Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Nicholas P. Boyer; Maite Azcorra; Peter Jung; Anthony Brown

doi:10.3791/61264

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Methodenartikel

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

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DOI:

10.3791/61264

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31. August 2020

Nicholas P. Boyer¹ , Maite Azcorra¹^,² , Peter Jung³^,⁴ , Anthony Brown¹

¹Department of Neuroscience, The Ohio State University, ²Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, ³Quantitative Biology Institute, Ohio University, ⁴Department of Physics and Astronomy, Ohio University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben Fluoreszenz-Photoaktivierungsmethoden zur Analyse des axonalen Transports von Neurofilamenten in einzelnen myelinierten Axonen peripherer Nerven von transgenen Mäusen, die ein photoaktivierbares Neurofilamentprotein exprimieren.

Zusammenfassung

Neurofilament-Proteinpolymere bewegen sich entlang von Axonen in der langsamen Komponente des axonalen Transports bei Durchschnittsgeschwindigkeiten von 0,35-3,5 mm/Tag. Bis vor kurzem war die Untersuchung dieser Bewegung vor Ort nur mit radioisotopischer Pulsbeschriftung möglich, die eine Analyse des axonalen Transports in ganzen Nerven mit einer zeitlichen Auflösung von Tagen und einer räumlichen Auflösung von Millimetern ermöglicht. Um den Neurofilamenttransport vor Ort mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung zu untersuchen, haben wir eine hThy1-paGFP-NFM transgene Maus entwickelt, die Neurofilamentprotein M mit photoaktivierbarem GFP in Neuronen ausdrückt. Hier beschreiben wir Fluoreszenz-Photoaktivierung Puls-Escape und Puls-Spread-Methoden zur Analyse des Neurofilamenttransports in einzelnen myelinierten Axonen von tibiaellen Nerven von diesen Mäusen ex vivo. Isolierte Nervensegmente werden auf der Mikroskopstufe durch Perfusion mit sauerstoffhaltiger Saline erhalten und durch drehende Plattenkonfokaleszenzmikroskopie abgebildet. Violettes Licht wird verwendet, um die Fluoreszenz in einem kurzen axonalen Fenster zu aktivieren. Die Fluoreszenz in den aktivierten und flankierenden Regionen wird im Laufe der Zeit analysiert, was die Untersuchung des Neurofilamenttransports mit zeitlicher und räumlicher Auflösung in der Größenordnung von Minuten bzw. Mikrometern ermöglicht. Mathematische Modellierung kann verwendet werden, um kinetische Parameter des Neurofilamenttransports einschließlich der Geschwindigkeit, der Richtungsverzerrung und des Pausungsverhaltens aus den resultierenden Daten zu extrahieren. Die Puls-Escape- und Puls-Spread-Methoden können auch angepasst werden, um den Neurofilamenttransport in anderen Nerven zu visualisieren. Mit der Entwicklung zusätzlicher transgener Mäuse könnten diese Methoden auch verwendet werden, um den axonalen Transport anderer zytoskelettaler und zytosolischer Proteine in Axonen abzubilden und zu analysieren.

Einleitung

Der axonale Transport von Neurofilamenten wurde erstmals in den 1970er Jahren durch radioisotopische Pulsbeschriftung¹demonstriert. Dieser Ansatz hat eine Fülle von Informationen über Neurofilament-Transport in vivoergeben, aber es hat relativ geringe räumliche und zeitliche Auflösung, in der Regel in der Größenordnung von Millimetern und Tagen bestenfalls². Darüber hinaus ist die radioisotopen pulsierende Kennzeichnung ein indirekter Ansatz, der die Injektion und das Opfer mehrerer Tiere erfordert, um einen einzigen Zeitverlauf zu erzeugen. Mit der Entdeckung fluoreszierender Proteine und Fortschritten in der F....