ansprechen von Brustkrebs beim Menschen originalgetreu rekapitulieren, sind entscheidend für die Untersuchung der Tumorbiologie und die Identifizierung potenzieller Biomarker für eine gezielte Therapie. Immortalisierte Zelllinien werden häufig für die Brustkrebsforschung verwendet, da diese Zelllinien leicht zu züchten und genetisch verändert sind, um molekulare Mechanismen zu untersuchen. Aufgrund des selektiven Drucks durch langfristige Zellkultur in vitro kann es jedoch im Laufe der Zeit zu genetischer Drift kommen und Brustkrebszelllinien können zelllinienspezifische genomische Veränderungen tragen, die sich von Aberrationen in primären Brusttumoren unterscheiden7,8,9.

Patienten-abgeleitete Xenograft (PDX) Tumorblöcke sind in der Lage, die Heterogenität der menschlichen Krankheit zu rekapitulieren, und sind histologisch und immunhistochemisch dem Tumor des Ursprungs10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Wichtig ist, dass PDX-Modelle phänotypisch stabil über mehrere Transplantationen hinweg sind, wie histologische, transkriptom-, Proteom- und genomische Analysenbelegen 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. PDX-Modelle zeigen Behandlungsreaktionen, die mit denen vergleichbarsind,die klinisch beobachtet wurden10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. PDX-Modelle für Östrogenrezeptor-positive (ER+),Progesteronrezeptor-positive (PR+),epidermale Wachstumsfaktor-2-positive (ERBB2+,HER2+)und dreifach negative Brustkrebs (TNBC) PDX-Modelle wurden etabliert und bieten eine hervorragende Plattform, um endokrine, chemo- und zielgerichtete Therapien zu testen. Ein Hauptvorbehalt der PDX-Modelle ist derzeit jedoch das Fehlen eines funktionierenden Immunsystems in der Maus.

Die gentechnisch veränderten Mausmodelle (GEMM), wie Trp53 homozygote Null-, cMyc-, Wnt1-, PyMT- oder Her2-Überexpressionsmodelle, erlauben die Untersuchung spontaner Tumorinitiation, -progression und -metastasierung im Kontext eines intakten Immunsystems. Die Tumorlatenz ist jedoch lang, was es schwierig macht, präklinische Studien mit mehreren Armendurchzuführen 30,31. GEMM kann jedoch auf syngene Wirte transplantiert werden, um eine ausreichende Anzahl von Tumoren zu erzeugen, die die menschlichen Tumoren32,33,34 ,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Zum Beispiel wurde das Brustepithel einer p53-Null-BALB / c-Maus in die gereinigten Fettpolster syngener Wildtyp-Empfängermäuse transplantiert, um Primärtumoren zu bilden, die weiter in syngene Wirte transplantiert werden können56,57. Die p53-Null-Tumoren rekapitulierten verschiedene Subtypen menschlicher Tumoren.

Die Kombination von PDX-Modellen und transplantierbarem GEMM bietet wertvolle präklinische Werkzeuge zur Untersuchung der Brusttumorbiologie, der Arzneimittelreaktion und der Antitumorimmunität. Im aktuellen Protokoll wird eine Methode der orthotopen Transplantation von PDX- und GEMM-Tumorfragmenten in das Brustfettpolster der Maus beschrieben. Diese Modelle sind für serielle Passagen geeignet und behalten in der Regel einen stabilen Phänotyp. Um das Risiko einer genetischen Drift oder eines Verlustes der Heterogenität über Passagen im Laufe der Zeit zu verringern, werden an jeder Passage mehrere Gewebefragmente für die anschließende Transplantation kryokonserviert, falls im Laufe der Zeit biologische oder morphologische Veränderungen beobachtet werden29,58.

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Protokoll

Alle Protokolle, in denen Tiere verwendet werden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) überprüft und genehmigt. Die Tumorfragmente, etwa 1-2 mm3 groß, stammen aus lebensgefrorenen Beständen, die aus dem patientenabgeleiteten Xenograft und Advanced In Vivo Models Core am Baylor College of Medicine gewonnen wurden.

1. Herstellung von kryokonservierten Brusttumorfragmenten für die Transplantation

  1. Übertragen Sie das Kryovial mit Tumorfragmenten von flüssigem Stickstoff in ein 37 °C wasserhaltiges Bad.
  2. Rühren Sie das Kryovial mit einem gelegentlichen sanften Schlag während des Auftauens.
  3. Nachdem das Gewebe aufgetaut ist, nehmen Sie das Kryovial aus dem Wasserbad und mischen Sie es durch sanfte Inversion.
  4. Trocknen Sie die Außenseite des Kryovials ab und sprühen Sie es mit 70% Ethanol. Übertragen Sie es auf eine Biosicherheitshaube.
  5. Übertragen Sie das aufgetaute Tumorgewebe in ein 15-ml-konisches Röhrchen, das mit 10 ml kaltem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gefüllt ist. Mischen Sie gut, indem Sie das Rohr umkehren. Lassen Sie die Gewebefragmente sich am Boden der Röhre absetzen.
  6. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie in 10 ml kaltem DMEM. Mischen Sie gut, indem Sie das Rohr umkehren. Lassen Sie die Gewebefragmente sich am Boden der Röhre absetzen.
  7. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie in 10 ml kaltem DMEM. Legen Sie die Röhre auf Eis.
    HINWEIS: Das Gewebe ist bereit für die Transplantation.

2. Sammlung und Vorbereitung von frischem Brusttumor für die Transplantation

  1. Euthanisieren Sie die Brusttumor tragende Maus.
    HINWEIS: PDX-Wirt können SCID/Beige-, NSG- oder NRG-weibliche Mäuse sein, während in der aktuellen Studie weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 3-5 Wochen verwendet werden.
  2. Besprühen Sie die Tumorregion der eingeschläferten Maus mit 70% Ethanol.
    HINWEIS: Versuchen Sie, Haare mit der Tumorprobe zu vermeiden, die eine Kontamination von Tumorfragmenten für Kryolager oder Transplantation verursachen könnten.
  3. Mit gezackten Zinnen, um die Haut, die den Tumor umgibt, zu kneifen und anzuheben, verwenden Sie eine Schere, um einen kurzen Schnitt zu machen.
  4. Trennen Sie den Tumor mit der Schere von der Haut, um den gesamten Tumor von der Wirtsmaus zu sezieren. Schneiden Sie das verbleibende Mausfettpolstergewebe von der äußeren Oberfläche des Tumors ab. Legen Sie den Tumor in ein 15 ml konisches Röhrchen, das mit 5 ml kaltem DMEM gefüllt ist.
    HINWEIS: Verwenden Sie Tumore mit einer maximalen Größe von 1 cm Durchmesser, da größere Tumore wahrscheinlich nekrotische Kerne enthalten.
  5. In einer Biosicherheitshaube den sezierten Tumor in eine sterile 10 cm Petrischale geben, die genügend DMEM enthält, um ein Austrocknen zu verhindern.
  6. Schneiden Sie den Tumor in 1 mm3 Fragmente mit Skalpell oder Klinge unter aseptischen Bedingungen.
    HINWEIS: Das Skalpell oder die Klinge sollte vor Gebrauch mindestens 20 Minuten lang in der Biosicherheitshaube unter UV-Strahlen ausgesetzt werden.
  7. Übertragen Sie die Tumorfragmente in ein 15 ml konisches Röhrchen, das mit kaltem DMEM gefüllt ist. Legen Sie die Röhre auf Eis.
    HINWEIS: Das Gewebe ist bereit für die Transplantation. Die sezierten Tumorfragmente aus Schritt 2.4 können 1) in flüssigem Stickstoff für die Protein- und RNA/DNA-Extraktion eingefroren, 2) mit 4% Paraformaldehyd (PFA) oder 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) für hämatoxylin und Eosin (H&E) und immunhistochemische (IHC) Analyse fixiert oder 3) in 1,25 mL Gefriermedium (10% Dimethylsulfoxid [DMSO] kryokonserviert werden, 40% DMEM und 50% fetales Rinderserum [FBS]) durch langsames Einfrieren in einem -80 °C Gefrierfach über Nacht und anschließender Übertragung auf flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung.

3. Tier auf die Operation vorbereiten

  1. Zur Schmerzbehandlung bei Tieren, subkutan Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung 60 Minuten vor der Operation in einer Dosis von 1 mg / kg injizieren oder befolgen Sie den Leitfaden der Institution für 72 Stunden Analgetikum.
  2. Richten Sie den Operationssaal nach institutionellen Richtlinien für aseptische Operationen ein.
  3. Betäuben Sie eine 4 Wochen alte Frau in einer Induktionskammer des Isofluran-Anästhesiegeräts mit einer Geschwindigkeit von ~ 11,25 ml / h. Übertragen Sie die Maus in den Eingriffsbereich, auf die sterile (Silikonkautschuk) Operationsplatte, wo sie durch eine kleine Gesichtsmaske betäubt wird. Legen Sie die Maus auf den Rücken und kleben Sie die Beine in ihren natürlichen Positionen ab.
    HINWEIS: SCID/Beige, NSG oder NRG werden für PDX und Balb/c für GEMM-Transplantationsmodelle verwendet.
  4. Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.
  5. Bestätigen Sie den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zehenklemmen.
    HINWEIS: Keine Reaktion/Bewegung des Tieres deutet darauf hin, dass das Tier ausreichend betäubt und bereit für die Operation ist.
  6. Rasieren Sie die Maus am Unterbauch, insbesondere an der Region um die vierte Brustwarze, in der die Operation stattfinden wird.
  7. Arbeiten Sie mit einer kreisförmigen Bewegung und beginnen Sie in der Mitte der Operationsstelle mit einem chirurgischen Povidon-Jod-Peeling zu den äußeren Rändern, gefolgt von der Entfernung von Povidon-Jod mit einem 70% igen Isopropyl-Ethanol-Pad. Wiederholen Sie zwei weitere Male.

4. Transplantation von Tumorfragmenten in das vierte (leistenale) Brustfettpolster

  1. Verwenden Sie einen sterilen chirurgischen Vorhang, um den Körper des Tieres mit Ausnahme der Schnittstelle zu bedecken.
    HINWEIS: Bestätigen Sie den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zehenklemmen, bevor Sie den Schnitt machen.
  2. Mit gezackter Zette die Haut an der Brustwarze Nr. 4 zusammendrücken und anheben.
  3. Mit der stumpfen Seite nach unten, verwenden Sie eine Schere, um einen kurzen (ca. 1 cm), parasagittalen Schnitt von der Brustwarze Nr. 4 in Richtung Kopf zu machen.
  4. Trennen Sie mit einem Applikator mit Baumwollspitze die Haut vom Peritoneum auf der medialen Seite des Schnitts.
  5. Während Sie die seitliche Seite des Schnitts halten, schälen Sie das Brustfettpolster Nr. 4 vorsichtig mit demselben Tupfer von der Haut.
  6. Sobald das Fettpolster getrennt ist, fixieren Sie die Haut mit einer 27 G-Nadel in der Nähe des Körpers des Tieres.
  7. Wenn es experimentell notwendig ist, das Fettpolster des endogenen Maus-Brustepithels zu befreien, führen Sie die folgenden Schritte durch.
    1. Mit der gezackten Zette das Fettpolster vorsichtig vom Körper wegstrecken und den Leistenlymphknoten lokalisieren, der sich unter den Schnittpunkten der Hauptgefäße in der Drüse befindet (in der Nähe der Stelle, an der die Zette die Drüse hält).
    2. Kauterisieren Sie vorsichtig die Gefäße medial zum Lymphknoten und das Fett, das das vierte und fünfte Fettpolster bildet, das einen dreieckigen Bereich bildet.
      HINWEIS: Schalten Sie die Sauerstoffquelle für diesen Schritt vorübergehend aus.
    3. Schneiden Sie mit einer Mikrodynezierungsschere jedes kauterisierte Gefäß einzeln ab (um sicherzustellen, dass nach jedem Schnitt keine Blutungen auftreten), bis der Abschnitt des Fettpolsters, der den Lymphknoten enthält, entfernt ist.
    4. Entsorgen Sie das "gereinigte" Fettpolstergewebe.
  8. Halten Sie das vierte Brustfettpolster mit einer stumpfen Trennzette. Mit der anderen Hand die geschlossene Spitze der abgewinkelten Feinzette in die Mitte des Fettpolsters über dem verbleibenden Gefäß und nahe an der Wand des Peritoneums einführen. Öffnen Sie langsam die Zette, um eine kleine Tasche zu machen. Entfernen Sie die abgewinkelte feine Zette aus dem Fettpolster.
  9. Nehmen Sie mit der abgewinkelten feinen Zette ein Stück Tumorfragment und führen Sie es in die Tasche ein.
  10. Öffnen Sie langsam die Zettenspitzen, um das Tumorfragment in die Fettpolstertasche freizusetzen.
  11. Ziehen Sie die abgewinkelte feine Truppe vorsichtig zurück.
    HINWEIS: Schauen Sie sich die Tasche an, um zu bestätigen, dass das Tumorfragment in der Tasche des Brustfettpolsters verbleibt, wenn Sie die Zette zurückziehen. Tumore können in beide kontralateralen Fettpolster implantiert werden, wenn überschüssiges Tumorgewebe für Experimente oder Banking benötigt wird. Tiere mit doppelseitigen Transplantationen werden wegen bekannter Wechselwirkungen zwischen kontralateralen Tumoren nicht für Behandlungsstudien empfohlen. Alternativ kann ein Trokargerät für den Implantationsprozess verwendet werden.
  12. Ausgehend von der Basis des Schnitts die Haut auf jeder Seite mit der Klaue und der gezackten Zette sammeln. Bringen Sie die beiden Seiten zusammen und heben Sie sie leicht an, um die Haut auf die Anwendung des Wundclips vorzubereiten. Entkrümmen Sie die Kanten des Einschnitts mit der Klauenzette und kneifen Sie die Kanten zusammen, um oben eine durchgehende Oberfläche zu bilden.
  13. Halten Sie die beiden Seiten mit einer gezackten Zette zusammen und verwenden Sie den Wundclip-Applikator, um einen Wundclip in der Mitte des Schnitts zu platzieren. Tragen Sie bei Bedarf Gewebekleber an den Enden des Schnitts auf, um sie geschlossen und gesichert zu halten.
  14. Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig, der sich auf einer wärmenden Oberfläche befindet. Überwachen Sie auf Blutungen, Anzeichen von Dehiszenz und Schmerzen während der postoperativen Phase. Das Tier sollte innerhalb von Minuten nach der Chirurgie aufstehen und sich bewegen.
  15. Achten Sie mindestens 3 Tage nach der Operation genau auf die Inzisionsstelle und die allgemeine Gesundheit der Tiere. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Schmerzbehandlung.
  16. Reinigen Sie die chirurgischen Werkzeuge für 10 s in einem Glasperlensterilisator, bevor Sie mit der nächsten Transplantation fortfahren. Warten Sie, bis die Werkzeuge vor der Verwendung abgekühlt sind.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 4.1−4.15, bis alle Mäuse transplantiert sind.
    HINWEIS: Östrogen-Supplementierung ist für ER+ Tumore erforderlich, die durch Wasser oder langsam freisetzenden Pellets59zugeführt werden können.

5. Überwachung des Tumorwachstums als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung

HINWEIS: Tastbare Tumoren etablierter transplantierbarer PDXs und p53-Null-Tumoren brauchen zwischen 2 Wochen und 8 Wochen, um sich nach der Operation zu entwickeln, abhängig von den intrinsischen Tumorwachstumsraten.

  1. Messen Sie Tumore in zwei Dimensionen mit Bremssätteln zweimal pro Woche. Berechnen Sie das Volumen mit der Formel:
    Tumorvolumen (mm3) = B2 x L/2
    wobei W die Breite und L die Länge des Tumors ist.
  2. Beginnen Sie mit der medikamentösen Behandlung, wenn das Tumorvolumen 150-300 mm3erreicht.
    HINWEIS: Abhängig von der Eigenschaft der Medikamente kann mundgeschützte oder intraperitoneale Injektion verwendet werden, um die Medikamente zu verabreichen.
  3. Sammeln Sie Tumorproben und führen SieIHC-Färbung 60,Protein- und RNA / DNA-Isolierung und Immunphänotypisierung61 für verschiedene Zwecke durch. Sammeln Sie Blut und führen Sie eine Immunphänotypisierung durch oder verwenden Sie es für pharmakokinetische / pharmakodynamische Studien.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Ausrüstung (Abbildung 1A) und die wichtigsten Verfahren (Abbildung 1B) der orthotopischen Transplantation. Abbildung 2 zeigt die Charakterisierung eines transplantierten PDX-Tumors (MC1). Tumorfragmente (1 mm3) des MC1-Modells wurden in das Fettpolster Nr. 4 von SCID/Beige-Mäusen transplantiert. Einen Mon...

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Diskussion

Um Variationen im Tumorwachstum bei Tieren zu reduzieren, ist es wichtig, das Tumorgewebe für die Transplantation in 1 mm3 Fragmente zu schneiden. Modelle, bei denen Weichgewebe wachsen, sind schwieriger zu bearbeiten und die Tumorfragmente müssen etwas größer geschnitten werden (1−2 mm3). Wenn Sie das Gewebe in die Brustfettpolstertasche legen, achten Sie darauf, das Gewebe nicht in mehrere Stücke zu spalten, da dies zu mehreren kleinen Tumoren oder seltsam geformten Tumoren führt.

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Offenlegungen

MTL ist Gründer einer Kommanditgesellschaft in StemMed, Ltd. und Gründer und Manager von StemMed Holdings, deren Komplementärin. MTL ist Gründer und Anteilseigner von Tvardi Therapeutics, Inc. LED ist ein entschädigter Mitarbeiter von StemMed, Ltd.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von den National Institutes of Health (R37CA228304 und R01HL146642 bis Xi Chen, CA148761 an Jeffrey M. Rosen), dem US Department of Defense (W81XWH-19-1-0524 an Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 an Xiangdong Lv), der American Cancer Society (RSG-18-181-01-TBE an Xi Chen) und dem Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award an Xi Chen), der Patient-Derived Xenograft and Advanced In Vivo Models Core am Baylor College of Medicine (Finanzierung durch RP170691 CPRIT Core Facility Award und NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mg/ml Buprenorphin-SRZooPharm (über BCM-Tierärzte)Sterile
26G-SpritzeBD148232ESteriles
Betadin-PeelingFisher19-027132
WattestäbchenVWR International Laboratory89031-272Steriles
DMEMFisherMT 10-013-CMSteril
Elektrisch RasiererOster78005-050
Glasperlen-Sterilisator (Germinator)Roboz Surgical StoreDS-401
Gleitmittel AugensalbeAkorn Animal Health17478-062-35
Mikro-Präparierzange; Gezackt, eckig (normale Pinzette)Roboz Surgical StoreRS-5139Sterile
Mikro-Präparierfederschere (Fettpolsterschneider)Roboz Surgical StoreRS-5658BTSterile
Mikrozange (Gewebeeinlegezange)Roboz Surgical StoreRS-5069Sterile
PetrischaleFisher08-757- 100DSterile
sterile AbdecktücherSai InfusionstechnologiePSS-SD1für die sterile
ChirurgieRoboz Surgical StoreRS-5960Sterile
Gewebezange (Klauenzange)Roboz Surgical StoreRS-5158Sterile
Wundclip-ApplizierungBD Autoclip Wundsystem01-804Sterile
Wundclip-EntfernerBD Autoclip Wundsystem01-804-15Steril
WundclipsBD Autoclip Wound System01-804-5Steril
Schere

Referenzen

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