Überwachtes maschinelles Lernen zur Semiquantifizierung der extrazellulären DNA bei Glomerulonephritis

Summary

Extrazelluläre DNA (ecDNA), die während des Zelltodes freigesetzt wird, ist proinflammatorische und trägt zu Entzündungen bei. Die Messung von ecDNA an der Verletzungsstelle kann die Wirksamkeit der therapeutischen Behandlung im Zielorgan bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines Machine Learning-Tools zur Automatisierung der Messung von ecDNA im Nierengewebe.

Abstract

Der Glomeruläre Zelltod ist ein pathologisches Merkmal der Myeloperoxidase anti neutrophilen zytoplasmatischen Antikörperassoziierten Vaskulitis (MPO-AAV). Extrazelluläre Desoxyribonukleinsäure (ecDNA) wird bei verschiedenen Formen des Zelltodes freigesetzt, einschließlich Apoptose, Nekrose, Nekroptose, neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und Pyroptose. Die Messung dieses Zelltodes ist zeitaufwändig, wobei mehrere verschiedene Biomarker erforderlich sind, um die verschiedenen biochemischen Formen des Zelltodes zu identifizieren. Die Messung von ecDNA wird in der Regel in Serum und Urin als Ersatz für Nierenschäden durchgeführt, nicht im eigentlichen Zielorgan, wo die pathologische Verletzung auftritt. Die aktuelle Schwierigkeit bei der Untersuchung von ecDNA in der Niere ist das Fehlen von Methoden für formalin fixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe (FFPE) sowohl experimentell als auch in archivierten menschlichen Nierenbiopsien. Dieses Protokoll bietet eine Zusammenfassung der Schritte, die erforderlich sind, um für ecDNA in FFPE-Gewebe (sowohl menschliche als auch murine), abschrecken Autofluoreszenz und messen die ecDNA in den resultierenden Bildern mit einem Machine Learning-Tool aus der öffentlich verfügbaren Open-Source-ImageJ-Plugin trainable Weka Segmentierung. Die trainierbare Weka-Segmentierung wird auf ecDNA innerhalb der Glomeruli angewendet, wo das Programm lernt, ecDNA zu klassifizieren. Dieser Klassifizierer wird auf nachfolgende erworbene Nierenbilder angewendet, wodurch die Notwendigkeit manueller Anmerkungen für jedes einzelne Bild reduziert wird. Die Anpassungsfähigkeit der trainierbaren Weka-Segmentierung wird weiter im Nierengewebe von experimenteller muriner Anti-MPO-Glomerulonephritis (GN) nachgewiesen, um NETs und ecMPO, häufige pathologische Mitwirkende an Anti-MPO GN, zu identifizieren. Diese Methode bietet eine objektive Analyse von ecDNA im Nierengewebe, die die Wirksamkeit deutlich zeigt, in der das trainierbare Weka-Segmentierungsprogramm ecDNA zwischen gesundem normalem Nierengewebe und krankem Nierengewebe unterscheiden kann. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um ecDNA, NETs und ecMPO in anderen Organen zu identifizieren.

Introduction

Myeloperoxidase anti neutrophile zytoplasmatische Antikörper assoziierte Vaskulitis (MPO-AAV) ist eine Autoimmunerkrankung, die zu Nierenversagen von pathologischen glomerulären Verletzungen mit erheblichem Zelltod und Freisetzung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)^1,2führt. DNA kann das Immunsystem aktivieren, indem sie als Gefahrensignal fungiert. Unter normalen gesunden Bedingungen bietet die nukleare Lage der DNA Schutz vor der Exposition gegenüber dem Immunsystem. Selbst-DNA, die extrazellulär während entweder pathogener Prozesse oder Autoimmunität freigesetzt wird, wird vom Immunsystem als eine potente proi....

Protocol

Diese Methode ermöglicht die Detektion von Pan ecDNA aus allen Formen des Zelltodes. Die gleiche Methode und Antikörper werden für menschliches Nierenbiopsiegewebe verwendet (ab Schritt 4). Alle tierischen und menschlichen Probanden hatten die Ethik-Zulassung von der Monash University und Monash Health, Clayton, Victoria, Australien.

1. Färbung für ecDNA mit DAPI und A-Actin

1. Induzieren Sie ein 20-Tage-Modell der Anti-Myeloperoxidase Glomerulonephritis (Anti-MPO-GN) in 8-10 Wochen alten C57/Bl6 Mäusen, mit Kontrollen⁹.
   1. Euthanisieren Sie Mäuse human mit einer_CO2-Kammer.
   2. Entfernen....

Results

Diese Bilder stellen die verschiedenen Schritte dar, die erforderlich sind, um die trainierbare Weka-Segmentierung erfolgreich zu verwenden, um die arbeitsintensive manuelle Messung von ecDNA in fluoreszierend gefärbtem FFPE-Nierengewebe von einer Maus mit induziertem Anti-MPO GN zu minimieren. Diese Schritte sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 mit Bildern zusammengefasst, die direkt aus dem Weka-Segmentierungsprogramm aufgenomme.......

Discussion

Es gibt mehrere Protokolle, die proinflammatorische Marker im Serum und Urin von Patienten und Mausmodellen der Glomerulonephritis messen. Dieses beschriebene Protokoll ermöglicht die direkte Analyse der Produkte des Zelltodes (ecDNA, NETs und ecMPO) innerhalb des Glomerulus. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die Gewebevorbereitung und -bildgebung. Das wichtigste einschränkende Element der Verwendung einer fluoreszierenden Färbungsmethode für die Analyse ist die Gewebe-Autofluoreszenz. Formalin fixiertem .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rinderserumalbumin	SIGMA	A2153	5%ige und 1%ige Lösungen werden in PBS hergestellt, können in loser Schüttung hergestellt und eingefroren werden - nach dem Auftauen entsorgt.
Hühnchen-Anti-Ziegen-IgG (H+L) kreuzabsorbierter Antikörper Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Schleudern Sie die Mini-Zentrifuge 1 Minute vor der Verwendung, um ein freies Konjugat in Ihrem Antikörper-Cocktail zu vermeiden
Hühnchen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzabsorbierter Antikörper, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Schleudern Sie die Mini-Zentrifuge 1 Minute vor der Verwendung, um ein freies Konjugat in Ihrem Antikörpercocktail
zu vermeidenHuhn Anti Kaninchen IgG (H+L) Kreuzabsorbierter Antikörper Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	Schleudern Sie die Mini-Zentrifuge 1 Minute vor der Verwendung, um freies Konjugat in Ihrem Antikörpercocktail zu vermeiden
Hühnchen-Sera	SIGMA	C5405	Hergestellt aus 1%BSA/PBS
Deckgläser 24 x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 Dies ist keine Standarddicke - entwickelt für die Verwendung in der konfokalen Mikroskopie
EDTA 10mM	SIGMA	E6758	TRIS und EDTA zusammen in destilliertem Wasser und einem pH-Wert von 9 für die Antigengewinnung zugeben, kann in einer 10x Lösung hergestellt werden
Ethanol 30%, 70% und 100	Chem Lieferung	UN1170	Lieferung als 100% unvergälltes Ethanol - verdünnen auf 30% und 70% mit destilliertem Wasser
Formaldehyd, 4% (10% neutrales gepuffertes Formalin)	TRAJAN	NBF-500	Die Niere wird 16 Stunden lang bei RT in ein 5-ml-Röhrchen mit 3 ml Formalin gegeben, Formalin sollte in einem Abzug verwendet werden
Histologie-Objektträger aus Glas - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1,0 mm	TRAJAN	J3800AM4	Die Verwendung von positiv geladenen beschichteten Objektträgern ist unerlässlich. Wir empfehlen nicht, Poly-L-Lysin für die Beschichtung von Objektträgern zu verwenden, da sich Gewebe während des Antigen-Entnahmeschritts von den Objektträgern löst
Ziege Anti-Mensch/Maus MPO-Antikörper	R& D	AF3667	Aliquot und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Histosol	Clini Pure	CPL HISTOSOL 08	Wird pur verwendet, in 200 ml Färberack-Behältern, in einem Abzug
verwenden Hydrophober Stift	VECTOR Labs	H-400	Verwenden, um einen Kreis um das Nierengewebe zu zeichnen
Maus Anti-Mensch/Maus Peptidylarginase 4 (PAD4)	ABCAM	ab128086	Aliquot und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Nikon C1 konfokaler Scanning-Laserkopf, der an Nikon Ti-E inverses Mikroskop befestigt	Kohärent Wissenschaftlich		Aliquot und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	SIGMA	P38135	0,01 M PB / 0,09 % NaCl Make up 5 L
Schnellkochtopf 6 L Tefal Secure 5 Neo Edelstahl	Tefal	GSA-P2530738	Gekauft im örtlichen Haushaltswarengeschäft
Prolong Gold DAPI	Life Technologies	P36962	Tropfen direkt auf das Deckglas auftragen
Kaninchen Anti-Mensch/Maus Beta Aktin Antikörper	ABCAM	ab8227	Aliquot und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Kaninchen Anti Mensch/Maus H3Cit Antikörper	ABCAM	ab5103	Aliquot und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Färbegestell 24 Objektträger	ProScitech	H4465	Das gewählte Färbegestell muss in der Lage sein, dem Sieden unter Druck und der Inkubation im 60-Grad-Ofen standzuhalten
Sudan Black B	SIGMA	199664	0,3% Geben Sie 3 g in eine 1-Liter-Flasche in 70 % Ethanol, filtrieren Sie und schützen Sie es vor dem Licht - 6 Monate bei Raumtemperatur
stabil Tris 10mM	SIGMA	T4661	TRIS und EDTA zusammen in destilliertem Wasser und pH-Wert auf 9, zur Antigenrückgewinnung, kann in einer 10-fachen Lösung hergestellt werden
Xylol	Trajan	XL005/20	Muss in einem Abzug verwendet werden