Generierung von hiPSC-abgeleiteten Darmorganoiden für Entwicklungs- und Krankheitsmodellierungsanwendungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht die Differenzierung menschlicher pluripotenter Zellen in Darmorganoide. Das Protokoll ahmt die normale menschliche Entwicklung nach, indem es Zellen in eine Population von definitivem Endoderm, Hinterdarm-Endoderm und dann Darmepithel differenziert. Dadurch eignet sich das Protokoll sowohl für die Untersuchung der Darmentwicklung als auch für Anwendungen zur Modellierung von Krankheiten.

Zusammenfassung

hiPSC-abgeleitete intestinale Organoide sind Epithelstrukturen, die sich selbst aus differenzierten Zellen zu komplexen 3D-Strukturen zusammensetzen, die für das menschliche Darmepithel repräsentativ sind, in dem sie kryptisch/zottenartige Strukturen aufweisen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Generierung von hiPSC-abgeleiteten intestinalen Organoiden durch die schrittweise Differenzierung von hiPSCs in definitives Endoderm, das dann posteriorisiert wird, um Hinterdarmepithel zu bilden, bevor es in 3D-Kulturbedingungen überführt wird. Die 3D-Kulturumgebung besteht aus extrazellulärer Matrix (EZM) (z. B. Matrigel oder andere kompatible EZM), die mit SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-Spondin-1 und CHIR99021 ergänzt wird. Organoide durchlaufen alle 7 Tage eine Passage, bei der sie mechanisch gestört werden, bevor sie in die frische extrazelluläre Matrix übertragen und sich ausdehnen können. QPCR und Immunzytochemie bestätigen, dass hiPSC-abgeleitete intestinale Organoide reife Darmepithelzelltypen wie Becherzellen, Panethzellen und Enterozyten enthalten. Darüber hinaus zeigen Organoide Hinweise auf Polarisation durch Expression von Villin, das auf der apikalen Oberfläche von Epithelzellen lokalisiert ist.

Die daraus resultierenden Organoide können verwendet werden, um die menschliche Darmentwicklung sowie zahlreiche menschliche Darmerkrankungen einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen zu modellieren. Um eine Darmentzündung zu modellieren, können Organoide Entzündungsmediatoren wie TNF-α, TGF-β und bakteriellem LPS ausgesetzt werden. Organoide, die proinflammatorischen Zytokinen ausgesetzt sind, zeigen als Reaktion darauf einen inflammatorischen und fibrotischen Phänotyp. Die Paarung von gesunden und hiPS-Zellen von Patienten mit CED kann nützlich sein, um die Mechanismen zu verstehen, die CED antreiben. Dies könnte neue therapeutische Ziele und neue Biomarker aufdecken, die bei der Frühdiagnose von Krankheiten helfen.

Einleitung

Die Eigenschaften pluripotenter Stammzellen (PSCs), wie z. B. die Selbsterneuerung und die Fähigkeit, sich zu jedem Zelltyp des menschlichen Körpers zu differenzieren, machen sie zu wertvollen Werkzeugen für die Erforschung der Entwicklung, der Krankheitspathologie und der Arzneimitteltests¹. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) sind besonders nützlich für Krankheitsmodellierungsstudien, da sie von Patienten abgeleitet werden können und das für den Krankheitsphänotyp verantwortliche Genom direkt erfassen ^2,3. Solche hiPS-Zellen können zu dem vom Gendefekt betroffenen Zelltyp differenziert werden, was eine sorgfältige Untersuchung des molekularen Mechanismus der Krankheit ermöglicht⁴.

Differenzierungsprotokolle für humane PSCs zielen darauf ab, die Differenzierung von Zellen über die wichtigsten Entwicklungsstadien durch Aktivierung oder Hemmung spezifischer Signalwege zu steuern, die die Bindung und Spezifizierung der Abstammungslinie steuern. Die Aufrechterhaltung von hiPSC in einem pluripotenten Zustand erfordert moderate Konzentrationen von Activin A (Act-A)-Signalwegen, während eine hohe Dosierung von Act-A für 3 Tage hiPSC zu einem definitiven Schicksal des Endoderms (DE) verpflichtet ^5,6. Act-A- und Wnt-Signalwege steuern die anterior-posteriore Identität des DE. Die Signalübertragung durch Act-A induziert Marker für den Vorderdarm (FG) wie HHEX, HNF4α und GATA4 und blockiert gleichzeitig die Expression von Hinterdarm-Genen (HG) wie CDX2. Der Wnt-Signalweg induziert die Posteriorisierung des DE, das dann ein HG-Genexpressionsprofil annimmt ^7,8. Sobald die HG-Zellidentität festgestellt ist, kann die Differenzierung von 2D auf 3D verschoben und auf die Bildung von Darmorganoiden gerichtet werden.

Intestinale Organoide werden typischerweise in einem auf einer extrazellulären Matrix basierenden 3D-Kultursystem⁽z. B. Matrigel oder andere kompatible EZMs) 9 kultiviert, das aus Laminin, Kollagen IV und Entactin besteht und mit Wachstumsfaktoren wie EGF, FGF, PDGF und IGF-1 angereichert ist, um das Überleben und die Proliferation zu unterstützen. Die Organoide werden in einem definierten Medium kultiviert, das Gastrin, Noggin und CHIR enthält, um das Wachstum und die Proliferation von Darmstammzellen während der Langzeitkultur zu stimulieren und zu unterstützen.

Nachdem die Darmepithelzellen in die extrazelluläre Matrix eingebettet sind, beginnen sich Darmkrypten zu bilden und auszudehnen und bilden schließlich Sphäroide. Diese reifen zu organoiden Strukturen heran, die die physiologische Funktion des Darmepithels nachahmen. Organoide können in der Regel länger als 1 Jahr kultiviert werden, ohne dass es zu einem signifikanten Verlust von Funktions- und Genexpressionsprofilen kommt. Eine wöchentliche Passage ist erforderlich, wobei die Organoide in kleinere Fragmente zerlegt werden, die sich dann selbst zu vollständigen Organoiden zusammensetzen.

Etablierte Organoidlinien können als zuverlässiges Modell für zahlreiche Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Darm verwendet werden, darunter Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Darmkrebs 10,11,12,13. Dies ist ein bevorzugtes Modell für tierische Zellen, da sie menschliche Gene exprimieren, die mit diesen Erkrankungen verbunden sind, und auf äußere Reize reagieren, die denen ähneln, die in menschlichem Gewebe in vivo auftreten.

Protokoll

HINWEIS: Alle unten aufgeführten Gewebekulturarbeiten sollten in einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II durchgeführt werden.

1. Differenzierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs) zum Endoderm des Hinterdarms

1. Um einen Zellkulturkolben mit extrazellulärer Matrix zu beschichten, berechnen Sie zunächst die benötigte Menge der Matrix. Hier ist ein Beispiel für eine 12-Well-Platte, die mit Matrigel beschichtet ist. Berechnen Sie die erforderliche Menge an extrazellulärer Matrix, um eine 12-Well-Platte zu beschichten. Verwenden Sie die folgende Formel:
   
   HINWEIS: Beschichten Sie Zellkulturschalen mit extrazellulärer Matrix Ihrer Wahl. Bei Verwendung von Matrigel ist 24 Stunden vor der Aussaat zur Differenzierung eine Konzentration von 0,035 mg/^cm2 zu verwenden. Überprüfen Sie die Chargenkonzentration der extrazellulären Matrix auf dem Produktblatt und bereiten Sie kleinere Aliquots vor den Experimenten gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
2. Verdünnen Sie die erforderliche Menge an extrazellulärer Matrix in kalten DMEM-Medien mit einer p1000-Pipette.
3. Mit einem 5-ml-Streifen gut mischen.
4. Geben Sie 500 μl verdünnte Matrix in jede Well-Platte. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die verdünnte extrazelluläre Matrix gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie mindestens 12 Stunden bei 37 °C.
5. Bevor Sie die Zellen auf die Platte bringen, waschen Sie jede Vertiefung mit 500 μl PBS, um überschüssige extrazelluläre Matrix zu entfernen. Dadurch wird eine Zellablösung während der Differenzierung verhindert.
6. Lassen Sie die letzte Wäsche bis zur Aussaat in den Vertiefungen, um das Austrocknen der extrazellulären Matrix zu verhindern.
7. Um die hiPS-Differenzierung in Richtung definitives Endoderm (DE) oder Hinterdarm (HG) zu fördern, nehmen Sie einen Kolben mit hiPSCs, die in einem Erhaltungsmedium Ihrer Wahl kultiviert wurden (z. B.: essentielle 8 Medien) und saugen Sie das Medium ab. (Hier säen wir Zellen mit 25.000 Zellen/^cm2 aus).
   HINWEIS: Die Aussaatdichte ist entscheidend für eine erfolgreiche Differenzierung und muss für jede einzelne hiPSC-Zelllinie optimiert werden.
8. Die Zellen im Kolben werden mit 5 ml PBS gewaschen. Saugen Sie das PBS ab.
9. 2,5 ml Zelldissoziationslösung (z. B. TrypLE) zugeben und 4 Minuten bei RT belassen. Saugen Sie die Zelldissoziationslösung an und klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen zu lösen.
10. Waschen Sie den Kolben mit 5 ml DMEM-Medium, das auf 37 °C erwärmt ist, und sammeln Sie alle Zellen in einem 15-ml-Röhrchen.
11. Nehmen Sie 10 μl resuspendierte Zelllösung und messen Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer.
12. Nehmen Sie genug von der Zellsuspension, um 1,05 x 10⁶ Zellen zu sammeln, und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen.
13. Bei 160 x g 3 Min. schleudern. Während die Zellen zentrifugiert werden, saugen Sie PBS von der mit extrazellulärer Matrix beschichteten 12-Well-Platte ab.
14. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in 12 ml Erhaltungsmedien mit ROCK-Inhibitor (10 μM) resuspendiert.
15. Geben Sie mit einer p1000-Pipette 1 ml Zellsuspension in jede Vertiefung der 12-Well-Platte. Resuspendieren Sie die Zellen gut, um eine gleichmäßige Verteilung zwischen den Vertiefungen zu gewährleisten.
16. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen in den Vertiefungen der Platte zu verteilen, aber vermeiden Sie ein Verwirbeln des Mediums, da sich die Zellen dadurch in der Mitte der Vertiefungen konzentrieren.
17. In einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ geben.
18. Wechseln Sie das Medium 24 Stunden nach der Aussaat nur auf Wartungsmedien (z. B. essentielle 8 Medien) (kein ROCK-Inhibitor).
19. Um mit der Differenzierung zu DE zu beginnen, bereiten Sie das Endoderm-Basalmedium gemäß Tabelle 1 vor.
    HINWEIS: Zu Beginn der Differenzierung sollten die Zellen zwischen 60 und 80 % Konfluenz aufweisen.
20. Bereiten Sie 12 ml DE-Medien vor, indem Sie Activin A (100 ng/ml) und Wnt3 (50 ng/ml) zu den Endoderm-Basalmedien hinzufügen.
21. Erwärmen Sie das Medium auf 37 °C.
22. Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung der Gewebekulturplatte oder des Kolbens ab.
23. Beginnen Sie mit der DE-Differenzierung, indem Sie 1 ml DE-Medien in jede Vertiefung der 12-Well-Platte geben.
24. 24 Stunden nach Beginn der DE-Differenzierung (D1 DE) frische DE-Medien vorbereiten und Medienwechsel durchführen.
25. Wiederholen Sie Schritt 1.24 bei 48 h (D2 DE). Wenn in diesem Stadium viel Zelltod vorhanden ist, waschen Sie alle Vertiefungen vor dem Medienwechsel mit 500 μl PBS.
    HINWEIS: Um eine erfolgreiche Endodermdifferenzierung zu bestätigen, führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Expression von SOX17 zu beurteilen. Normalerweise erwarten wir, dass >80% der Zellen SOX17-positiv durch D3 DE sind. Wenn die Expression von SOX17 suboptimal ist, sollte die Zellaussaatdichte sowie die Konzentrationen von Act-A optimiert werden.
26. Beginnen Sie die HG-Differenzierung an dieser Stelle, d.h. 72 h nach Beginn der DE-Differenzierung. Bereiten Sie 12 ml HG-Medien vor, indem Sie CHIR99021 (3 μM) und RA (1 μM) zu den Endoderm-Basalmedien hinzufügen (Tabelle 1).
    HINWEIS: Bei D3 DE sollte die Zelle eine gleichmäßige Monoschicht gebildet haben. Eine optimale DE-Differenzierung ist entscheidend für weitere Stufen der Differenzierung.
27. Saugen Sie DE-Medien ab.
28. Beginnen Sie mit der HG-Differenzierung, indem Sie 1 ml HG-Medien in jede Vertiefung der 12-Well-Platte geben.
29. Setzen Sie die Differenzierung für 4 Tage mit täglichem Medienwechsel fort.
    HINWEIS: Um den Erfolg der DE-Postteriorisierung zu bestimmen, führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Expression von CDX2 zu beurteilen. Bei D4 der HG-Differenzierung erwarten wir normalerweise, dass >80% der Zellen CDX2-positiv sind. Wenn die Posteriorisation suboptimal ist, sollte die Konzentration von CHIR99021 optimiert werden.
30. Um eine Probe für die RNA-Extraktion zu entnehmen, saugen Sie Differenzierungsmedien ab und waschen Sie die Vertiefung mit 500 μl PBS.
31. Saugen Sie PBS ab und fügen Sie ein geeignetes Volumen des Zelllysepuffers aus einem RNA-Extraktionskit hinzu.
32. Kratzen Sie mit einer p1000-Pipette den Boden der Vertiefung ab, um die Lyse aller Zellen sicherzustellen.
33. Saugen Sie das Zelllysat an und geben Sie es in ein sauberes Röhrchen.
34. Fahren Sie mit der RNA-Extraktion fort oder frieren Sie das Lysat bei -20 °C ein, bis es für die RNA-Extraktion bereit ist.
35. Für die Immunfärbung werden Differenzierungsmedien abgesaugt und Vertiefungen mit 500 μl PBS gewaschen.
36. Saugen Sie das PBS an und fügen Sie 500 μl 4% PFA hinzu.
    HINWEIS: PFA ist giftig. Verwenden Sie geeignete PSA und befolgen Sie die örtlichen Laborverfahren für die PFA-Entsorgung.
37. Bei 4 °C 20 min inkubieren.
38. Entfernen Sie PFA und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 500 μl PBS.
39. Lassen Sie die letzte PBS-Wäsche auf den Zellen, bis Sie bereit sind, eine Immunfärbung durchzuführen.

2. Passage von Darmorganoiden

1. Bereiten Sie das intestinale Basalmedium gemäß Tabelle 2 vor.
2. Um von der 2D- in die 3D-Zellkultur zu wechseln, verwenden Sie eine 6-Well-Platte, um DE-Zellen aus hiPSCS zu erzeugen. Lösen Sie die Monoschicht der Zellen von der 6-Zell-Platte mit einem 5-ml-Streifen.
3. Die Zellen werden in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gefüllt, bevor sie 1 Minute lang bei 400 x g zentrifugiert werden, um ein Zellpellet herzustellen.
4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Darmwachstumsmedien, die Wachstumsfaktoren enthalten: SB202190 (10 μM), A83-01 (500 nM), Gastrin (10 nM), Noggin (100 ng/μL), EGF (500 ng/μL), R-Spondin1 (100 ng/mL), CHIR99021 (6 μM), ROCK-Inhibitor (10 μM).
5. Fügen Sie ein angemessenes Volumen der extrazellulären Matrix hinzu, abhängig von der Anzahl der Wells, in die eingearbeitet wird. Dies kann mit den folgenden Gleichungen berechnet werden.
   [1] Gesamtvolumen der extrazellulären Matrix/des extrazellulären Mediums (μl) = 30 μl * Anzahl der Wells der 48-Well-Platte
   [2] Erforderliches Volumen der extrazellulären Matrix (μL) = Antwort von [1] * 2/3
   [3] Erforderliches Medienvolumen (μl) = Antwort von [1] * 1/3
6. Geben Sie 30 μl Zellsuspension in die Mitte jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte.
7. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C warmen Inkubator für mindestens 5 Minuten, damit die extrazelluläre Matrix aushärten kann.
8. Sobald die Kuppeln der extrazellulären Matrix ausgehärtet sind, fügen Sie 300 μl Darmwachstumsmedien mit allen Wachstumsfaktoren in jede Vertiefung hinzu.
9. Die Platte wird wieder in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ gegeben.
   HINWEIS: Wenn nach 48 h keine Organoide mehr beobachtet werden können und/oder ein signifikanter Zelltod vorliegt, müssen die ROCKi- und NOGGIN-Konzentrationen möglicherweise optimiert werden.
10. Um die Organoide zu passieren, beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um die Dichte und Größe der Organoide zu beurteilen und festzustellen, ob sie passieren müssen.
11. Ersetzen Sie Zellkulturmedien durch eiskaltes PBS.
    HINWEIS: Organoide Kulturen müssen etwa alle 5-7 Tage aufgeteilt werden. Die Passage von Darmorganoidkulturen ist erforderlich, sobald eine Ansammlung von Zelltrümmern im Organoidlumen und eine Gelbfärbung des umgebenden Darmwachstumsmediums erkennbar ist.
12. Mechanisches Lösen von Organoiden und extrazellulärer Matrixkugel von der Platte durch eine Schabenbewegung mit einem 5-ml-Streifen.
13. Sammeln Sie die Organoide aus jeder Vertiefung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
14. Organoidsuspension bei 400 x g für 1 min zentrifugieren, um die Organoide zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand an, bis Sie die Oberseite des Zellpellets erreicht haben, und seien Sie vorsichtig, wenn Sie die sichtbare extrazelluläre Matrixschicht erreicht haben.
15. Resuspendieren Sie das Pellet in 15 ml eiskaltem PBS.
    HINWEIS: Dieser Schritt dient dazu, die verbleibende extrazelluläre Matrix zu waschen, die beim ersten Schleudern nicht entfernt wurde.
16. Bei 400 x g 1 Min. zentrifugieren. Saugen Sie das Medium bis zum Pellet an, das die Organoide enthält.
17. Resuspendieren Sie in 1 ml eiskaltem PBS. Brechen Sie mit einer p200-Pipette die intakten Organoide manuell auf, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.
    HINWEIS: Beobachten Sie die Größe der Organoide mit einem Lichtmikroskop, um festzustellen, ob sie weiter dissoziiert werden müssen.
18. Fügen Sie 9 ml Medien ohne Wachstumsfaktoren hinzu.
19. Bei 400 x g 1 Min. zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand an, bis die Organoide pelletieren.
20. Berechnen Sie die erforderliche Menge an extrazellulärer Matrix und Medien mit den folgenden Gleichungen:
    [1] Gesamtvolumen der extrazellulären Matrix/des extrazellulären Mediums (μl) = 30 μl * Anzahl der Wells der 48-Well-Platte
    [2] Erforderliches Volumen der extrazellulären Matrix (μL) = Antwort von [1] * 2/3
    [3] Erforderliches Medienvolumen (μl) = Antwort von [1] * 1/3
21. Resuspendieren Sie das Organoid-Pellet im berechneten Volumen des Darmmediums mit Wachstumsfaktoren (einschließlich Noggin & ROCK-Inhibitor).
22. Geben Sie das erforderliche Volumen der extrazellulären Matrix in diese Zellsuspension und resuspendieren Sie, um eine gleichmäßige Verteilung der Organoide zu gewährleisten.
23. Pipettieren Sie 30 μl dieser Suspension in die Mitte jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte (vorzugsweise in einem 37 °C-Inkubator vorgewärmt).
24. Die Platte für 5 min in einen 37 °C heißen Inkubator geben, bis die extrazelluläre Matrix ausgehärtet ist.
25. Bereiten Sie Darmmedien mit Wachstumsfaktoren (+ ROCK-Inhibitor) vor (ca. 17 ml pro 48-Well-Platte).
26. Geben Sie 300 μl in jede Vertiefung.
27. Inkubieren bei 37 °C bei 5 % CO₂.
28. Saugen Sie nach der Passage das Medium für die Darmorganoide ab und ersetzen Sie es alle 2-4 Tage durch frisches Darmmedium mit Wachstumsfaktoren (ohne Noggin & ROCK-Inhibitor).
    HINWEIS: Wenn nach 48 Stunden keine Organoide mehr beobachtet werden können und/oder ein signifikanter Zelltod vorliegt, müssen die ROCKi- und NOGGIN-Konzentrationen möglicherweise optimiert werden.
    HINWEIS: Darmorganoide reagieren auf eine Reihe von Entzündungsmediatoren in vivo. TNFα ist ein zelluläres Signalprotein, das an verschiedenen Entzündungsprozessen beteiligt ist.
29. Um eine Entzündungsreaktion bei Darmorganoiden auszulösen, bereiten Sie TNFα in einer Konzentration von 40 ng/ml nur in basalen Medien vor.
30. Saugen Sie Medien von der 48-Well-Platte ab.
31. Fügen Sie 300 μl vorbereitetes Basalmedium mit 40 ng/ml TNFα hinzu.
32. Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei 37 °C, um eine entzündungsfördernde Umgebung zu replizieren.
    HINWEIS: Darmorganoide reagieren auf eine Reihe von Entzündungsmediatoren in vivo. TNFα ist ein zelluläres Signalprotein, das an verschiedenen Entzündungsprozessen beteiligt ist.
33. Verbleibende Zellen werden durch Aspiration in eine Vakuumfalle mit 5 % Trigene entsorgt.

Ergebnisse

Ein Schema des Differenzierungsprotokolls ist in Abbildung 1A dargestellt. Am Tag 1 des Protokolls sollten hiPSCs kompakt sein und kleine Kolonien mit einer Gesamtkonfluenz von etwa 50-60% bilden. 24 Stunden nach der Induktion der Differenzierung in Richtung DE beginnen die Zellen, sich von den Stammzellkolonien zu entfernen und eine Monoschicht von Zellen zu bilden. Dies setzt sich in den folgenden 3 Tagen fort und sollte eine vollständige Monolage auf D3 der DE-Differenzierung bilden (Abbildung 1). Die Genexpression sollte im Verlauf der Differenzierung mit Pluripotenzmarkern (OCT4, NANOG, SOX2) überwacht werden, die auf D0 stark exprimiert und während der DE-Differenzierung schnell herunterreguliert werden. Während der DE-Differenzierung sollte die T-Expression auf D1 ihren Höhepunkt erreichen, gefolgt von EOMES und MIXL auf D2. Auf D2 sollten DE-Gene (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) exprimiert werden und bei D3 ihren Höhepunkt erreichen (Abbildung 2 und Abbildung 3). Die Zellen sollten durch DE D3 eine Monoschicht bilden und können dann in das Endoderm des Hinterdarms posteriorisiert werden. Während des Posteriorisierungsereignisses beginnen sich bereits in D2 3D-Strukturen zu bilden. Manchmal treten sie jedoch erst bei D4 oder gar nicht auf; Dies ist nicht immer ein Hinweis darauf, ob die Zellen fortfahren und Darmorganoide bilden oder nicht (Abbildung 1). Während der HG-Spezifikation sollte die CDX2- und HNF4a-Expression induziert werden und im Laufe der Zeit zunehmen (Abbildung 3).

Nach dem Transfer von 2D-Zellblättern in die extrazelluläre Matrix werden in den ersten 24 Stunden Klumpen von 2D-Zellen beobachtet. Nach 48 Stunden sollten sich die Zellblätter automatisch zu verdichteten 3D-Sphäroidstrukturen organisieren, die zunächst klein sind (Abbildung 4A) und dann im Laufe von 7-10 Tagen Kultur allmählich an Größe und Komplexität zunehmen (Abbildung 4B und Abbildung 4C). Organoide sollten erst dann durchgelassen werden, wenn sie eine klare Organoid-/Sphäroid-Morphologie mit offensichtlichem Epithel erreicht haben, wobei das Lumen in Richtung der Mitte des Organoids/Sphäroids zeigt (Abbildung 4D). In diesem Stadium kann die Immunzytochemie verwendet werden, um die Expression von Darmmarkern wie Villin und CDX2 zu bestätigen (Abbildung 5). Nicht alle Klumpen von 2D-Zellen entwickeln sich zu Organoiden, und es wird einige kontaminierende tote Zellen innerhalb der extrazellulären Matrix geben. Diese toten Zellschichten sollten ignoriert werden, bis die überlebenden Zellen große Organoide gebildet haben und bereit für die Passage sind.

Um eine Entzündung zu modellieren, kann TNFα dem Gewebekulturmedium für 24-48 h zugesetzt werden. Nach der Inkubation mit proinflammatorischen Molekülen werden Organoide mit der gleichen Technik geerntet, die für ihre Isolierung und Passage verwendet wird, und dann mit einer Zellpuffer-kompatiblen Anwendung wie QPCR oder Western Blot lysiert. Wenn kürzere Expositionen erforderlich sind, sollten Organoide zunächst aus der extrazellulären Matrix entfernt und TNFα in Suspension mit einem 1,5-ml-Röhrchen ausgesetzt werden. Die Behandlung von intestinalen Organoiden mit TNFα für 48 h induziert typischerweise die Expression von proinflammatorischen Markern (TNFα, IL1B, IL8, IL23) und wirkt sich negativ auf die Expression von intestinalen Epithelmarkern (LGR5, VIL) aus (Abbildung 6).

Endoderm Basalmedium		50 ml
RPMI 1640		48,5 ml
B27 Beilage		1 ml
1% NEAA		0,5 ml

Tabelle 1: Zusammensetzung des endodermalen Basalmediums zur Endodermdifferenzierung.

Intestinale Basalmedien		50 ml
Fortgeschrittene DMEM/F12		46,5 ml
HEPES-Puffer		0,5 ml
GlutaMAX		0,5 ml
Nicotinamid		0,5 ml
N2 Zuschlag		0,5 ml
B27 Beilage		1,0 ml
Stift/Streptokokken		0,5 ml

Tabelle 2: Zusammensetzung der intestinalen Basalmedien für die Kultur von Darmorganoiden

Abbildung 1: Morphologische Veränderungen während der Differenzierung von hiPSC über definitives Endoderm zur Hinterdarmlinie.
(A) Schematische Übersicht über das intestinale Differenzierungsprotokoll. Diese Zelllinie von hiPSC bildet lockere Kolonien kleiner Zellen mit einem hohen Verhältnis von Zellkern zu Zytoplasma. Im weiteren Verlauf der Differenzierung durchlaufen die Zellen Veränderungen, die mit dem Übergang vom epithelialen zum mesenchymalen Phänotyp übereinstimmen, und bilden durch DE D3 eine einheitliche Monoschicht. Sobald geeignete Signale abgegeben werden, verlängern sich die DE-Zellen und bilden eine dichter gepackte Monoschicht mit 3D-Sphäroide, die bereits bei HD D3 erscheinen, aber dies hängt von der verwendeten Zelllinie ab und ist keine Voraussetzung für den Übergang zur 3D-Kultur (B). Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Die Differenzierung von hiPSCs zum HG-Endoderm induziert die Expression endodermaler Gene.
Die Immunfärbung von hiPSC, die zum definitiven Endoderm differenzieren, zeigt Veränderungen in der Expression von TFs auf Proteinebene. Pluripotenzmarker (NANOG und OCT4) werden durch DE D3 (A) herunterreguliert. Die Expression des Mesendodermmarkers BRA(T) ist an D1 des Protokolls (B) vorhanden und DE-spezifische TFs SOX17 und FOXA2 erscheinen auf D2 (B & C). Maßstab: 200 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Veränderungen der Genexpression durch qPCR während der hiPSC-Differenzierung zum Hinterdarm-Endoderm (HG).
Gene, die mit Pluripotenz assoziiert sind, werden herunterreguliert (OCT4, NANOG, SOX2), gefolgt von der vorübergehenden Expression von Mesendoderm-Genen (T, EOMES, MIXL1) und schließlich der Expression von DE-Genen (SOX17, FOXA2, CXCR4) und Hinterdarm-Genen (CDX2, GATA4, HNF4a). Die Daten werden als Mittelwert ±SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: HG-Endoderm assembliert sich selbst, um 3D-Darmorganoide in einer extrazellulären 3D-Matrixkultur zu bilden.
HG-Endoderm wird in eine geeignete extrazelluläre 3D-Matrixkultur überführt und bildet zunächst kleine feste Zellklumpen (A). Klumpen von HG-Endoderm dehnen sich über 7-10 Tage Kultur aus (B) und werden dann asymmetrisch und beginnen, ein komplexeres Epithel (C) zu bilden, was schließlich zu Organoiden mit klarer Epithelmorphologie und einer luminalen Oberfläche führt, die zum Zentrum des Organoids zeigt (D). Maßstabsbalken = 50 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Etablierte hiPSC-abgeleitete intestinale Organoide exprimieren intestinale Marker.
Immunzytochemie mit Expression von CDX2 und Villin. Maßstabsbalken = 100 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Wirkung von TNFα auf das Entzündungsprofil und die intestinale Zellexpression gesunder Darmorganoide.
Entzündungsprofil gesunder Dickdarmorganoide nach 48-stündiger Behandlung mit TNFα (40 ng/ml). Die Expression von pro-inflammatorischen Markern (TNFα, IL-8 & IL-23) steigt nach der Exposition gegenüber TNFα an, während gleichzeitig die Expression von intestinalen Epithelmarkern (LGR5, VIL) herunterreguliert wird. Die statistischen Auswertungen erfolgten mittels zweiseitigem Studierenden-t-Test. Die Daten werden als Mittelwert ± SD jeder Gruppe ausgedrückt. *P < .01; **P < .001; P < .0001. (n=3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Differenzierung humaner pluripotenter Zellen in humane Darmorganoide. Wir demonstrieren ihre Verwendung zur Untersuchung von Entzündungen; Dies kann jedoch auf verschiedene Kontexte angewendet und mit CRISPR/Cas9-Gen-Editierungsansätzen¹⁴ auf jeden genetischen Hintergrund gekoppelt werden. Nach der Differenzierung, nach der natürlichen Entwicklungsdifferenzierungssequenz von endgültigem Endoderm, Hinterdarm-Endoderm und dann Darmepithel, können die resultierenden Organoide mehr als 12 Monate lang kontinuierlich kultiviert und durchlaufen werden.

Ein kritischer Aspekt dieses Protokolls ist die anfängliche Plattierungsdichte von undifferenzierten Stammzellen vor der Endodermdifferenzierung. Wenn dies nicht ausreichend optimiert wird, sterben die Zellen wahrscheinlich während des ersten DE-Differenzierungsschritts ab (wenn die Zellen zu dünn sind) oder verringern die Effizienz der DE-Differenzierung (wenn die Zellen zu dicht sind). Die richtige Ausgangsdichte muss für die verwendete Zelllinie optimiert werden, und die richtige Dichte sollte bis zum Ende von DE D3 eine Monoschicht erzeugen. Die Durchflusszytometrie sollte verwendet werden, um die Effizienz der DE-Spezifikation zu bestimmen, und wir sehen in der Regel >80% der Zellen positiv für SOX17 und/oder CXCR4. Wenn die Anzahl der SOX17-positiven Zellen weniger als 60 % beträgt, wird die Effizienz der HG-Strukturierung beeinträchtigt, was dazu führt, dass sich weniger Organoide bilden, wenn sie in die extrazelluläre Matrix übertragen werden. Dies führt letztendlich zum Versagen der resultierenden Organoidkulturen. Um festzustellen, ob die Musterung von DE zu HG erfolgreich war, beurteilen wir die Anzahl der CDX2-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie und erwarten in der Regel >80% positive Zellen. Auch hier gilt: Wenn die Anzahl der CDX2-positiven Zellen unter 50 % fällt, wirkt sich dies nachteilig auf die Anzahl der Darmorganoide aus, die beim Transfer in die extrazelluläre 3D-Matrixkultur erzeugt werden.

Nach dem Transfer von 2D-Monolagen in die 3D-Kultur sollten 24-48 h nach dem Transfer kleine kompakte Kugeln erscheinen. Je nach Differenzierungseffizienz der verwendeten Zelllinie können große Schichten abgestorbener Zellen auftreten. Anstatt die Kulturen sofort weiterzuleiten, um diese Trümmer zu entfernen, lassen wir die Organoide sich vollständig bilden und ihre komplexere, gefaltete Struktur entwickeln. Wenn Sie 7-10 Tage warten, bevor Sie den ersten Versuch unternehmen, stellen Sie sicher, dass genügend sich teilende Zellen vorhanden sind, um viele neue Darmorganoide zu bilden. Alle Ablagerungen, die noch in der Kultur vorhanden sind, können während des Passageprozesses leicht entfernt werden, indem die dissoziierten Organoid-/Trümmermischungen langsam in einem Röhrchen mit ausreichender Geschwindigkeit geschleudert werden, um die Organoide zu pelletieren, aber Zellschichten im Medium schwimmen zu lassen. Medien und Zelltrümmer können dann abgesaugt werden, so dass nur noch das Pellet der Organoide übrig bleibt.

Die Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass hiPSC-abgeleitete Zelltypen in Bezug auf Genexpression und funktionelle Profile oft noch nicht vollständig ausgereift sind. Um festzustellen, ob hiPSC-abgeleitetes Darmgewebe für bestimmte Anwendungen geeignet ist, sollten die Organoide für verschiedene Zelltypen charakterisiert werden, darunter Enterozyten (VIL), enteroendokrine Zellen (Neurog3), Becherzellen (MUC2), transiente amplifizierende Zellen (CD133), Peth-Zellen (FZD5) und LGR5⁺ -Stammzellen (LGR5), um die zelluläre Zusammensetzung der Organoide zu bestimmen.

Insgesamt besteht der Hauptvorteil dieses Protokolls gegenüber vielen anderen Organoid-Differenzierungsprotokollen darin, dass diese Kulturplattform sehr kostengünstig ist, da mehrere rekombinante Proteine und konditionierte Medienpräparate durch kleine Moleküle ersetzt werden^15,16. Die Differenzierung in HG ist sehr einfach und schnell und kann sowohl auf humane embryonale als auch auf induzierte pluripotente Stammzellen mit identischen Ergebnissen angewendet werden. Wenn es rigoros befolgt und für die verwendeten Zelllinien optimiert wird, bietet es eine relativ einfache Modellplattform, die frei von kontaminierenden mesenchymalen Zellen ist und dann zur Untersuchung des Darmepithels in einer Vielzahl von Kontexten eingesetzt werden kann, einschließlich Entzündungen und Wirts-Pathogen-Interaktionen⁷. Die Modellierung der intestinalen Fibrose konnte durch die Bereitstellung profibrotischer Stimuli und die anschließende Bewertung der Expression von extrazellulären Matrixproteinen wie Kollagen, Laminin und Fibronektin mittels QPCR, Western Blot und ELISA untersucht werden. Die Verwendung von CRISPR/Cas9-Geneditierungstechniken an undifferenzierten Stammzelllinien vor der Differenzierung ermöglicht die Schaffung von Gen-Knockout- oder Protein-Überexpressions-Organoiden, die zur Herstellung krankheitsspezifischer Organoide und komplexerer Krankheitsmodelle verwendet werden könnten 14,17,18.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
A83-01	Tocris	2939
Activin A	R& D	338-AC
Advanced DMEM/F12 (1X)	Life Technologies	12654-010
B27 Nahrungsergänzungsmittel	Gibco	17504044
CHIR99021	Sigma	SML1046-5MG
Epidermaler Wachstumsfaktor	R& D Systems	236-EG-01M
Gastrin	Sigma Aldrich	G9145
GlutaMAX (100X)	Life Technologies	15630-056
Wachstumsfaktor reduziert Matrigel	BD
HEPES Pufferlösung (1M)	Life Technologies	15630-080
N2 Ergänzung (100X)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-Cystein	Sigma Aldrich	A7250
Nicotinamid	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	R& D Systems	6057-NG
Nicht-essentielle Aminosäuren	Gibco	11140-050
Paraformaldehyd	VWR	9713.5
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco	14190-094
Retinsäure	Sigma	302-79-4
ROCK-Hemmer	Tocris	1254/1
ROCK-Inhibitor Y-27632	Tocris	1254
RPMI	Sigma	R8758-500ml
R-Spondin-1	Peprotech	120-38
SB202190	Tocris	1264
TrypLe Express	Gibco	12604-021
Wnt 3a	R& D	5036-WN