Umweltallergene wie Hausstaubmilben (HDM) enthalten oft mikrobielle Substanzen, die angeborene Immunreaktionen aktivieren, um allergische Entzündungen zu regulieren. Das hier vorgestellte Protokoll zeigt die Identifizierung von dsRNA-Arten in HDM-Allergenen und die Charakterisierung ihrer immunogenen Aktivitäten bei der Modulation eosinophiler Lungenentzündungen.
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Methodenartikel
Identifizierung und Charakterisierung immunogener RNA-Arten in HDM-Allergenen, die eosinophile Lungenentzündungen modulieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Umweltallergene wie Hausstaubmilben (HDM) sind oft in komplexen Formen, die sowohl allergische Proteine enthalten, die aberrante Typ-2-Antworten antreiben, als auch mikrobielle Substanzen, die angeborene Immunreaktionen auslösen. Diese allergenassoziierten mikrobiellen Komponenten spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Entwicklung von Typ-2-Entzündlichen Erkrankungen wie allergischem Asthma. Die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben jedoch weitgehend undefiniert. Das hier vorgestellte Protokoll bestimmt die strukturellen Eigenschaften und die In-vivo-Aktivität allergenassoziierter immunostimulatorischer RNA. Insbesondere werden häufige Allergene auf das Vorhandensein von doppelsträngigen RNA-Arten (dsRNA) untersucht, die IFN-Reaktionen in der Lunge stimulieren und die Entwicklung schwerer Lungeneosinophilie in einem Mausmodell von HDM-induziertem allergischem Asthma hemmen können. Hier haben wir die folgenden drei Assays aufgenommen: Dot blot, um die dsRNA-Strukturen in der gesamten RNA zu zeigen, die von Allergenen einschließlich HDM-Arten isoliert sind, RT-qPCR zur Messung der Aktivitäten von HDM-RNA in interferonstimulierender Gene (ISGs) Expression in der Mauslunge und FACS-Analyse zur Bestimmung der Auswirkungen von HDM-RNA auf die Anzahl der Eosinophile in BAL bzw. Lunge.
Einleitung
Basierend auf der ursprünglich von Strachan1vorgeschlagenen Hygienehypothese kann die frühkindliche Exposition gegenüber mikrobiellen Umweltfaktoren wie Endotoxin vor der Entwicklung allergischer Erkrankungen schützen2,3. Bei mikrobiellen Infektionen, z.B. Virusinfektionen, löst der angeborene Immundetektion von Fremdnukleinsäuren (RNA/DNA) Wirtsabwehrreaktionen4,5,6aus. Die Existenz und Prävalenz immunogener Nukleinsäuren wie lange doppelsträngige RNA-Arten (dsRNA) in Hausstaubmilben (HDM) ode....
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Protokoll
Die hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas Health San Antonio genehmigt.
1. Dot Blot, um das Vorhandensein von dsRNA-Strukturen in HDM-Gesamt-RNA zu zeigen
- Vollständige RNA-Isolierung von Allergenen, Insekten und Nichtinsektenallergenen
- HDM,-Insekten oder Nicht-Insektentiere, die lebend gesammelt oder kommerziell gewonnen wurden, in 50 ml-Rohre geben und schnell mit Flüssig-N2einfrieren. Dann bei -70 °C für die nachfolgende vollständige RNA-Isolierung lagern.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden HDM-, Insekten- und Nichtinsek....
- HDM,-Insekten oder Nicht-Insektentiere, die lebend gesammelt oder kommerziell gewonnen wurden, in 50 ml-Rohre geben und schnell mit Flüssig-N2einfrieren. Dann bei -70 °C für die nachfolgende vollständige RNA-Isolierung lagern.
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Ergebnisse
Das Vorhandensein von langen dsRNA-Strukturen in HDM, Insekten und Nicht-Insekten-Kleintieren wurde mit einem dsRNA-spezifischen Mausmonoklon-Antikörper J2 (ca. 40bp) mit Punktblot untersucht. RNase III wurde verwendet, um dsRNA in 12–15 bp dsRNA-Fragmente zu verdauen, die durch J2 nicht nachweisbar waren (Abbildung 1).
Die Fähigkeit der HDM-Gesamt-RNA, eine angeborene Immunantwort in der Mauslunge dosisabhängig zu stimulieren, wurde mit RT-qPCR analysiert (
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Diskussion
Das aktuelle Protokoll beschreibt, wie die immunstimulierenden Eigenschaften allergenassoziierter mikrobieller RNA und ihre Auswirkungen auf die Entwicklung von eosinophiler Lungenentzündung in einem Mausmodell von allergischem Asthma bewertet werden können. Obwohl lange dsRNAs als Replikationszwischenprodukte vieler Viren bekannt sind, die Interferon-Reaktionen in Säugetierzellen wirksam aktivieren können, waren ihre Präsenz in HDM-Allergenen bis zu unserer jüngsten Arbeitunbekannt 15. Die in die.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir danken Frau Karla Gorena für die technische Unterstützung in der Durchflusszytometrie. L.S. wird vom China Scholarship Council und der Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068) unterstützt. H.H.A. wird vom Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Saudi-Arabien unterstützt. X.D.L. wird vom UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund und dem Max and Minnei Voelcker Fund unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,40 &Mikro; m Falcon Cell Strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL Spritzen | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL Tube | TH. Geyer | 7696702 | |
| 50 mL Röhrchen | TH. Geyer | 7696705 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-RBC Lysingpuffer | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ Membran | GE Healthcare | RPN203B | |
| Ameise | San Antonio | Hinweis: Lokal gesammelter | |
| Antikörperverdünnungspuffer | (Rezeptur siehe Tabelle 5) | ||
| Anti-Maus CD11b V450 Ratte (Klon M1/70) | BD Bioscience | 560456 | 1 bis 200 Verdünnung |
| Anti-Maus CD11c PE-Cy7 (Klon N418) | BioLegend | 117317 | 1 bis 200 Verdünnung |
| Anti-Maus CD19 Alexa Flour 647 (Klon 1D3) | eBioscience | 15-0193-81 | 1 bis 200 Verdünnung |
| Anti-Maus CD3e APC (Klon 145-2C11) | Invitrogen | 15-0031-81 | 1 bis 200 Verdünnung |
| Anti-Maus CD45 APC-Cy7 (Klon: 30-F11) | BioLegend | 103130 | 1 bis 200 Verdünnung |
| Anti-Maus Fixierbarer Viabillity Farbstoff eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1 bis 200 Verdünnung |
| Anti-Maus IgG (H+L), AP Konjugat | Promega | S3721 | |
| Anti-Maus Ly-6G FITC (Klon RB6-8C5) | Invitrogen | 11-5931-82 | 1 bis 200 Verdünnung |
| Anti-Maus MHC II APC-eFluor 780 (Klon M5/114.15.2) | eBioscience | 47-5321-80 | 1 bis 200 Verdünnung |
| Anti-Maus Siglec-F PE (Klon E50-2440) | BD Pharmingen | 552126 | 1 bis 200 Verdünnung |
| BCIP/NBT Substrat | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| Blocking-Puffer | (Rezept siehe Tabelle 5) | ||
| Cannual, 20G X 1,5" | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| Zentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Nachweissystem | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| Kakerlake | Greer Laboratories | B26 | |
| Zählperlen | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville Zellkulturplatten mit Deckel, 96-Well-Zellkulturplatte | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| Digitales Trockenbad - Vier Blöcke | Universal Medical, Inc. | ||
| Regenwurm | San Antonio | Hinweis: Lokal gesammelte | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS-Puffer | (siehe Rezept in Tabelle 5) | ||
| Falcon Polypropylen-Röhrchen mit rundem Boden, 5 mEL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| Durchflusszytometer (BD FACS Celesta) | BD Biosciences | ||
| Fly | Greer Laboratories | B8 | |
| Pinzette | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-5135 | |
| Hämozytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| In Vivo MAb Anti-Maus CD16/CD32 (Klon: 2.4G2) | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA Synthesekit | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| Isofluran | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 monoklonaler Anti-dsRNA-Antikörper | SCICONS | 10010200 | |
| Lungenaufschlusslösung | (siehe Rezept in Tabelle 5) | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D, 2 mL Röhrchen | MP Biomedicals | Artikelnummer:116913100 | |
| Mäuse (weiblich, 8-12 Wochen alt, C57BL/6J) | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| Mikroskop | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenisatoren | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| Mosquito | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| Nadel, 21 G x 1 1/2 Zoll | BD Biosciences | 305167 | |
| fettfreie Milch | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| Nylonschnur | Dynarex | 3243 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| Schere | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-6802 | |
| Schüttler oder kleiner Labormischer | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount Fluoreszierend | Spherotech | ACFP-70-5 | 1 bis 10 Verdünnung |
| Spider | San Antonio | Hinweis: Lokal gesammelte | |
| TBS | (siehe Rezept in Tabelle 5) | ||
| TBS-T | (siehe Rezept in Tabelle 5) | ||
| Gesamtes Zellmedium | (siehe Rezept in Tabelle 5) | ||
| TRIzol Reagenz | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 UV | LabX | 20447 | |
| Wasp | San Antonio | Hinweis: Vor Ort gesammelt |
Referenzen
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M.....
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Nachdrucke und Genehmigungen
