Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

High-Throughput-Tests kritischer thermischer Grenzwerte bei Insekten

5.2K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/61186

⸱

15. Juni 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, University of Kentucky

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Thermische Grenzwerte können die Umwelt, die Organismen tolerieren, vorhersagen, was angesichts des raschen Klimawandels wertvolle Informationen ist. Hier werden Protokolle mit hohem Durchsatz beschrieben, um kritische thermische Minima und Wärmeabstoßzeiten bei Insekten zu bewerten. Beide Protokolle maximieren den Durchsatz und minimieren die Kosten der Assays.

Zusammenfassung

Obere und niedrigere thermische Grenzwerte von Pflanzen und Tieren sind wichtige Prädiktoren für ihre Leistung, ihr Überleben und ihre geografische Verteilung und sind für die Vorhersage von Reaktionen auf den Klimawandel unerlässlich. Diese Arbeit beschreibt zwei Hochdurchsatzprotokolle zur Messung von thermischen Grenzwerten für Insekten: eines zur Beurteilung kritischer thermischer Minima (CTmin)und das andere zur Beurteilung der Wärmeabschlagzeit (KDT) als Reaktion auf einen statischen Wärmestressor. ImCT-Min-Assay werden Individuen in einer Acryl-Mantelsäule platziert, einer abnehmenden Temperaturrampe ausgesetzt und mit einem Infrarotsensor von ihren Barschen gezählt. In der Hitze KDT Assay, Individuen sind in einer 96 Brunnenplatte enthalten, in einem Inkubator auf eine stressige, heiße Temperatur gesetzt, und Video aufgezeichnet, um die Zeit zu bestimmen, zu der sie nicht mehr aufrecht bleiben und bewegen können. Diese Protokolle bieten Vorteile gegenüber häufig verwendeten Techniken. Beide Assays sind kostengünstig und können relativ schnell abgeschlossen werden (ca. 2 h). Der CTmin Assay reduziert Experimentatorfehler und kann eine große Anzahl von Individuen auf einmal messen. Das Heat-KDT-Protokoll erzeugt eine Videoaufzeichnung jedes Assays und beseitigt somit die Voreingenommenheit der Experimentier und die Notwendigkeit, Personen kontinuierlich in Echtzeit zu überwachen.

Einleitung

Thermische Grenzen von Insekten
Die Variation der Umgebungsbedingungen, einschließlich der Temperatur, ist ein wichtiger Faktor, der die Leistung, Fitness, das Überleben und die geografische Verteilung der Organismen1,2beeinflusst. Obere und untere thermische Grenzwerte bestimmen den theoretischen Bereich der Umgebungen, die ein Organismus tolerieren kann, und daher sind diese Grenzwerte wichtige Prädiktoren für Pflanzen- und Tierverteilungen, insbesondere angesichts des Klimawandels3,4. Daher sind Protokolle zur genauen Messung von thermischen Grenzwerten wichtige Werkzeuge unter anderem für Ökologen, Physiologen, Evolutionsbiologen und Naturschutzbiologen.

Als die am häufigsten vorkommenden und vielfältigsten Landtiere werden Insekten häufig für Messungen der thermischen Grenzwerte verwendet. Kritische thermische Maxima (CTmax) und kritische thermische Minima (CTmin) werden häufig verwendet, um intra- und interspezifische Variationen der thermischen Toleranz5,6,7zu bewerten. Während CTmax und CTmin für mehrere Phänotypen gemessen werden können, einschließlich Wachstum, Fortpflanzungsleistung und Verhalten, werden sie am häufigsten auf die Bewegungsfunktion5,6,7angewendet. So werden CTmax (auch Heat Knockdown Temperatur genannt) und CTmin oft definiert als die hohen und niedrigen Temperaturen, bei denen Insekten die Motorfunktion verlieren und nicht aufrecht bleiben können5,6,7,8,9,10,11. CTmin fällt mit dem Beginn des kalten Koma, eine reversible Lähmung durch kalte Temperaturen6. Während Lähmungen an den thermischen Grenzwerten oft reversibel sind, führt die fortgesetzte Exposition gegenüber diesen Temperaturen zum ökologischen Tod5.

Gemeinsame Methoden zur Messung thermischer Grenzwerte
Eine Vielzahl von Geräten wurden verwendet, um thermische Grenzwerte zu messen (zusammengefasst in Sinclair et al.) 6.Kurz gesagt, Insekten werden in Brutkästen12,13erhitzt oder gekühlt, Behälter in Fluidbädern11,,14,15,16, Aluminiumblöcke10,17oder ummantelte Behälter18, und überwacht, bis die Fortbewegung aufhört. Um Insekten während des Assays zu überwachen, ist die häufigste Methode die direkte Beobachtung, bei der Individuen kontinuierlich in Echtzeit oder retrospektiv mit aufgezeichnetem Video6,9,10,11,15,17überwacht werden. Direkte Beobachtungsmethoden haben zwar minimale Ausrüstungsanforderungen, sind aber arbeitsintensiv und begrenzen den Durchsatz. Alternativ können Insekten indirekt beobachtet werden, indem Individuen zu diskreten Zeiten gesammelt werden, wenn sie von Barsche6,,19,,20,21 oder mit Aktivitätsmonitoren13fallen.

Indirekte Methoden zur Messung thermischer Grenzwerte sind im Allgemeinen höher durchsatzweise und potenziell weniger fehleranfällig als direkte Beobachtungsmethoden. Die häufigste Methode für die indirekte Überwachung verwendet eine ummantelte temperaturgesteuerte Säule6,8,19,20,21. Insekten werden in einer Säule mit Barschen platziert, und die Temperatur der inneren Kammer wird durch Pumpen von Flüssigkeit aus einem temperaturgeregelten Flüssigkeitsbad durch das ummantelte Futter der Säule gesteuert. Personen, die ihre thermische Grenze erreichen, fallen von ihrem Barsch und werden in diskreten Temperaturen oder Zeitintervallen gesammelt. Während diese Methode gut für CTminfunktioniert, wurde es für CTmaxungeeignet gefunden, weil Fliegen freiwillig aus dem Boden der Säule gehen, wenn die Temperatur steigt. Die hier beschriebene neue Methode umgeht dieses Problem, indem fliegende Beimessungen einzeln eindämmen.

Neben der Beobachtungsmethode werden häufig zwei Arten von Temperaturregimen verwendet, um die oberen thermischen Grenzwerte zu bewerten. Dynamische Assays bestehen darin, die Temperatur schrittweise zu erhöhen, bis die Motorfunktion verloren geht; dass die Temperatur die dynamische CTmax7,8,9,13ist. Im Gegensatz dazu bestehen statische Assays aus einer konstanten Stresstemperatur, bis die Motorfunktion verloren geht; dieser Zeitpunkt ist die Wärme-Knockdown-Zeit (Wärme KDT), auch als statische CTmax (sCTmax) in einem aktuellen Papier von J.7,8,9,16,22. Obwohl CTmax und Heat Knockdown Assays (Heat KD Assays) Metriken mit unterschiedlichen Einheiten erzeugen, zeigt die mathematische Modellierung der beiden Merkmale an, dass sie vergleichbare Informationen über die Wärmetoleranz liefern und beide ökologisch relevant sind8,9. Dynamische Assays ergeben eine Temperatur, die mit Umgebungsbedingungen verglichen werden kann, und sie sind vorzuziehen, wenn es große Unterschiede in der Wärmetoleranz gibt, wie z. B. Vergleiche zwischen Arten mit sehr unterschiedlichen thermischen Nischen. Aufgrund des hohen Q10 für die Akkumulation von Wärmeverletzungen kann jedoch ein statischer Assay für die Erkennung kleiner Effektgrößen, wie z. B. intraspezifische Variationen der Wärmetoleranz9, vorzuziehen sein. Auch in der Praxis erfordert ein statischer Test weniger ausgeklügelte Ausrüstung als ein dynamischer Assay.

Ziel
Ziel dieses Papiers ist es, Methoden fürCT-Min- und Wärme-KD-Assays zu formalisieren, die in zukünftigen Forschungsarbeiten verwendet werden können, um die thermischen Grenzen von motilen Insekten zu bewerten. Die Protokolle sind an bereits etablierte Methoden angepasst und so konzipiert, dass sie mit hohem Durchsatz, automatisiert und kostengünstig sind. Beide Assays können in kurzer Zeit abgeschlossen werden (ca. 2 h), was bedeutet, dass mehrere Experimente an einem einzigen Tag durchgeführt werden können, wodurch große Datenmengen entstehen, ohne die Wiederholbarkeit oder Genauigkeit zu beeinträchtigen. Mit diesem Setup kann die Wärmetoleranz von 96 Fliegen gleichzeitig gemessen werden, während die Säule für CTmin mehr als 100 Fliegen aufnehmen kann, sofern eine ausreichende Oberfläche zum Perching vorhanden ist.

Die Hochdurchsatzmethode zur Beobachtung von CTmin ändert die übliche Jackensäulenmethodik mit einem Infrarotsensor, um Fliegen automatisch zu zählen. Die Verwendung eines Infrarotsensors zum Zählen wurde erstmals 1996 von23 Shuman et al. vorgeschlagen, aber nicht weit verbreitet. Die Zugabe des Infrarotsensors ermöglicht die Generierung kontinuierlicher Daten, anstatt Daten in diskreten Intervallen zu sammeln. Dieses Protokoll minimiert auch Experimentierfehler, indem die manuelle Dateneingabe und die Notwendigkeit, Sammelrohre unter der buchsenden Spalte manuell zu diskreten Zeitpunkten zu wechseln, eliminiert wird.

Die Hochdurchsatzmethode zur Wärmeerfassung KDT wird aus zwei früheren Studien zur Wärmetoleranz bei Insekten10,12modifiziert. Einzelne Fliegen werden in einer 96-Well-Platte in einem temperaturgeregelten Inkubator gelagert und Video aufgenommen. Dieses Protokoll minimiert die Voreingenommenheit der Experimentatoren bei der Bestimmung von Wärme-KDT, da Experimente durch Abspielen der Aufzeichnung überprüft und überprüft werden können. Dieses Protokoll bietet auch eine Reihe von benutzerdefinierten Python-Skripts, die verwendet werden können, um die Videoanalyse zu beschleunigen. Die Verwendung von einzelnen Brunnen eliminiert Interferenzen, die auftreten können, wenn andere Personen sich bewegen oder umfallen, was ein Problem sein kann, wenn Gruppen von Individuen in der gleichen Arena beobachtet werden10,17. Darüber hinaus bietet der temperaturgeregelte Inkubator eine stabile Temperatur über alle 96 Brunnen, im Gegensatz zu dem Temperaturgradienten, der manchmal über einen temperaturgeregelten Aluminiumblock10beobachtet wird. Beachten Sie auch, dass die 96-Well-Aufnahmemethode angepasst werden kann, um dynamische CTmax und potenziell CTmin zu messen (siehe Diskussion).

Um jedes Protokoll zu demonstrieren, wurden die thermischen Grenzen der erwachsenen Drosophila melanogaster Weibchen aus ausgewählten Linien des Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP)24verglichen. Diese Linien wurden ausgewählt, weil vorläufige Experimente auf signifikante Unterschiede in der thermischen Toleranz hindeuteten. Diese Assays erwiesen sich als robuste Methoden zur Unterscheidung von Unterschieden in der thermischen Toleranz. Die folgenden beiden Protokolle, Hochdurchsatz-CT-Min-Assay (Abschnitt 1) und Hochdurchsatz-Wärme-KD-Assay (Abschnitt 2), beschreiben die notwendigen Maßnahmen zur Herstellung vonCT-Min- und Wärme-KDT-Daten für jedes motile Insektenleben, das in die Geräte passen kann, wie z. B. erwachsene Drosophila.min Für CTmin ist es auch wichtig, dass das Insekt in der Lage zu barsch. Hier wird jeder Assay bei erwachsenen Drosophila melanogasternachgewiesen. Änderungen können jedoch für andere Taxa oder Lebensphasen erforderlich sein6. Kleinere Änderungen können die Verwendung von Perching-Material mit größeren Öffnungen sein, um größere Proben imCT-Min-Assay unterzubringen, oder die Verwendung einer höherwertigen Kamera, um die subtile KDT eines sich langsam bewegenden Insekts oder lebenserhaltenden Stadiums im KD-Wärmetest zu erkennen. Dieses Protokoll beschreibt keine Methoden zur Vorbereitung von Fliegen, aber es ist wichtig, Aufzuchtprotokolle zu standardisieren, um die Wiederholbarkeit25 zu gewährleisten (siehe Garcia und Teets26 und Teets und Hahn27). Die bereitgestellten Protokolle enthalten Informationen über den Aufbau und die Einrichtung der Geräte, die Aufzeichnung von Messungen und eine kurze Beschreibung der Datenanalyse.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Hochdurchsatz CTmin Assay

  1. Montage der ummantelten Säule (Abbildung 1A, Abbildung 2)
    1. Schneiden Sie die breitesten (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) und schmalsten (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) Acrylrohre auf gleiche Längen (31,5 cm) mit einer Hacksäge (Abbildung 2A). Diese beiden Röhren werden die äußeren und innersten Wände der ummantelten Säule sein.
    2. Schneiden Sie zwei Ringe (2 cm breit) aus dem mittelgroßen (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) Acrylrohr mit einer Hacksäge (Abbildung 2A). Diese beiden Ringe werden die Abstandshalter zwischen den inneren und äußersten Röhren sein, wodurch ein Raum zwischen den beiden langen Acrylröhren entsteht, damit Flüssigkeit fließt.
    3. Bohren Sie vorsichtig zwei Löcher in das äußere (breiteste) Acrylrohr, ein Loch oben und eines an der Unterseite. Stellen Sie sicher, dass jedes Loch 3,5 cm vom Ende des Rohres entfernt ist. Bohren Sie die Löcher auf gegenüberliegenden Seiten des Rohres (Abbildung 2B).
    4. Um Risse zu reduzieren, legen Sie Klebeband auf das Rohr über die Stelle des zukünftigen Lochs und bohren Sie sehr langsam auf die niedrigste Drehmomenteinstellung des Bohrers.
    5. Mit dem Gewindehahn beide Löcher einfädeln, so dass die Schlauchadapter in die beiden Löcher des Außenrohres eingeschraubt werden können. Um Risse zu reduzieren, verwenden Sie Schmiermittel und fädeln Sie langsam von Hand.
    6. Schieben Sie die beiden Abstandshalter auf die Innenjacke, einen an jedem Ende (unten und oben). Lassen Sie einen kleinen Abstand (0,5 cm) zwischen dem Abstandsraum und dem Ende der innen mantelen (Abbildung 2B).
    7. Schweißen Sie die Abstandshalter mit Acrylzement an Ort und Stelle.
    8. Nach dem Zement auf dem Innenrohr und Abstandshaltersetzt, schieben Sie dieses Konstrukt in das größere äußere Rohr mit den Löchern. Stellen Sie sicher, dass die Außen- und Innenrohre an beiden Enden bündig sind. Die Abstandshalter werden 0,5 cm vom Ende entfernt sein und kleine Gräben an beiden Enden der Säule bilden (Abbildung 2C).
    9. Schweißen Sie das Außenrohr mit Acrylzement an die Abstandshalter und verwenden Sie verstellbare Stahlklemmen, um das Gerät zusammenzuhalten. Warten Sie, bis der Zement gesetzt ist.
    10. Gewinden Sie die Schlauchadapter in die Löcher des Außenrohres, das nun an den Abstandshaltern und dem Innenrohr befestigt ist.
      HINWEIS: Die Adapter sollten nur in das außenrohr und nicht in den offenen Raum zwischen dem inneren und dem äußersten Rohr einfädeln. Wenn die Schlauchadapter zu weit einfädeln, kürzen Sie sie mit einer Hacksäge auf die entsprechende Länge.
    11. Versiegeln Sie die Schlauchadapter in ihre Gewinde am Außenrohr mit Silikondicht.
    12. Füllen Sie die beiden Gräben zwischen den inneren und äußersten Rohren an beiden Enden der ummantelten Säule mit Silikondicht.
    13. Um die Säule zu testen, befestigen Sie die Schläuche mit einem Durchmesser von 0,6 cm an den Schlauchadaptern. Schließen Sie den Adapter am unteren Rand der Säule an eine Wasserquelle mit Schläuchen und den Adapter oben in der Säule an einen Abfluss mit einem anderen Schlauchstück an.
    14. Führen Sie Wasser durch das Gerät von unten nach oben und überprüfen Sie auf Leckagen. Wenn es Lecks gibt, identifizieren Sie, woher sie kommen, und versiegeln Sie sie mit Silikon.
  2. Einrichten der Jackensäule und des Drosophila Trichtermonitors (DFM)
    1. Befestigen Sie die ummantelte Säule mit einer dreigleisigen Retortenklemme an einem Retortenständer. Richten Sie die Säule vertikal mit einem Ende an der Decke und dem anderen offen zur Laborbank aus (Abbildung 1B).
    2. Schließen Sie den Flüssigkeitseingang und -ausgang aus einem temperaturgeregelten Kühlbad an die Adapterdüsen der Säule mit Kunststoffschläuchen mit 0,6 cm Durchmesser an (Abbildung 1B). Schließen Sie den Flüssigkeitseingang mit der Düse am unteren Rand der Säule und den Flüssigkeitsausgang an die Düse am oberen Rand der Säule an.
    3. Schneiden Sie zwei 3 cm dicke kreisförmige Schaumstoff-Isolierstecker (den gleichen Umfang wie die Öffnung des innersten Fachs der Säule). Stellen Sie sicher, dass die Stecker eng anliegen und die innerste Säule versiegeln, wenn sie an beiden Enden eingesetzt wird (Abbildung 1B).
    4. Pierce ein Loch durch die Mitte eines der Stecker und Gewinde das nackte Ende eines Thermoelements durch das Loch ca. 5 cm und mit Klebeband sichern. Schließen Sie das andere Ende des Thermoelements an einen Thermoelement-Datenlogger an.
    5. Schließen Sie den Thermoelement-Datenlogger an den Computer an.
    6. Keil zwei Stücke Von Kunststoff-Dachrinne-Schutz (5 cm x 7 cm, mit Öffnungen von 0,5 cm Durchmesser) in der Säule, um als Perching-Material zu funktionieren. Platzieren Sie ein Stück Wache 2/3rds von der Oberseite der Spalte und die andere 1/3rd von der Oberseite der Spalte (Abbildung 1B).
    7. Befestigung des unteren Steckers (ohne Thermoelement) und des oberen Steckers (mit Thermoelement). Wenn der Stecker oben in der Säule eingesetzt wird, stellen Sie sicher, dass das Thermoelement die Seiten der Säule nicht berührt.
    8. Passen Sie die Höhe der Säule auf dem Retortenständer so an, dass ein Abstand von 25 cm zwischen der Unterseite der Säule und der Bankspitze besteht.
    9. Befestigen Sie einen Retortenring (5 cm Durchmesser) am Retortenständer 5 cm unterhalb der Unterseite der Säule und drehen Sie den Ring zur Seite der Säule.
    10. Stellen Sie den DFM direkt auf den Retortenring (Abbildung 1B). Schließen Sie alle elektronischen Komponenten an: das Netzteil, die Stromversorgungsschnittstelle und den Computer gemäß dem Herstellerprotokoll.
    11. Sobald die Komponenten angeschlossen sind, folgen Sie dem Herstellerprotokoll, um die Einrichtung der DFM- und DFM-Software abzuschließen.
  3. CtMin Probe
    1. Drehen Sie die Ein- und Ausgangsventile des Fluidbades in die offenen Positionen.
    2. Drücken Sie den Ein-/Ausschalter, um das temperaturgeregelte Flüssigkeitsbad einzuschalten, und drücken Sie dann die Play-Taste, um ein Programm auszuführen, das die Temperatur des Bades auf 25 °C erhöht und aufrechterhält. Geben Sie das Flüssigkeitsbad und die Säule 5-10 min, um 25 °C zu erreichen und zu halten.
    3. Entfernen Sie den Stecker an der Oberseite der Säule und ersetzen Sie ihn durch einen Trichter (5,08 cm Durchmesser; siehe Abbildung 1C).
    4. Tippen Sie fliegen von ihrer Nahrungsflasche in die Säule.
    5. Entfernen Sie den Trichter und ersetzen Sie ihn schnell durch den oberen Stecker, achten Sie darauf, dass fliegen nicht entweichen. Geben Sie den Fliegen 5 min, um sich niederzulassen, und tippen Sie gelegentlich auf den unteren Stecker, um die Fliegen zum Klettern zu ermutigen.
    6. Drücken Sie den Startknopf am Flüssigkeitsbad und starten Sie das CTmin Ramping Programm (25 °C für 5 min; 25 °C bis 10 °C bei 0,5 °C/min; 10 °C für 2 min; dann 10 °C bis -10 °C bei 0,25 °C/min).
      ANMERKUNG: Je nach Forschungsfrage können weitere Varianten diesesCT-Min-Ramping-Protokolls verwendet werden (z. B. Vergleiche der Auswirkungen unterschiedlicher Rampingraten auf CTmin28).
    7. Klicken Sie auf die Thermoelement-Aufnahmesoftware auf dem Computer und klicken Sie dann auf das Aufnahmesymbol, um die Temperatur in der Spalte jede Sekunde für die Dauer des Assays aufzuzeichnen. Stellen Sie sicher, dass jede Temperaturaufzeichnung einen für den zweiten Zeitstempel spezifischen Zeitstempel enthält, damit Temperaturdaten später mit Daten aus dem DFM zusammengeführt werden können.
    8. Fügen Sie 5 ml 90% Ethanol in ein 15 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr und legen Sie es in ein Rack unter der Säule.
    9. Gelegentlich tippen Sie auf den unteren Stecker der Säule, um alle Fliegen auf der Unterseite zum Klettern zu locken. Die meisten Fliegen werden auf einem Barsch oder in der Nähe der Oberseite der Säule um 15 °C sein.
    10. Bei 15 °C den unteren Stecker entfernen und alle Fliegen noch auf dem unteren Stecker im Ethanol sammeln. Zählen sie und beachten Sie, dass diese Fliegen bei 15 °C gesammelt wurden, aber ihr CTmin ist unbekannt.
      HINWEIS: Die Temperatur, bei der der untere Stecker entfernt wird, sollte vor dem Test und basierend auf dem vorhergesagtenCT-Min der Testart oder -behandlung festgelegt werden. Für diesen Test wurden 15 °C auf der Grundlage desCT-Min dieser speziellen DGRP-Linien in vorläufigen Assays ausgewählt.
    11. Legen Sie einen 75 mm Außendurchmesser Glastrichter in den DFM. Passen Sie Retortenring, DFM und Trichter so an, dass sie sich unter der Spalte befinden. Stellen Sie sicher, dass die Lippe des Trichters den Unteren Rand der Säule vollständig versiegelt (Abbildung 1D).
    12. Stecken Sie den Unteren des Trichters in das 15 ml Sammelrohr (Abbildung 1D).
    13. Öffnen Sie die DFM-Software auf dem Computer, indem Sie auf das Softwaresymbol klicken. Die Software wird sofort mit der Aufzeichnung der Uhrzeit/des Datums beginnen, zu der fliegen ihren CTminerreicht. Fliegen, die ihre CTmin erreichen, verlieren die neuromuskuläre Funktion und fallen von ihren Barschen, und danach durch den DFM.
    14. Überwachen Sie, ob alle Fliegen ihre CTmin erreicht haben, da die Temperatur abnimmt, indem Sie den oberen Stecker und Barsche überprüfen, um zu sehen, ob fliegen noch thront (d. h. noch die neuromuskuläre Funktion beibehalten). Der Prozess endet, wenn alle Fliegen ihre CTminerreicht haben.
    15. Passen Sie am Ende der Testversion den DFM an und trichtern Sie von der Spaltenöffnung weg. Einige Fliegen können ihren CTmin erreichen, bleiben aber in der Säule stecken (d.h. in einem Barsch eingekeilt oder baumelnd durch einen einzigen Tarsalhaken). Öffnen Sie den oberen Stecker und entfernen Sie diese Fliegen. Die CTmin dieser Fliegen ist unbekannt.
    16. Kombinieren Sie die .txt-Ausgabedateien aus der Thermoelement-Aufnahmesoftware (d. h. Temperatur, Datum und Uhrzeit) und der DFM-Software (d. h. Anzahl der Fliegen durch den Trichter, das Datum und die Uhrzeit) mit dem Befehl Zusammenführen in RStudio. Führen Sie die beiden Dateien basierend auf der freigegebenen Datums-/Uhrzeitvariablen zusammen.

2. Hochdurchsatz-Wärme KD-Assay

  1. Vorrichtungsmontage und -vorbereitung
    1. Mit einem Klebstoff das Stahlgewebdrahtgitter (Ca. 1,5 mm Blende) an der Unterseite einer 96-Gutbodenplatte befestigen.
    2. Befestigen Sie Magnete an den gegenüberliegenden Seiten der Unterseite einer 96 gut bodenfreien Platte mit einer Heißklebepistole und Heißkleber (Abbildung 3).
    3. Um einen benutzerdefinierten Septumdeckel mit Klebefolie für 96 Brunnenplatten herzustellen, kleben Sie zwei Folien klebrige Seiten zusammen, um eine gerittene Kunststofffolie zu bilden.
    4. Legen Sie die Kunststoffplatten über die 96-Well-Platte und verwenden Sie Klebeband, um sie an allen vier Seiten der Platte zu befestigen. Über die Öffnung zu jedem Brunnen auf der Platte, schneiden Sie ein 'x' in der Kunststofffolie mit einem Kastenschneider (d.h. 96 insgesamt x's).
    5. Fliegen mit CO2 anästhesieren und einzeln in jeden Brunnen der modifizierten 96-Bodenplatte mit Aspirator und Septumdeckel laden. Entfernen Sie den Septumdeckel von der 96-Well-Platte, während die Fliegen mit CO2 betäubt werden, und ersetzen Sie ihn durch einen eng anliegenden klaren Deckel.
    6. Legen Sie die 96 gut bodenfreie Platte mit Fliegen beladen und mit einem klaren dicht sitzenden Deckel auf das Essen. Stellen Sie sicher, dass die2 Fliegen zwischen der CO2-Anästhesisierung und dem Beginn des Assays mindestens 48 h haben (Schritte 2.2.1-2.2.5).
      HINWEIS: Der Boden der modifizierten 96 Well No-Bottom Platten ist aus Mesh, so fliegen mit CO2 beästhestisiert kann geladen werden und auf Nahrung für mindestens 48 h, bevor eine Studie beginnt. Jeder Kunststoffbehälter >8,5 cm breit x 13 cm lang, der mindestens 2 cm tief ist, um eine 1 cm tiefe Schicht von Lebensmitteln aufzunehmen, kann verwendet werden.
    7. Befestigen Sie eine Webcam an der Unterseite der Innenseite eines temperaturgeregelten Inkubators mit Klebeband. Richten Sie die Kamera direkt nach oben (Abbildung 4). Befestigen Sie ein Inkubatorregal ca. 10 cm über der Kamera.
      HINWEIS: Die Webcam zeigt nach oben und zeichnet die 96 Well-Platte von unten auf, um sicherzustellen, dass ein möglichst großer Teil der Brunnenoberfläche sichtbar ist (z. B. nicht von den Brunnenwänden der Platte aus dem Blickfeld herausgehalten). Wenn die Fliegen ihren KDT erreichen, fallen sie auf den Grund des Brunnens; in diesem Fall die Seite am nächsten an der Webcam, und sind daher im Blick, unabhängig davon, wie weit ihr Brunnen von der Mitte der Ansicht ist.
    8. Verbinden Sie die Webcam mit einem Computer.
    9. Mit Klebeband, befestigen Sie ein weißes Blatt Papier (8,5 cm x 13 cm; die genaue Fläche der Unterseite der 96 Well Platte) an der Unterseite des Regals(Abbildung 4). Stellen Sie sicher, dass das Papier den gesamten Rahmen füllt, wenn es über die Webcam angezeigt wird.
    10. Legen Sie eine Lichtquelle in den Inkubator. Verwenden Sie Papier oder andere Materialien, um die Beleuchtung zu dämpfen und Blendung zu minimieren.
      ANMERKUNG Schritt 2.1.10 ist spezifisch für jeden Inkubator, da Beleuchtung und Reflexionen zwischen Inkubatoren variieren. Das Ziel ist es, genügend Beleuchtung im Inkubator zu haben, um einen guten Kontrast zwischen den Fliegen in jedem Brunnen und dem weißen Blatt Papier hinter der Platte zu bieten, wenn man es mit der Webcam betrachtet.
  2. Durchführung des KD-Testes
    1. Stellen Sie den Inkubator auf 37,5 °C und warten Sie etwa 30 min, um dem Inkubator Zeit zu geben, um die gewünschte Temperatur zu erreichen und aufrechtzuerhalten. Die genaue Temperatur hängt davon ab, ob das Insekt bewertet wird und andere Zeitüberlegungen.
    2. Legen Sie die 96-Well-Platte invertiert in den Inkubator, so dass die Unterseite der Platte (Netzseite) gegen das weiße Papier auf der Unterseite des Fachs ist (Abbildung 4). Beachten Sie die Ausrichtung der Brunnen (Spalten- und Zeilennamen) auf dem Tablett und im Rahmen der Webcam. Farbiges Klebeband an den Seiten der 96-Well-Platte und die Ränder des weißen Blattes Papier können die Ausrichtung überprüfen (Abbildung 4).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Inkubatortemperatur mit der Temperatur innerhalb der 96-Well-Platte übereinstimmt, indem Sie die Temperatur im Inneren der Platte mit einem Thermoelement während eines Testversuchs des KD-Testes der Wärme aufzeichnen. Es ist auch ratsam zu überprüfen, ob es eine vernachlässigbare Temperaturschwankungen zwischen den Brunnen der 96-Well-Platte mit mehreren Thermoelementen gibt, bevor der Wärme-KD-Test durchgeführt wird.
    3. Schließen Sie die Inkubatortür.
    4. Klicken Sie auf die Videoaufzeichnungssoftware auf Aufzeichnen.
    5. Nach 2 h, überprüfen Sie die Aufnahme, um zu sehen, dass alle Fliegen ihren letzten Ruheplatz erreicht haben und aufhören, sich zu bewegen. Sobald sich alle Fliegen nicht mehr bewegen, klicken Sie auf Stopp in der Videoaufzeichnungssoftware. Für die hier getesteten Genotypen, die bei 25 °C aufgezogen werden, erreichen die meisten Fliegen ihr KDT um 60 min bei 37,5 °C (siehe auch J.R.nensen et al.9).
    6. Entsorgen Sie die Fliegen.
    7. Verwenden Sie die benutzerdefinierten Python-Skripte (Supplementary Coding Files 1-3), um die Zeit im Video anzunähern, wenn Fliegen ihre Hitze KDT erreichen.
      HINWEIS: Schritt 2.2.7 ist optional. Um die Videoanalyse zu beschleunigen, wurden eine Reihe benutzerdefinierter Python-Skripte entwickelt, um Änderungen der Pixeldichte im Laufe der Zeit in jedem Bohrwert zu messen (siehe Ergänzende Codierungsdatei). Wenn sich die Fliegen nicht mehr bewegen, ist die Pixeldichte konstant, und ein Diagramm dieser Daten kann verwendet werden, um die ungefähre Zeit im Video zu lokalisieren, wenn Fliegen niedergeschlagen werden. Während es möglich sein kann, dieses Skript zu verwenden, um die Datenanalyse zu automatisieren, führen derzeit leichte Unvollkommenheiten im Video zu geringfügigen Abweichungen zwischen Änderungen der Pixeldichte und der tatsächlichen KD-Zeit.
    8. Klicken Sie auf die Videodatei öffnen und die KDT jeder Fliege in jedem Brunnen aufzeichnen. Das beständigste Maß für die Hitze KDT zwischen Versuchs- und Beobachtern ist die Aufzeichnung der Zeit, zu der eine Fliege ihren letzten Ruhepunkt erreicht.
    9. Verfolgen Sie das Video rückwärts, konzentrieren Sie sich auf einen einzelnen Brunnen und notieren Sie die Zeit, zu der sich die Fliege zuerst von ihrem letzten Ruheplatz entfernt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Brunnen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die thermischen Grenzwerte (d.h. CTmin und Wärme KDT) von Weibchen aus dem Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) wurden gemessen, um die hochdurchsatzbasierten Daten zu demonstrieren, die aus den beiden beschriebenen Protokollen generiert wurden. CTmin wurde anhand der DGRP-Linien 714 (n = 37) und 913 (n = 45) geprüft. Heat KDT wurde untersucht und mit den DGRP-Linien 189 (n = 42) und 461 (n = 42) verglichen, und Videodateien wurden manuell ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion


Die beiden oben beschriebenen Methoden erzeugen Hochdurchsatzdaten ökologisch relevanter Metriken für obere und untere thermische Grenzwerte. Diese Protokolle bauen auf bereits etablierten Methoden auf, die für die Erforschung von Insektengrenzwerten üblich sind (zusammengefasst in Sinclair et al.) 6.Beide Protokolle können in kurzer Zeit (jeweils 2 h) abgeschlossen werden, erstellen Datensätze mit großen Stichprobengrößen, opfern keine Wiederholbarkeit oder Genauigkeit und minimieren Experime...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Ellie McCabe für die Unterstützung bei der Fliegenzucht. Diese Arbeit wird vom United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project Grant 1010996 und National Science Foundation Grant OIA-1826689 an N.M.T. unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ARCTIC A40 Gekühlter Flüssigkeitsthermostat (programmierbare Temperaturrampen)Thermo Scientific; Waltham, MA153-5401
C922 Pro Stream WebcamLogitech; Newark, CA960-001087
Kreisförmiger verstellbarer Stahlschlauch – 5,08 cm bis 7,62 cmAny Any
Acrylschlauch – 5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cmStates Plastic Corp., OH44036
Transparenter Acrylschlauch – 6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cmUnited States Plastic Corp., OH440515
Durchsichtige Acrylrohre – 7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm UnitedStates Plastic Corp., OH44041
Transparenter SilikondichtstoffAlleAlle
(15 ml)AlleAlle Akku-Bohrmaschinen
AlleDrosophila
Funnel Monitor (DFM)TriKinetics; Waltham, MADFMWird verwendet, um die Anzahl der Fliegen zu zählen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt durch den Trichter fallen
DAM-DatenerfassungssoftwareTriKinetics; Waltham, MAZeichnet die vom DFM
Fly Storage Lid; Seatle, WAFS-96LID-5PKWird verwendet, um Fliegen in die Speicherplatte für den sCTmax-Assay
zu laden Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WAFS-96PLATE-5PKWird verwendet, um Fliegen während des sCTmax-Assays zu halten
Fly Food TrayFlySorter; Seatle, WAFS-TRAY-5PKWird verwendet, um Fliegen nach dem Laden in die 96-Well-Platte auf Lebensmitteln zu halten, bis der sCTmax-Assay
GlastrichterKimax28950-7575 mm
DachrinnenschutzBeliebig~0,5 cm Durchmesser Öffnungen
BügelsägeBeliebig
Heratherm Thermo Scientific InkubatorThermo Scientific; Waltham, MAOMS100
Schlauch Nylon Adapter (2) – ¼ MNPT x 3/8United States Plastic Corp., OH61135
Heißklebepistole und -kleberAlleAlle
LichtquellenAlle
OMEGA TC-08 Recorder und TC-08 Player SoftwareOMEGA; Norwalk, CT
OMEGA Thermoelement (Typ T)OMEGA; Norwalk, CT5LRTC-TT-K-20-36
KunststofftrichterBeliebigDurchmesser
Kunststoffschlauch - 0,6 cm DurchmesserUnited States Plastic Corp., OH62852
RetortenringBeliebig beliebig2"
Durchmesser Retortenständerbeliebig
beliebig beliebig
Rstudio
Steckverbinder für die serielle Schnittstelle (PSIU9)TriKinetics; Waltham, MAPSIU9Zwischenverbindung zwischen dem DFM und dem Computer, ermöglicht mehrere DFM-Verbindungen
Styropor (2" dick)Jedes
beliebige Band Jedes beliebige BandJedesununterbrochene
Netzteil (PS9-1)TriKinetics; Waltham, MAPS9-1Netzteil für das DFM und PSIU9
Anschweißen #4 AcrylzementUnited States Plastic Corp., OH45737
United Entnahmeröhrchen FlySorter eingegebenen Daten auf Magnete Alle 2" Retortenklemme beliebig

Referenzen

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. Angilletta, M. J. Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , New York, NY. (2009).
  3. Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
  4. Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
  5. MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593(2019).
  6. Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
  7. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  8. Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
  9. Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
  10. Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
  11. Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
  12. Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
  13. Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
  14. Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
  15. Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
  16. Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946(2019).
  17. Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
  18. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
  19. Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
  20. Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
  21. Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
  22. Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
  23. Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
  24. MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  25. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
  26. Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
  27. Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
  28. Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
  29. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
  30. Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
  31. Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
  32. Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
  33. Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Kritisches thermisches MinimumHitze-Knockdown-Zeitthermische Toleranz von InsektenDrosophila-Trichtermonitor96-Well-Platten-AssayTemperaturrampen-ProtokollVideoaufzeichnungsanalyseMessung der thermischen GrenzeReaktion auf den Klimawandel
High-Throughput-Tests kritischer thermischer Grenzwerte bei Insekten
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.