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Methodenartikel

Überwachtes maschinelles Lernen zur Semiquantifizierung der extrazellulären DNA bei Glomerulonephritis

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DOI:

10.3791/61180

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18. Juni 2020

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Extrazelluläre DNA (ecDNA), die während des Zelltodes freigesetzt wird, ist proinflammatorische und trägt zu Entzündungen bei. Die Messung von ecDNA an der Verletzungsstelle kann die Wirksamkeit der therapeutischen Behandlung im Zielorgan bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines Machine Learning-Tools zur Automatisierung der Messung von ecDNA im Nierengewebe.

Zusammenfassung

Der Glomeruläre Zelltod ist ein pathologisches Merkmal der Myeloperoxidase anti neutrophilen zytoplasmatischen Antikörperassoziierten Vaskulitis (MPO-AAV). Extrazelluläre Desoxyribonukleinsäure (ecDNA) wird bei verschiedenen Formen des Zelltodes freigesetzt, einschließlich Apoptose, Nekrose, Nekroptose, neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und Pyroptose. Die Messung dieses Zelltodes ist zeitaufwändig, wobei mehrere verschiedene Biomarker erforderlich sind, um die verschiedenen biochemischen Formen des Zelltodes zu identifizieren. Die Messung von ecDNA wird in der Regel in Serum und Urin als Ersatz für Nierenschäden durchgeführt, nicht im eigentlichen Zielorgan, wo die pathologische Verletzung auftritt. Die aktuelle Schwierigkeit bei der Untersuchung von ecDNA in der Niere ist das Fehlen von Methoden für formalin fixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe (FFPE) sowohl experimentell als auch in archivierten menschlichen Nierenbiopsien. Dieses Protokoll bietet eine Zusammenfassung der Schritte, die erforderlich sind, um für ecDNA in FFPE-Gewebe (sowohl menschliche als auch murine), abschrecken Autofluoreszenz und messen die ecDNA in den resultierenden Bildern mit einem Machine Learning-Tool aus der öffentlich verfügbaren Open-Source-ImageJ-Plugin trainable Weka Segmentierung. Die trainierbare Weka-Segmentierung wird auf ecDNA innerhalb der Glomeruli angewendet, wo das Programm lernt, ecDNA zu klassifizieren. Dieser Klassifizierer wird auf nachfolgende erworbene Nierenbilder angewendet, wodurch die Notwendigkeit manueller Anmerkungen für jedes einzelne Bild reduziert wird. Die Anpassungsfähigkeit der trainierbaren Weka-Segmentierung wird weiter im Nierengewebe von experimenteller muriner Anti-MPO-Glomerulonephritis (GN) nachgewiesen, um NETs und ecMPO, häufige pathologische Mitwirkende an Anti-MPO GN, zu identifizieren. Diese Methode bietet eine objektive Analyse von ecDNA im Nierengewebe, die die Wirksamkeit deutlich zeigt, in der das trainierbare Weka-Segmentierungsprogramm ecDNA zwischen gesundem normalem Nierengewebe und krankem Nierengewebe unterscheiden kann. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um ecDNA, NETs und ecMPO in anderen Organen zu identifizieren.

Einleitung

Myeloperoxidase anti neutrophile zytoplasmatische Antikörper assoziierte Vaskulitis (MPO-AAV) ist eine Autoimmunerkrankung, die zu Nierenversagen von pathologischen glomerulären Verletzungen mit erheblichem Zelltod und Freisetzung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)1,2führt. DNA kann das Immunsystem aktivieren, indem sie als Gefahrensignal fungiert. Unter normalen gesunden Bedingungen bietet die nukleare Lage der DNA Schutz vor der Exposition gegenüber dem Immunsystem. Selbst-DNA, die extrazellulär während entweder pathogener Prozesse oder Autoimmunität freigesetzt wird, wird vom Immunsystem als eine potente proinflammatorische Schädigung assoziierter molekularer Selbstprotein (DAMP)3gesehen. Extra zelluläre DNA (ecDNA) wird aus sterbenden Zellen durch mehrere verschiedene Mechanismen freigesetzt, die durch verschiedene biochemische Bahnen gesteuert werden, wie Apoptose, Nekrotophile extrazelluläre Trapbildung (NETs), Nekrose oder Pyroptose4,5,6,7,8.

Wir beschreiben hierin Methoden zur Färbung und Messung von ecDNA, die aus sterbenden Zellen in Abschnitten von formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Nieren von experimentellen Anti-MPO-GN- und Nierenbiopsien von Patienten mit MPO-AAV9,10freigesetzt werden. Es gibt mehrere Methoden zum Nachweis von zirkulierender doppelsträngiger DNA (dsDNA) und DNA-Komplexen aus Serum und Urin sowie aus In-vitro-Assays11,12. Diese Methoden, obwohl genau bei der Bestimmung der Menge an ecDNA, bestimmen nicht, wo die ecDNA anatomisch freigesetzt wird. Es gibt Methoden, die spezifische Messung von ecDNA wie Tunel für Apoptose und Messung von Zellablagerungen13,14beschreiben. Es gibt keine Methode, die die Messung von ecDNA beschreibt, die aus allen Formen des Zelltodes in FFPE-Nieren gegipfelt, wo die pathologische Schädigung auftritt. Dies ist wichtig, um festzustellen, ob experimentelle therapeutische Behandlungen die ecDNA von den Stellen der pathologischen Verletzung im eigentlichen Zielorgan löschen.

Die Erfassung mehrerer Bilder aus Nierenproben erzeugt ein hohes Datenvolumen, das häufig von einem einzelnen Benutzer analysiert wird. Dies ist arbeitsintensiv, zeitaufwändig und kann aufgrund von Voreingenommenheit des Benutzers einer unzuverlässigen Reproduzierbarkeit durch andere Benutzer unterliegen. Trainable Weka Segmentierung ist ein Open-Source-Software-Plugin für ImageJ, das modernste bioinforschende Werkzeuge verwendet, um Pixel mit Machine Learning-Algorithmen15,16zu klassifizieren. Diese Methode ist "trainierbar", wobei sie aus der Klassifizierung von Pixelsegmenten des Benutzers lernt und die neu gelernte Klassifizierung auf andere Bilder anwendet. Diese Methode basiert auf gängigen Analysewerkzeugen innerhalb des ImageJ-Programms, die verwendet werden, um jedes Pixel in einem Segment als zu einer bestimmten "Klasse" gehörend zu "klassifizieren". Sobald das Programm die "Klassifikatoren" erlernt hat, können sie verwendet werden, um andere ähnliche klassifizierte Segmente innerhalb desselben Bildes zu identifizieren. Dieses Modell wird dann gespeichert und auf andere Bildsätze innerhalb desselben Experiments angewendet.

Aktuelle Hindernisse bei der Bestimmung von ecDNA in situ in Nierenabschnitten ist die endogene Autofluoreszenz durch Fixierung im Formalin und die arbeitsintensive Analyse der Bilder. Wir beschreiben hier, wie diese Autofluoreszenz zu löschen, zu erkennen ecDNA, und verwenden überwachtes maschinelles Lernen für hohe Durchsatzmessung von ecDNA. Wir haben bereits die Messung von NETs und extrazellulärem MPO (ecMPO) mit einem Makro in ImageJ veröffentlicht, wir demonstrieren jetzt die Halbautomatisierung dieser Methoden mit überwachtem maschinellem Lernen1. Wir zeigen die Anpassungsfähigkeit des Machine Learning Tools, um einen alternativen Fleck für NETs und ecMPO innerhalb desselben Bildes zu klassifizieren. Diese hier beschriebenen Färbemethoden zum Nachweis von ecDNA, NETs und ecMPO können in andere feste Organe und Krankheiten übersetzt werden, bei denen ecDNA, NETS und ecMPO eine Rolle bei der Aufrechterhaltung von Krankheiten wie rheumatoider Arthritis und Lupus17,18spielen.

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Protokoll

Diese Methode ermöglicht die Detektion von Pan ecDNA aus allen Formen des Zelltodes. Die gleiche Methode und Antikörper werden für menschliches Nierenbiopsiegewebe verwendet (ab Schritt 4). Alle tierischen und menschlichen Probanden hatten die Ethik-Zulassung von der Monash University und Monash Health, Clayton, Victoria, Australien.

1. Färbung für ecDNA mit DAPI und A-Actin

  1. Induzieren Sie ein 20-Tage-Modell der Anti-Myeloperoxidase Glomerulonephritis (Anti-MPO-GN) in 8-10 Wochen alten C57/Bl6 Mäusen, mit Kontrollen9.
    1. Euthanisieren Sie Mäuse human mit einerCO2-Kammer.
    2. Entfernen Sie die Nieren, indem Sie einen vorderen Mittellinienschnitt durch die Haut mit einer Schere machen, und schneiden Sie dann vorsichtig das Peritoneum und stecken Sie wieder auf einem Sezierbrett. Mit Zangen schieben Sie die vordere Nierenfaszie und das parietale Peritoneum beiseite und schneiden Sie die Niere frei, indem Sie den Harnleiter und die Blutgefäße (Nierenarterie und Vene) am Nierenbecken abtrennen. Mit Zangen entfernen und Nieren halbieren (sagittale Ebene) mit einem Skalpell der Größe 22.
    3. Die Niere 16 Stunden bei Raumtemperatur (RT) fixativ (4% gepuffertes Formalin) aufstellen. Entfernen und einweichen feste Niere in 30% Ethanol für 24 Stunden vor der Verarbeitung.
  2. Verarbeiten Sie Nieren mit einem Standard 6-Stunden-Zyklus:
    70% Ethanol für 15 min
    90% Ethanol für 15 min
    100% Ethanol für 15 min
    100% Ethanol für 20 min
    100% Ethanol für 25 min
    100% Ethanol für 30 min
    Xylol für 20 min
    Xylol für 30 min
    Xylol für 40 min
    Wachs für 30 min
    Wachs für 35 min
    Wachs für 40 min
    HINWEIS: Dies ist wichtig, da Nieren nicht einer längeren Hitzeexposition im Wachs ausgesetzt werden sollten, da es Antigene von Interesse zerstören kann.
  3. Schneiden Sie 3 m Abschnitte auf einem Mikrotome und montieren Sie auf handelsüblichen Glasmikroskopschlitten, die mit einer positiven Ladung beschichtet sind. Über Nacht trocknen lassen.
  4. Glasrutschen in einen Schiebeträger in einen 60 °C-Ofen für 60 min geben.
    HINWEIS: Die Schritte 1.3 und 1.4 sind entscheidend, um sicherzustellen, dass Abschnitte während des Antigen-Abrufschritts nicht abschwimmen.
  5. Tauchen Sie in zwei Wechsel des Lösungsmittels (Xylol oder Ersatz) für jeweils 40 min, in einer Dunstabzugshaube.
  6. Rehydratginginginiert in 100% Ethanol, 100% Ethanol, 70% Ethanol für je 5 min. 5 min in Leitungswasser waschen.
  7. Legen Sie eine Kochplatte in eine Dunstabzugshaube und Preboil Antigen Retrieval Lösung (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) in einem Schnellkochtopf. Sobald die Antigen-Retrieval-Lösung zu kochen beginnt, legen Sie die Dias horizontal mit einer Zange in den Topf und verriegeln Sie den Deckel. Kochen sie auf hoch (entspricht 15 psi oder 103 kPa) für 10 min.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, da er das Antigen von Interesse abruft, indem es das Antigen-Epitop (kreuz verbunden über formalin fixation) entlarvt, um eine epitop-antikörperspezifische Bindung zu ermöglichen, ohne die anschließende Färbung nicht funktionieren wird.
  8. Entfernen Sie den Schnellkochtopf von der Hitze und entfernen Sie den Deckel sofort, indem Sie kalten Wasserhahn auf dem Deckel in einem Waschbecken laufen lassen. Lassen Sie die Dias für 20 min in der Antigen-Retrieval-Lösung ausdemieren.
  9. Spülen Sie zweimal für 5 min in 0,01 M Phosphat gepufferte Saline (PBS) (pH 7.4) auf einem Orbitalshaker.
  10. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um Kreise um das Nierengewebe zu ziehen, wobei darauf geachtet wird, dass in dieser Zeit kein Gewebe austrocknet.
  11. Blockgewebe in 10% Hühnersera in 5% Rinderserumalbumin (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) für 30 min, 60 l pro Abschnitt. Nach diesem Schritt nicht waschen, aber vorsichtig die Blockierlösung mit einer 60-L-Pipette entfernen, die Abschnitte nicht austrocknen lassen.
  12. Primäre Antikörper-Cocktail für 1/1000 in 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 l pro Abschnitt und über Nacht in einer Feuchtekammer bei 4 °C inkubieren.
  13. Zweimal für 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) auf einem Orbital-Shaker gleitet.
  14. Sekundärantikörper, Hühnerantikaninchen 488 (1/200), 60 l pro Abschnitt in 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) verdünnt, 40 min bei RT auftragen.
  15. Waschen Sie die Dias zweimal für 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) auf einem Orbital-Shaker.
  16. Tauchen Sie die Dias in 0.3% Sudan Black in 70% Ethanol für 30 min in einem Coplin Glas ein.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, da er die durch formale Fixierung verursachte Autofluoreszenz löscht.
  17. Waschen Sie die Dias in Leitungswasser, um Niederschlag zu entfernen, und tauchen Sie dann 10 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) ein, um weitere Sudan Black Niederschlagbildung zu verhindern.
  18. Schieben Sie die Schlitten auf konfokale Glasabdeckungen mit drei 60-L-Tropfen Montagelösung mit DAPI und versiegeln Sie die Abdeckungen mit Nagellack, indem Sie den Umfang des Deckels auftragen.
  19. Lassen Sie die Dias 24 Stunden lang bei RT aushärten (damit DAPI eindringen kann) und lagern Sie sie dann bei 4 °C, die vor Licht geschützt sind.
    HINWEIS: Wichtig, im Dunkeln zu bleiben, um das Ausbleichen von fluoreszierenden Sonden zu verhindern.
  20. Bilddiaber mit einem konfokalen Laser-Scanning-Kopf, der an einem Mikroskop befestigt ist. Excite Dias mit dem 405 Laser für DAPI und dem 488 Laser für Beta Actin. Erfassen Sie 1024 x1024 Pixel-Bilder mit einer einzigen Ebene, indem Sie zeilensequendes Erfassen und 4-Linien-Mittelung verwenden, was für die Erkennung von ecDNA unerlässlich ist. 40x 1.0 NA Ölobjektiv verwendet wird.
    1. Bild ein Minimum von 20 Glomeruli pro Probe. Speichern Sie Bilder als ND2-Dateien.

2. DAPI- und A-Actin-Analyse

  1. Installieren Sie ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Überprüfen Sie, ob die trainierbare Weka-Segmentierung unter Plugins verfügbar ist | Segmentierung | Trainable Weka Segmentierung.
  3. Legen Sie das Bild auf die ImageJ-Symbolleiste. Klicken Sie auf Bild | Farbe | Split Kanäle. Es erscheint ein Bild mit DAPI in blauer Färbung aller Kerne und 1 Bild mit dem '-Actin in grün, das die Glomeruli umfängst.
    1. Erstellen Sie eine zusammengeführte Datei der einzelnen Bilder, um eine Region von Interesse (ROI) für den Glomerulus zu zeichnen, indem Sie auf Farbe | Merge-Kanäle. In einem Popup-Feld wird darum gebeten, jedem Kanal eine Farbe zuzuweisen. Nachdem Sie jedem Kanal eine Farbe zugewiesen haben, aktivieren Sie das Feld Composite erstellen und das Feld Quellbilder beibehalten, und klicken Sie auf Ok. Ein zusammengeführtes zusammengesetztes Bild wird angezeigt.
    2. Zeichnen Sie einen ROI um den glomerulären Büschel, indem Sie die Färbung von '-actin als Leitfaden verwenden. Bewahren Sie dieses Bild beiseite, um den ROI am Ende dieses Protokolls zu verwenden.
  4. Führen Sie eine Gaußsche Unschärfe auf dem einzelnen blauen DAPI-Bild aus. Klicken Sie auf Prozess | Filter | Gaußsche Unschärfe, setzen Sie in 1-2.00. Das Bild sieht nun etwas verschwommen aus, aber die Kerne sind nun glatt und der Hintergrund aufgeweicht.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist vorgeformt, um Rauschen zu entfernen, um das Bild von Artefakten zu bereinigen, die eine relevante Erkennung von Bildattributen verhindern können, die analysiert werden.
  5. Klicken Sie auf Plugins | Segmentierung | Trainable Weka Segmentierung.
  6. Verfolgen Sie mit dem Linienwerkzeug auf der Werkzeugleiste in ImageJ zunächst intakte Kerne mit den Freien Handwerkzeugen (es stehen Linien-, Kreis- und quadratische Werkzeugoptionen zur Auswahl) und fügen Sie dann dem Feld Klasse 1 hinzufügen hinzu.
  7. Mit dem Linienwerkzeug auf der Werkzeugleiste in ImageJ zeigen Sie Die Hintergründe an das Feld Klasse 2.
  8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Klasse erstellen im Weka-Segmentierungsfenster und beschriften Sie "ecDNA". Verwenden Sie das Linienwerkzeug (aus der ImageJ-Werkzeugleiste), um die von DAPI gebeizte extranukleare DNA zu abbilden.
  9. Klicken Sie im Trainingsmenü im zugfähigen Weka-Segmentierungsfenster auf den Button Zugklassifier.
    HINWEIS: Die STOP-Taste wird anstelle der Schaltfläche Zugklassifier angezeigt und bleibt, bis das Training abgeschlossen ist. Klicken Sie während des Trainings nicht auf diese Schaltfläche, da der Prozess unterbrochen wird.
  10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ergebnis erstellen, um ein Bild mit allen klassifizierten Komponenten zu erstellen, die aus intakten Kernen, dem Hintergrund und der identifizierten ecDNA bestehen.
  11. Klicken Sie auf die Schaltfläche Wahrscheinlichkeit abrufen. Schalten Sie die Maus um, um ein Schwarzweißbild aller Klassen mit dem weiß hervorgehobenen Auswahlobjekt zu geben.
  12. Duplizieren Sie dieses Bild, indem Sie auf Bild | Duplikat.
  13. Schalten Sie mit der Maustaste, die die ecDNA enthält, auf den Bildschirm um. Wenden Sie einen Schwellenwert an, um nur das zu erhalten, was als ecDNA identifiziert wurde. Klicken Sie auf Anwenden, wenn der Schwellenwert ausreichend ist.
  14. Wenn nach dem Schwellenwert mehr DNA-Bereiche vorhanden sind, die nicht ecDNA sind, kehren Sie zum ursprünglichen trainierten Bild zurück, fügen Sie weitere Klassifikatoren hinzu, und wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.13.
  15. Klicken Sie auf Bild | Bildanpassung | Machen Sie Binary. Kopieren Sie den glomerulären ROI in Schritt 2.3 und klicken Sie auf Strg+Umschalt+E. Aktivieren Sie das Weka-Fenster durch Bearbeiten | Auswahl | Wiederherstellen, wodurch die Auswahl wiederhergestellt wird. Klicken Sie auf Partikel analysieren, die nur die ecDNA-Partikel im Glomerulus messen.
    HINWEIS: Ein Ergebnisblatt wird mit der Anzahl der Partikel, der Fläche, den Durchschnittspixeln und dem Prozentsatz des Glomerulus berechnet, der ecDNA enthält. Diese Ergebnisse können in eine Kalkulationstabelle exportiert und gespeichert werden, um sie später statistisch zu analysieren.
  16. Speichern Sie den Klassifier als ecDNA.classifier, indem Sie im Optionsmenü in der ImageJ-App auf dem Desktop auf Klassifier speichern klicken. Klicken Sie dann im Optionsmenü auf Daten speichern und speichern Sie als ecDNA.arff im ImageJ-Ordner. Der ROI muss jedes Mal manuell hinzugefügt werden, wenn sich Glomerulus-Größe und -Form ändern, aber das Programm hat gelernt, was ecDNA ist.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5 mit einem neuen Bild, um das Modell erneut auf nachfolgende Bilder anzuwenden. Klicken Sie im Optionsmenü auf Klassifier laden und dann im ImageJ-Ordner aus Schritt 2.16 auf "Klassifier laden". ecDNAmodel.classifier Das Protokollmenü wird angezeigt und das Modell ausgeführt.
  18. Sobald das Modell ausgeführt wurde, klicken Sie im Optionsmenü auf Daten laden und wählen Sie die im ImageJ-Ordner gespeicherte Datei ecDNA.arff aus Schritt 2.16 aus. Klicken Sie auf Ergebnis erstellen. Wenn das resultierende Bild nicht alle Kerne, Hintergründe oder ecDNA auf den Neu-Zug-Klassifikator klicken und weitere Klassifikatoren hinzufügen und das neue Modell speichern konnte. Schließen Sie den Analyseprozess ab, indem Sie die Schritte 2.9-2.16 wiederholen.
    HINWEIS: Mehrere Bilder können verwendet werden, um das endgültige Modell zu generieren, das verwendet wird, um ecDNA zu erkennen. Dies wird erreicht, indem das Modell auf nachfolgende Bilder angewendet, weitere Klassifikatoren hinzugefügt und das neue Modell und die Neuen Daten im ImageJ-Ordner gespeichert werden. Dies kann besonders wichtig sein, wenn verschiedene Stichproben einen höheren Hintergrund haben. Das Weka Segmentation Programm ist auch kompatibel mit ImageJ Makrosprache, die viele der Befehle makrobeschreibbar ist, um einige der Schritte zu automatisieren.

3. Messung von neutrophilen extrazellulären Fallen und ecMPO

HINWEIS: Diese Methode identifiziert NETs durch Kolokalisierung von extrazellulärer DNA, Citrullinated Histones peptidyl arginase 4 (PAD4) und MPO.

  1. Induzieren Sie ein 20-Tage-Modell der Anti-Myeloperoxidase Glomerulonephritis (Anti-MPO-GN) in 8-10 Wochen alten C57/Bl6 Mäusen, mit Kontrollen9.
    1. Euthanisieren Sie Mäuse human mit einerCO2-Kammer.
    2. Entfernen Sie die Nieren, indem Sie einen vorderen Mittellinienschnitt durch die Haut mit einer Schere machen, und schneiden Sie dann vorsichtig das Peritoneum und stecken Sie wieder auf einem Sezierbrett. Mit Zangen schieben Sie die vordere Nierenfaszie und das parietale Peritoneum beiseite und schneiden Sie die Niere frei, indem Sie den Harnleiter und die Blutgefäße (Nierenarterie und Vene) am Nierenbecken abtrennen. Mit Zangen entfernen und Nieren halbieren (sagittale Ebene) mit einem Skalpell der Größe 22.
    3. Die Niere 16 Stunden bei Raumtemperatur (RT) fixativ (4% gepuffertes Formalin) aufstellen. Entfernen und einweichen feste Niere in 30% Ethanol für 24 Stunden vor der Verarbeitung.
  2. Verarbeiten Sie Nieren mit einem Standard 6-Stunden-Zyklus:
    70% Ethanol für 15 min
    90% Ethanol für 15 min
    100% Ethanol für 15 min
    100% Ethanol für 20 min
    100% Ethanol für 25 min
    100% Ethanol für 30 min
    Xylol für 20 min
    Xylol für 30 min
    Xylol für 40 min
    Wachs für 30 min
    Wachs für 35 min
    Wachs für 40 min
    HINWEIS: Nieren sollten nicht einer längeren Hitzeexposition im Wachs ausgesetzt werden, da sie Antigene von Interesse zerstören kann.
  3. Schneiden Sie 3 m Abschnitte auf einem Mikrotome und montieren Sie auf handelsüblichen Glasmikroskopschlitten, die mit einer positiven Ladung beschichtet sind. Über Nacht trocknen lassen
  4. Glasrutschen in einen Schiebeträger in einen 60 °C-Ofen für 60 min geben.
    HINWEIS: Die Schritte 3.3-3.4 sind entscheidend, um sicherzustellen, dass Abschnitte während des Antigen-Abrufschritts nicht abschwimmen.
  5. Tauchen Sie in zwei Wechsel des Lösungsmittels (Xylol oder Ersatz) für jeweils 40 min, in einer Dunstabzugshaube.
  6. Rehydratginginginiert in 100% Ethanol, 100% Ethanol, 70% Ethanol für je 5 min.
  7. 5 min in Leitungswasser waschen.
  8. Legen Sie eine Kochplatte in eine Dunstabzugshaube und Preboil Antigen Retrieval Lösung (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) in einem Schnellkochtopf. Sobald die Antigen-Retrieval-Lösung beginnt zu kochen, legen Sie die Dias horizontal mit einem Paar Zange in den Topf und verriegeln Sie den Deckel. Kochen sie auf hoch (entspricht 15 psi oder 103 kPa) für 10 min.
    HINWEIS: Dieser Schritt ruft das Antigen von Interesse ab, indem das Antigen-Epitop (kreuz verbunden über Formalin-Fixierung) entlarvt wird, um eine epitop-antikörperspezifische Bindung zu ermöglichen, die nachfolgende Färbung wird ohne diesen Schritt nicht funktionieren.
  9. Entfernen Sie den Schnellkochtopf von der Hitze und entfernen Sie den Deckel sofort, indem Sie kalten Wasserhahn auf den Deckel in einem Waschbecken laufen. Lassen Sie die Dias für 20 min in der Antigen-Retrieval-Lösung ausdemieren.
  10. Zweimal für 5 min in Phosphatgepufferter Saline (PBS) (pH 7,4, 0,01 M) auf einem Orbitalshaker waschen.
  11. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um Kreise um das Nierengewebe zu ziehen, wobei darauf geachtet wird, dass in dieser Zeit kein Gewebe austrocknet.
  12. Blockgewebe in 10% Hühnersera in 5% Rinderserumalbumin (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) für 30 min, 60 l pro Abschnitt. Nach diesem Schritt nicht waschen, aber vorsichtig die Blockierlösung mit einer 60-L-Pipette entfernen. Lassen Sie die Abschnitte nicht austrocknen.
  13. Machen Sie einen Cocktail der primären Antikörper in 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) in 1 Tube verdünnt. Tragen Sie 60 l pro Nierenabschnitt auf. Die Konzentration der primären Antikörper ist wie folgt:
    Kaninchen Anti Mensch/Maus H3Cit 1/100
    Maus Anti Mensch/Maus PAD4 1/50
    Ziege Anti Mensch/Maus MPO 1/200
  14. Über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.
  15. Zweimal für 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) auf einem Orbital-Shaker gleitet.
  16. Machen Sie einen Cocktail der sekundären Antikörper in 1 Tube. Sekundäre Antikörper werden in 1% BSA/PBS, 60 l pro Abschnitt wie folgt angewendet:
    Huhn Anti Kaninchen 488 1/200.
    Huhn Antimaus 647 1/200.
    Huhn anti Ziege 594 1/200.
  17. Inkubieren bei RT für 40 min.
  18. Zweimal für 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) auf einem Orbital-Shaker gleitet.
  19. Sekundärantikörper 1:200 in 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) für 40 min bei RT 60 l pro Abschnitt anwenden.
  20. Zweimal für 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) auf einem Orbital-Shaker gleitet.
  21. Tauchen Sie in 0.3% Sudan Black in 70% Ethanol für 30 min.
  22. Schlitten in Leitungswasser waschen, um Niederschlag zu entfernen und dann 10 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) einzutauchen, um weitere Sudan Black Niederschlagbildung zu verhindern.
  23. Montieren Sie die Schlitten auf konfokale Glasabdeckungen mit drei 60-L-Tropfen Montagelösung mit DAPI. Versiegeln Sie die Abdeckungen mit Nagellack, indem Sie um den Umfang des Coverslip auftragen.
  24. Lassen Sie die Dias 24 Stunden lang bei RT aushärten (damit DAPI eindringen kann) und lagern Sie sie dann bei 4 °C, die vor Licht geschützt sind. Halten Sie sich im Dunkeln, um das Verblassen von fluoreszierenden Sonden zu verhindern.
  25. Bilddiaber mit einem konfokalen Laser-Scanning-Kopf, der an einem Mikroskop befestigt ist. Excite Dias mit dem 405 Laser für DAPI und dem 488 Laser für H3Cit, 561 für MPO und 647 für PAD4. Erfassen Sie 1024x1024-Pixelbilder mit einer zeilensequenden Aufnahme und 4-Linien-Mittelung, die für die Erkennung von ecDNA unerlässlich ist. Verwenden Sie ein 40x 1.0 NA Ölobjektiv. Bild ein Minimum von 20 Glomeruli pro Probe. Speichern Sie Bilder als ND2-Dateien.

4. Neutrophile extrazelluläre Fallen und ecMPO-Analyse

  1. Installieren Sie ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Überprüfen Sie, ob die trainierbare Weka-Segmentierung unter Plugins verfügbar ist | Segmentierung | Trainable Weka Segmentierung.
  3. Legen Sie das Bild in ImageJ ab. Klicken Sie auf Bild | Farbe | Split Kanäle. Ein Bild mit DAPI in blauer Färbung aller Kerne erscheint, ein Bild mit H3Cit in grün, ein Bild mit MPO in rot und ein Bild mit PAD4 in Weiß.
    1. Erstellen Sie eine zusammengeführte Datei der einzelnen Bilder, um einen ROI für den Glomerulus zu zeichnen, indem Sie auf Farbe | Merge-Kanäle. In einem Popup-Feld wird darum gebeten, jedem Kanal eine Farbe zuzuweisen. Nachdem Sie jedem Kanal eine Farbe zugewiesen haben, aktivieren Sie das Feld Composite erstellen und das Feld Quellbilder beibehalten, und klicken Sie auf Ok. Ein zusammengeführtes Bild wird angezeigt. Im Gegensatz zum Protokoll für ecDNA zuvor verwenden wir das zusammengesetzte Bild, um die restlichen Schritte auszuführen.
  4. Führen Sie eine Gaußsche Unschärfe auf dem zusammengesetzten Bild aus. Dies ermöglicht eine Glättung der Kerne. Klicken Sie auf Prozess | Filter | Gaußsche Unschärfe, setzen Sie in 1.00-2.00. Das Bild sieht nun etwas verschwommen aus, aber die Kerne sind nun glatt und der Hintergrund aufgeweicht.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist vorgeformt, um Rauschen zu entfernen, um das Bild von Artefakten zu bereinigen, die eine relevante Erkennung von Bildattributen verhindern können, die analysiert werden.
  5. Klicken Sie auf Plugins | Segmentierung | Trainable Weka Segmentierung. Es erscheint ein ganz neues Fenster mit dem zu analysierenden Bild und den weka-Segmentierungsspezifischen Menüwerkzeugen.
  6. Verwenden Sie das Linienwerkzeug auf der Werkzeugleiste (in ImageJ), verfolgen Sie zunächst eine Spur um intakte Kerne, die nicht positiv für alle 4 NET-Komponenten (MPO, PAD4, DAPI und H3Cit) sind, indem Sie das Freihandwerkzeug verwenden, und fügen Sie dann dem Feld Klasse 1 hinzufügen hinzu.
  7. Mit dem Linienwerkzeug in der ImageJ-Werkzeugleiste zeigen Sie Die Hintergründe zum Feld Klasse 2.
  8. Klicken Sie im Label-Menü auf die Schaltfläche Neue Klasse erstellen und beschriften Sie "NETs". Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um NETS zu kennnieren, die als Co-Lokalisierungs-DAPI (blau), MPO (rot), PAD4 (weiß) und citrullinierte Histone (grün) identifiziert wurden.
  9. Klicken Sie im Label-Menü auf die Schaltfläche Neue Klasse erstellen und beschriften Sie "ecMPO". Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um mPO (rot) zu ableiten, das zellfrei ist.
  10. Klicken Sie im Trainingsmenü im Fenster Trainable Weka Segmentation auf die Schaltfläche Zugklassifier.
    HINWEIS: Die STOP-Taste wird anstelle der Schaltfläche Zugklassifier angezeigt und bleibt, bis das Training abgeschlossen ist. Klicken Sie während des Trainings nicht auf diese Schaltfläche und der Prozess wird unterbrochen.
  11. Klicken Sie im Trainingsmenü auf die Schaltfläche Ergebnis erstellen und es wird ein Bild mit allen klassifizierten Komponenten erstellt, bestehend aus intakten Kernen, dem Hintergrund und dem, was als ecMPO identifiziert wurde.
  12. Klicken Sie im Trainingsmenü auf die Schaltfläche Wahrscheinlichkeit abrufen. Schalten Sie die Maus um, um ein Schwarzweißbild aller Klassen mit dem weiß hervorgehobenen Auswahlobjekt zu geben.
  13. Duplizieren Sie sowohl die NET-Wahrscheinlichkeit als auch das ecMPO-Wahrscheinlichkeitsbild, indem Sie auf Bild | Duplikat.
  14. Schalten Sie mit der Maustaste, die NETs enthält, auf den Bildschirm um. Wenden Sie einen Schwellenwert an, um sicherzustellen, dass nur die genannten NE hervorgehoben werden. Klicken Sie in der BildJ-Menüleiste auf Bild | Anpassen | Schwellenwert. Verschieben Sie die verschiebbaren Kippstangen, bis auf den NET-Komponenten hervorgehoben ist. Klicken Sie auf Anwenden, wenn Sie mit dem Schwellenwert zufrieden sind. Wiederholen Sie die gleichen Schritte für ecMPO.
  15. Wenn nach dem Schwellenwert immer noch Bereiche von ecMPO oder NETs erkannt werden, kehren Sie zum ursprünglichen trainierten Bild zurück, und fügen Sie weitere Klassifikatoren hinzu, und wenden Sie die Schritte 4.1-4.14 erneut an.
  16. Klicken Sie auf Bild | Bildanpassung | Machen Sie Binary. Kopieren Sie den glomerulären ROI in Schritt 4.3, klicken Sie auf Strg+Umschalt+E. Aktivieren Sie das Weka-Fenster durch Bearbeiten | Auswahl | Wiederherstellen, wodurch die Auswahl wiederhergestellt wird. Klicken Sie auf Partikel analysieren, um nur die NET-Partikel innerhalb des Glomerulus zu messen.
  17. Schalten Sie mit der Maustaste, die ecMPO enthält, auf den Bildschirm um. Wenden Sie einen Schwellenwert an, um sicherzustellen, dass nur identifizierte ecMPO abgerufen werden. Klicken Sie auf Anwenden, wenn Sie mit dem Schwellenwert zufrieden sind. Wiederholen Sie Schritt 4.16 oben.
    HINWEIS: Ein Ergebnisblatt wird mit der Anzahl der Partikel, der Fläche, den Durchschnittspixeln und dem Prozentsatz der Glomerulus berechnet, die sowohl NETs als auch ecMPO enthalten. Diese Ergebnisse können dann in eine Kalkulationstabelle eingebracht und für eine spätere statistische Analyse gespeichert werden.
  18. Speichern Sie den Klassifier als NETs.classifier, indem Sie im Optionsmenü auf Klassifier speichern klicken und die Datei in der ImageJ-App auf dem Desktop (ImageJ-Ordner) speichern. Klicken Sie dann im Optionsmenü auf Daten speichern und als NETs.arff-Datei speichern. Der glomeruläre ROI muss jedes Mal manuell hinzugefügt werden, wenn sich glomerulus Größe und Form ändern, aber das Programm hat gelernt, was sowohl NETs als auch ecMPO sind.
  19. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.5 mit einem neuen Bild, um das Modell erneut auf nachfolgende Bilder anzuwenden. Klicken Sie im Optionsmenü auf Klassifier laden. Klicken Sie im ImageJ-Ordner auf Nets.classifier. Das Protokollmenü wird angezeigt und das Modell ausgeführt, sobald das Modell ausgeführt wurde, klicken Sie im Optionsmenü auf Daten laden und wählen Sie die Datei NETs.arff aus.
    1. Klicken Sie auf Ergebnis erstellen. Wenn das resultierende Bild nicht alle Kerne, Hintergründe oder ecDNA auf den Neu-Zug-Klassifikator klicken und weitere Klassifikatoren hinzufügen und das neue Modell speichern konnte. Schließen Sie den Analyseprozess ab, indem Sie die Schritte 4.11-4.19 wiederholen.
      HINWEIS: Mehrere Bilder können verwendet werden, um das endgültige Modell zu generieren, das verwendet wird, um ecDNA, ecMPO und NETs zu erkennen. Dies wird erreicht, indem das Modell auf nachfolgende Bilder angewendet, weitere Klassifikatoren hinzugefügt und das neue Modell und die Neuen Daten im ImageJ-Ordner gespeichert werden. Dies kann besonders wichtig sein, wenn verschiedene Stichproben einen höheren Hintergrund haben. Das Weka Segmentation Programm ist kompatibel mit ImageJ Makrosprache, die viele der Befehle makrobeschreibbar ist, um einige der Schritte zu automatisieren.

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Ergebnisse

Diese Bilder stellen die verschiedenen Schritte dar, die erforderlich sind, um die trainierbare Weka-Segmentierung erfolgreich zu verwenden, um die arbeitsintensive manuelle Messung von ecDNA in fluoreszierend gefärbtem FFPE-Nierengewebe von einer Maus mit induziertem Anti-MPO GN zu minimieren. Diese Schritte sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 mit Bildern zusammengefasst, die direkt aus dem Weka-Segmentierungsprogramm aufgenomme...

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Diskussion

Es gibt mehrere Protokolle, die proinflammatorische Marker im Serum und Urin von Patienten und Mausmodellen der Glomerulonephritis messen. Dieses beschriebene Protokoll ermöglicht die direkte Analyse der Produkte des Zelltodes (ecDNA, NETs und ecMPO) innerhalb des Glomerulus. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die Gewebevorbereitung und -bildgebung. Das wichtigste einschränkende Element der Verwendung einer fluoreszierenden Färbungsmethode für die Analyse ist die Gewebe-Autofluoreszenz. Formalin fixiertem ...

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Offenlegungen

Nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir würdigen Monash Micro Imaging für den Einsatz des aufrechten Konfokallaser-Scanning-Mikroskops Nikon C1 und der Monash Histology Platform für die Verarbeitung von Nierengewebe.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RinderserumalbuminSIGMAA21535%ige und 1%ige Lösungen werden in PBS hergestellt, können in loser Schüttung hergestellt und eingefroren werden - nach dem Auftauen entsorgt.
Hühnchen-Anti-Ziegen-IgG (H+L) kreuzabsorbierter Antikörper Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-21468Schleudern Sie die Mini-Zentrifuge 1 Minute vor der Verwendung, um ein freies Konjugat in Ihrem Antikörper-Cocktail zu vermeiden
Hühnchen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzabsorbierter Antikörper, Alex Fluor 647ThermoFisher ScientificA-121468Schleudern Sie die Mini-Zentrifuge 1 Minute vor der Verwendung, um ein freies Konjugat in Ihrem Antikörpercocktail
zu vermeidenHuhn Anti Kaninchen IgG (H+L) Kreuzabsorbierter Antikörper Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-21441Schleudern Sie die Mini-Zentrifuge 1 Minute vor der Verwendung, um freies Konjugat in Ihrem Antikörpercocktail zu vermeiden
Hühnchen-SeraSIGMAC5405Hergestellt aus 1%BSA/PBS
Deckgläser 24 x60 mmAzerscientificES0107222#1.5 Dies ist keine Standarddicke - entwickelt für die Verwendung in der konfokalen Mikroskopie
EDTA 10mMSIGMAE6758TRIS und EDTA zusammen in destilliertem Wasser und einem pH-Wert von 9 für die Antigengewinnung zugeben, kann in einer 10x Lösung hergestellt werden
Ethanol 30%, 70% und 100Chem LieferungUN1170Lieferung als 100% unvergälltes Ethanol - verdünnen auf 30% und 70% mit destilliertem Wasser
Formaldehyd, 4% (10% neutrales gepuffertes Formalin)TRAJANNBF-500Die Niere wird 16 Stunden lang bei RT in ein 5-ml-Röhrchen mit 3 ml Formalin gegeben, Formalin sollte in einem Abzug verwendet werden
Histologie-Objektträger aus Glas - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1,0 mmTRAJANJ3800AM4Die Verwendung von positiv geladenen beschichteten Objektträgern ist unerlässlich. Wir empfehlen nicht, Poly-L-Lysin für die Beschichtung von Objektträgern zu verwenden, da sich Gewebe während des Antigen-Entnahmeschritts von den Objektträgern löst
Ziege Anti-Mensch/Maus MPO-AntikörperR& DAF3667Aliquot und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
HistosolClini PureCPL HISTOSOL 08Wird pur verwendet, in 200 ml Färberack-Behältern, in einem Abzug
verwenden Hydrophober StiftVECTOR LabsH-400Verwenden, um einen Kreis um das Nierengewebe zu zeichnen
Maus Anti-Mensch/Maus Peptidylarginase 4 (PAD4)ABCAMab128086Aliquot und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Nikon C1 konfokaler Scanning-Laserkopf, der an Nikon Ti-E inverses Mikroskop befestigtKohärent WissenschaftlichAliquot und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSIGMAP381350,01 M PB / 0,09 % NaCl Make up 5 L
Schnellkochtopf 6 L Tefal Secure 5 Neo EdelstahlTefalGSA-P2530738Gekauft im örtlichen Haushaltswarengeschäft
Prolong Gold DAPILife TechnologiesP36962Tropfen direkt auf das Deckglas auftragen
Kaninchen Anti-Mensch/Maus Beta Aktin AntikörperABCAMab8227Aliquot und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Kaninchen Anti Mensch/Maus H3Cit AntikörperABCAMab5103Aliquot und bei der Ankunft bei minus 80 Grad einfrieren
Färbegestell 24 ObjektträgerProScitechH4465Das gewählte Färbegestell muss in der Lage sein, dem Sieden unter Druck und der Inkubation im 60-Grad-Ofen standzuhalten
Sudan Black BSIGMA1996640,3% Geben Sie 3 g in eine 1-Liter-Flasche in 70 % Ethanol, filtrieren Sie und schützen Sie es vor dem Licht - 6 Monate bei Raumtemperatur
stabil Tris 10mMSIGMAT4661TRIS und EDTA zusammen in destilliertem Wasser und pH-Wert auf 9, zur Antigenrückgewinnung, kann in einer 10-fachen Lösung hergestellt werden
XylolTrajanXL005/20Muss in einem Abzug verwendet werden
% ist

Referenzen

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Trainierbare Weka-SegmentierungFFPE-GewebefärbungKonfokalmikroskopieBildanalyseLöschung der AutofluoreszenzNeutrophile Extrazelluläre FallenExtrazelluläre MyeloperoxidaseKlassifizierung mittels maschinellem Lernen
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