Methodenartikel

Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus

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DOI:

10.3791/61282

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9. September 2020

 ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das aktuelle Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Rückverfolgung von ventralen Tegmentalflächen (VTA) Glutamatprojektionen auf den Hippocampus. Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen wurde mit CA1-Aufnahmen kombiniert, um zu zeigen, wie VTA-Glutamat-Terminals die mutmaßliche pyramidale CA1-Feuerrate in vivo modulieren.

Zusammenfassung

Die optogenetische Modulation von Neuronensubpopulationen im Gehirn hat es Forschern ermöglicht, neuronale Schaltkreise in vivo und ex vivo zu sezieren. Dies bietet eine Voraussetzung für die Bestimmung der Rolle von Neuronentypen innerhalb eines neuronalen Schaltkreises und ihrer Bedeutung für die Informationscodierung in Bezug auf das Lernen. Ebenso kann die Methode verwendet werden, um die physiologische Bedeutung von zwei oder mehr miteinander verbundenen Hirnregionen bei wachen und betäubten Tieren zu testen. Die aktuelle Studie zeigt, wie VTA-Glutamat-Neuronen die Feuerrate von mutmaßlichen Pyramidenneuronen im CA1 (Hippocampus) anästhesierter Mäuse modulieren. Dieses Protokoll verwendet adeno-assoziierte Virus (AAV)-abhängige Markierung von VTA-Glutamat-Neuronen für die Rückverfolgung von VTA-präsynaptischen Glutamat-Terminals in den Schichten des Hippocampus. Die Expression von lichtgesteuertem Opsin (Channelrhodopsin; hChR2) und Fluoreszenzprotein (eYFP), die durch den AAV-Vektor beherbergt werden, ermöglichte die anterograde Rückverfolgung von VTA-Glutamatterminals und die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronenzellkörpern (im VTA). Hochimige akute Siliziumelektroden wurden im CA1 positioniert, um Reaktionen von mehreren einheiten und einzelnen Einheiten auf VTA-Photostimulation in vivo zu erkennen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die schichtabhängige Verteilung von präsynaptischen VTA-Glutamatterminals im Hippocampus (CA1, CA3 und DG). Auch die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen erhöhte die Feuer- und Burst-Rate von mutmaßlichen CA1-Pyramideneinheiten in vivo.

Einleitung

In den letzten zehn Jahren wurde eine Reihe genetischer Werkzeuge entwickelt, um die Spezifität der Modulation vom Neuronentyp und die Kartierung komplexer neuronaler Netze zu erhöhen1. Insbesondere neurotrope Viren mit einer inhärenten Fähigkeit, sich in neuronalen Zellen zu infizieren und zu replizieren, wurden eingesetzt, um bestimmte Proteine in Neuronensubtypen zu exprimieren oder abtränken. Bei der Unterung von Fluoreszenzproteinen oder genetisch kodierten synaptischen Aktivitätsindikatoren kennzeichnen und beschreiben transfizierte AAV-Vektoren neuronale Netzwerke über Gehirnregionen hinweg2,3. Die Wahl eines Promotors im AAV-Konstrukt steuert die Expression des Vektors in Neuronentypen mit einem gewissen Grad an Spezifität(promotorabhängige Expression). Durch die Cre-lox-Rekombination werden AAV-Konstrukte jedoch mit größerer Spezifität für die Neuronenmarkierung4,5,6,7eingesetzt. Bemerkenswert ist, dass photoaktivierte mikrobielle Opsine und Fluoreszenzproteine, die in AAV-Vektoren verpackt sind, in verschiedenen Neuronensubtypen8exprimiert werden können und ideal für die Bildgebung, die Verfolgung von Neuronenschaltungen und die Photomodulation9,10sind.

AAVs-Konstrukte, die stereotaktisch in eine Gehirnregion (oder einen Zellkern) injiziert werden, treiben die Expression des Reporterproteins in den Terminals soma, Dendriten und Axone an. Die neuronale Expression von AAV, die ein Reportergen (eYFP) beherbergt, erleichtert die Markierung von Neuronenzellkörpern und die anatomische Verfolgung von Projektionen zu und von anderen Gehirnregionen11,12,13,14. AAV-eYFP-Konstrukte, die lichtgesteuertes Opsin (z. B. hChR2) tragen, können als Werkzeug für die Bildgebungvon 6,15 und die stimulationsbasierte physiologische Verfolgung neuronaler Projektionen auf Hirnareale in vivo16eingesetzt werden. Abhängig vom AAV-Serotyp kann die Richtung der Neuronenmarkierung anterograde oder retrograd sein11,12. Frühere Studien haben ergeben, dass AAV5 anterograde in Neuronenreist 12. So erzeugt die Photostimulation von Zellkörpern, die hChR2 exprimieren, präsynaptische Effekte an anderer Stelle im Gehirn (Ziel)17.

Hier wurde AAV (Serotyp 5) mit einem CaMKIIα-Promotor verwendet, um eYFP (Reporter) und hChR2 (Opsin) in VTA-Glutamat-Neuronen und axonalen Projektionen zu exprimieren. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die schichtabhängige Verteilung von VTA-Glutamat-präsynaptischen Terminals in den Hippocampusregionen CA1, CA3 und DG. Auch die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen erhöhte die CA1-Feuerraten mit mehreren Einheiten und Einzeleinheiten in vivo im Vergleich zu den Ausgangswerten. Dieses Protokoll verwendet erschwingliche Tools und kommerziell erhältliche Software, die die Qualität der Daten aus neuronalen Schaltkreis-Tracing-Experimenten erhöhen können.

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Protokoll

Alle experimentellen und Tierhandhabungsverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Louisiana State University School of Veterinary Medicine genehmigt.

1. Versuchstier

  1. Verwenden Sie 5-6 Wochen alte Mäuse.
  2. Haus 3-5 Tiere pro Käfig unter Standardbedingungen von 12 h abwechselnd Hell-Dunkel-Zyklus. Nahrung und Wasser sollten ad libitum zur Verfügung gestellt werden.

2. Kraniotomie und tierische Zubereitung

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden prä- und perioperative Verfahren zur Kraniotomie bei der Maus beschrieben. Verwenden Sie Standard-stereotaktische Geräte und geeignete Koordinaten (Anteroposterior: AP, Mediolateral: ML und Dorsoventral: DV). Beziehen Sie sich auf einen Maus-Hirnatlas, um die Koordinaten für die interessierenden Gehirnregion zu bestimmen.

  1. Anästhesie von Mäusen durch intraperitoneale Ketamin (100 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) Cocktailinjektion. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um sicherzustellen, dass vor Beginn der Operation keine Empfindung auftritt.
    HINWEIS: Alternativ kann für diesen Schritt auch eine Isoflurananästhesie mit entsprechender Nasenkammer verwendet werden.
  2. Befestigen Sie den Kopf des Tieres vorsichtig auf dem stereotaktischen Apparat.
    HINWEIS: Es ist wichtig, während dieses Prozesses mit Tieren vorsichtig umzugehen. Überprüfen Sie auch die Atemfrequenz und andere Vitalwerte, bevor Sie mit der Operation fortfahren. Lassen Sie das Tier für ~ 7 Minuten ruhen, um Stress abzubauen.
    1. Legen Sie ein Heizkissen auf den stereotaxischen Rahmen, so dass der Körper des Tieres darauf liegt. Dies wird dazu beitragen, die Körpertemperatur zu halten und das Tier während des Verfahrens warm zu halten. Bewahren Sie das Heizkissen für die postoperative Pflege und Genesung auf.
  3. Verwenden Sie einen Clipper, um Haare über der Kopfhaut zu entfernen und reinigen Sie die Haut mit einer Jodlösung.
    1. Tragen Sie topisches Lidocain auf, um das Gefühl auf der Kopfhaut zu blockieren.
    2. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Mittellinienschnitt der Kopfhaut zu machen, der sich von der frontalen bis zur Okzipitalregion erstreckt.
    3. Reinigen Sie den Schnittbereich mit Jodlösung und legen Sie dann die Kalvarie frei.
      HINWEIS: Eine kleine Menge 3% iger Wasserstoffperoxidlösung kann aufgetragen werden, um Periost aus der Calvaria zu entfernen. Dies erhöht die Sichtbarkeit von Landmarken (Bregma und Lambda) und Nähten.
    4. Bestimmen Sie mit einem stereotaktischen Atlas des Mausgehirns ap- und ML-Koordinaten relativ zum Bregma.
    5. Positionieren Sie für die VTA-Injektion eine ultrafeine Stumpfpunktnadelspritze (z. B. Neuros-Spritze) an den Koordinaten AP: -3,08 mm/ML: 0,5 mm relativ zum Bregma.
    6. Verwenden Sie ein Bohrwerkzeug, um ein 1 mm Loch (Kraniotomie) in den Schädel an der markierten AP / ML-Koordinate zu bohren.
      HINWEIS: Dieser Schritt erfordert ein erhebliches Maß an Vorsicht. Während des Bohrens sollte minimaler Druck ausgeübt werden, um zu verhindern, dass der Bohrer das Hirngewebe zerquetscht. In der aktuellen Studie betrug der Bohrer 0,8 mm und die Bohrgeschwindigkeit wurde auf 15.000 U / min eingestellt.
      VORSICHT: Wenn Wasserstoffperoxid bei der Reinigung des Schnitts oder der Kalvarie verwendet wurde, stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig entfernt wird oder lassen Sie vor dem Bohren eine vollständige Trockenheit zu.

3. AAV Cocktail Injektion

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt den Prozess für die AAV-Injektion in den VTA von erwachsenen C57BL/6-Mäusen (23-27 g). Die beschriebene Methode kann für die AAV-Injektion in jede Gehirnregion unter Verwendung von Standard-stereotaktischen Geräten und geeigneten Koordinaten verwendet werden. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, wurden eYFP und hChR2 in VTA-Glutamat-Neuronen unter Verwendung einer AAV5-vermittelten Transfektion unter einem CaMKIIα-Promotor exprimiert (Abbildung 1). Cre-lox Rekombination kann auch für diesen Schritt verwendet werden.

  1. Montieren Sie eine Spritze mit ultrafeiner Stumpfpunktnadel (32 G; 5 μL Kapazität mit 100 nL Genauigkeit) auf einem Injektor. Befestigen Sie den Spritzenhalter auf einem Mikromanipulator.
    HINWEIS: Für dieses Verfahren wurde ein manueller Spritzenhalter mit 1,6 nL Kalibrierung verwendet. Ein automatisierter Injektor kann ebenfalls verwendet werden.
  2. Füllen Sie die Spritze mit doppelt destilliertem Wasser, um den Flüssigkeitsfluss zu reinigen und zu testen.
  3. Aliquoten von AAV (Serotyp 5) Cocktail auf Eis auftauen. AAVs werden am besten bei -80 °C gelagert, um den viralen Titer für eine gute Expression aufrechtzuerhalten.
  4. Füllen Sie die montierte Spritze mit 1.000 nL AAV-Lösung (10 mM in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4). Geben Sie 10 nL der AAV-Lösung ab, um den Flüssigkeitsfluss zu bestätigen, bevor Sie die Nadel in eine Injektionsstelle absenken.
  5. Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Nadel stereotaktisch in die gewünschte Tiefe (DV-Koordinate) abzusenken. Nachdem Sie die Nadel auf die gewünschte Tiefe abgesenkt haben, lassen Sie die Spritze vor der Injektion 10 Minuten an Ort und Stelle bleiben.
    HINWEIS: Für dieses Verfahren wurde die Nadel in einer Tiefe (DV) von 4,5 mm von der Pialoberfläche des Gehirns in den VTA abgesenkt. Für andere Hirnareale verwenden Sie die entsprechende dorsoventrale Koordinate (siehe Gehirnatlas der Maus).
  6. Injizieren Sie 600–800 nL AAV in den VTA. Das Injektionsvolumen kann je nach Größe der Zielstelle angepasst werden.
    1. Liefern Sie die AAV-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 60 nL/min (3-minütiges Intervall).
    2. Um eYFP und hChR2 in VTA-Glutamatneuronen und -projektionen zu exprimieren, injizieren Sie AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP.
      HINWEIS: Die Cre-lox-Rekombinationsmethode kann auch abhängig vom Ziel des Experiments verwendet werden.
    3. Lassen Sie die Nadel nach der AAV-Injektion 15 Minuten lang an Ort und Stelle bleiben. Dies reduziert Diffusion und Rückfluss.
  7. Ziehen Sie die Spritzennadel zurück und nähen Sie dann den Schnitt, um die Wunde zu schließen.
  8. Verabreichen Sie Antibiotika und Analgesie als Teil der postoperativen Versorgung. Legen Sie die Maus auf eine warme, gepolsterte Plattform und überwachen Sie das Tier bis zum Erwachen.
    HINWEIS: Nach 3 Wochen Injektion kann die AAV-Expression durch Fluoreszenzdetektion von Reporterprotein (eYFP) in Gehirnabschnitten von Mäusen beobachtet werden. Auch Photostimulationsexperimente können nach 3 Wochen durchgeführt werden (Abbildung 2).

4. Einrichtung für in vivo neuronale Aufnahmen mit Optogenetik

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt die Schritte für die akute neuronale Aufzeichnung mit der optogenetischen Nachverfolgung eines Gehirnschaltkreises (VTA-Glutamat-Neuronenprojektion auf das CA1). Überprüfen Sie ggf. das System (Verstärker und Anschlüsse) auf elektrisches Rauschen und Erdungsprobleme, bevor Sie mit diesem Schritt beginnen. Wenn Sie diesen Schritt in einem Faradayschen Käfig ausführen, können Sie elektrisches Rauschen in der Aufnahme beseitigen.

  1. 3 Wochen nach der AAV-Injektion betäuben Sie Mäuse durch intraperitoneale Urethan-Injektion (0,2 mg/kg).
    ACHTUNG: Urethan ist krebserregend und muss mit Schutzausrüstung vorsichtig behandelt werden. Auch die Verabreichung von Urethananästhesie in dieser Konzentration ist kein Überleben.
  2. Befestigen Sie den Kopf des Tieres wie zuvor beschrieben auf einem stereotaktischen Rahmen (Schritt 2.2, Abbildung 3A). Führen Sie eine Kraniotomie durch, um die Dura freizulegen (Abbildung 3A). Verwenden Sie ein Bohrwerkzeug (Bitgröße: 0,8 mm, Geschwindigkeit: 15.000 U / min), um einen Teil des Parietalknochens zu entfernen.
    1. Die Kraniotomie sollte etwa 3 mm x 4 mm breit sein. Tragen Sie Tropfen künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) über diesen Bereich auf, um Trockenheit zu verhindern.
  3. Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop (digital) eine gebogene Nadelspitze (27 G), um die freiliegende Dura zu entfernen. Achten Sie darauf, die empfindliche Pialbedeckung und das kortikale Gewebe in diesem Bereich nicht auseinander zu ziehen.
  4. Bohren Sie ein Loch in den Hinterhauptknochen (Bitgröße: 0,8 mm, Drehzahl: 10.000 U /min), um die Erdschraube (Schwenkkopf-Kreuzschlitzschraube; M0,6 x 2,0 mm).
  5. Schließen Sie einen Erdungsdraht aus Edelstahl an.
    HINWEIS: Andere Arten von Drähten können ebenfalls verwendet werden (Abbildung 3b).
  6. Für die kombinierte Photostimulation (VTA) und neuronale Aufzeichnung (CA1) verwenden Sie eine stereotaxische Mehrschienenvorrichtung, die mit ultrafeinen (10 μm oder 1 μm) Mikromanipulatoren ausgestattet ist. Montieren Sie die optische Faser und die aufzeichnungsneuronale Sonde auf einem Mikromanipulator im Bereich von 10 μm bzw. einem Mikromanipulator im Bereich von 1 μm.
    1. Verwenden Sie bei Bedarf einen Kopf-Stage-Probe-Adapter (Abbildung 3c).
      HINWEIS: Im aktuellen Protokoll wurde eine 32-Kanal-Kopfstufe mit einem Adapter für eine 4-Kanal-Aufzeichnungselektrode ausgestattet (Abbildung 3d). Der Edelstahl-Erdungsdraht wurde an den Masseanschluss des Adapters gelöt.
  7. Bei Koordinaten AP: -3,08 mm ML: 0,5 mm, senken Sie die optische Faser mit einem Durchmesser von 400 μm in den VTA.
    1. Bevor Sie die Glasfaser absenken, verbinden Sie die Ferrule mit einem Glasfaserkabel (mit Edelstahl- oder Keramikferrule), das mit einer fasergekoppelten LED-Quelle verbunden ist.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Lichtintensität und Fokus wie gewünscht eingestellt sind. Die Wahl der LED-Lichtquelle sollte den anvisierten Opsinen entsprechen. Hier wurde ein 470 nm (blaues Licht) LED-Treiber für die hChR2-Photoaktivierung verwendet (Abbildung 4a).
    2. Um den Lichtimpuls mit der neuronalen Aufzeichnung zu synchronisieren, schließen Sie den digitalen IN-Port des LED-Treibers und des Aufzeichnungscontrollers an einen Transistor-Transistor-Logik-Impulsgeber (TTL) an (Abbildung 4b). Dies kann mit einem BNC-Splitter erreicht werden.
      HINWEIS: Die Verwendung eines TTL-Pulsers bietet die Flexibilität, die gewünschte Impulszugfrequenz und -dauer digital einzustellen. Im aktuellen Protokoll wurden 10 ms Lichtimpulse bei 50 Hz18ausgelöst. Für die TTL-Steuerung des LED-Treibers schalten Sie den Treiber auf "Trigger". In diesem Modus kann die Lichtintensität durch Drehen des "Knopfes" reguliert werden. Die Stimulationsfrequenz kann an experimentelle Variablen angepasst werden und kann zwischen 1 und 100 Hz liegen. Für die neuronale Schaltkreisverfolgung wird eine Stimulationsfrequenz von >20 Hz empfohlen.
    3. Stellen Sie den Knopf ein, um die effektive Intensität zu bestimmen, die eine Reaktion erzeugen kann, ohne photoelektrische Artefakte zu erzeugen. Positionieren Sie die optische Faser bei Bedarf neu, um Artefakte zu beseitigen19.
      HINWEIS: Der für das aktuelle Protokoll verwendete LED-Treiber erzeugt eine Lichtleistung von ~21,8 mW.

5. Neuronale Aufzeichnung

  1. Verwenden Sie eine akute neuronale Sonde mit einem 15–50 μm dicken Schaft, der mindestens 5 mm lang ist.
    HINWEIS: Die Aufnahme von tiefen Gehirnstrukturen erfordert neuronale Sonden mit einem längeren Schaft. In der aktuellen Studie wurde eine Sonde mit 20 mm Schaftlänge verwendet.
  2. Schließen Sie die Vorverstärker-Kopfbühne über ein SPI-Kabel (Serial Peripheral Interface) an den Aufnahmecontroller an. Überprüfen Sie die Farbbeleuchtung der LEDs an den Anschlüssen des Aufnahmecontrollers. Grüne und gelbe LEDs zeigen die richtige Spannung auf der angeschlossenen Verstärkerplatine an. Rote LED zeigt eine funktionierende Software-Kopf-Bühnensteuerung an (Abbildung 5b).
  3. Positionieren Sie mit einem Mikromanipulator die Elektrodenkontaktstellen in der pyramidalen Zellschicht des CA1 (AP: -1,94 mm, ML: +1,0 mm, DV: +1,1 bis 1,2 mm).
    HINWEIS: Die optische Faser und die Elektrode können in anderen gewünschten Gehirnregionen zur Photostimulation und Aufzeichnung positioniert werden.

6. Verstärker- und Filtereinstellungen

  1. Schließen Sie das Aufnahmecontroller-Verstärkersystem über einen USB 3.0-Anschluss an einen Computer an. Verbinden Sie die Kopfbühne über das SPI-Kabel mit dem Verstärker. Starten Sie die Controller-Software. Wenn die Verbindung nicht ordnungsgemäß hergestellt ist, zeigt das System die Meldung "Gerät nicht gefunden" an.
  2. Klicken Sie auf Ausführen, um die Aktivitäten auf den Kanälen anzuzeigen. Jede Wellenform wird als Spannung (y-Achse) versus Zeit (x-Achse) dargestellt. Passen Sie je nach Interessenbereich die Spannungs- und Zeitskalen an, um die Wellenformanzeige anzupassen.
  3. Wenn nur wenige Kanäle aktiv sind, deaktivieren Sie nicht verwendete Kanäle, um die Dateigröße auf dem Speicherdatenträger zu reduzieren.
  4. Legen Sie die Abtastrate und die Abschaltfrequenzen fest, indem Sie Bandbreitenparameter in der Erfassungssoftware bearbeiten. Für Einzelaufnahmen stellen Sie die oberen und unteren Cutoff-Frequenzen auf 300 Hz bzw. 5.000 Hz ein. Ändern Sie die Abtastrate des Verstärkers auf 30 kS/s.
    HINWEIS: Wenn Sie eine hohe Abtastrate wählen, wird eine größere Dateigröße angezeigt.
  5. Überprüfen Sie vor der Aufzeichnung die Integrität der Elektrodenkanäle, indem Sie die Impedanz bei 1.000 Hz messen. Dies kann durch Starten der Funktion in der Benutzeroberfläche (Controller-Software) erfolgen. Ein Arbeitskanal sollte einen Impedanzwert haben, der zwischen 0,1 und 5 MΩ liegt.
  6. Wenn ein Audioausgang (Lautsprecher) an den ANALOG OUT-Anschluss angeschlossen ist, passen Sie die Verstärkung und den Schalldämpfer für einen optimalen Spike-Sound an.
  7. Um den TTL-Impulszugmarker in der Spike-Aufzeichnung anzuzeigen, aktivieren Sie die Anzeige für den DIGITAL IN-Marker. Um den Pulszugzeitstempel aufzuzeichnen, aktivieren Sie die DIGITAL IN-Kanalanzeige vor dem Hauptexperiment.
    HINWEIS: Es gibt normalerweise mehr als einen "DIGITAL IN" -Kanal (1 oder 2). Stellen Sie sicher, dass das BNC-Kabel des TTL-Pulsers an den "DIGITAL IN"-Port angeschlossen ist, der für die Anzeige in der Aufnahmecontroller-Software ausgewählt ist.
  8. Um die Spitzenwellenform in Echtzeit anzuzeigen, öffnen Sie das Fenster spike scope und legen Sie den Schwellenwert mit dem Mausklick fest.
  9. Überprüfen Sie den Geräuschpegel, indem Sie das Root Mean Square (RMS in μV) überwachen. Für die aufzeichnung eines sauberen Spikes wird bevorzugt, dass der schwellenwert für den neuronalen Spike mindestens 5x RMS beträgt.
  10. Sobald die Einrichtung abgeschlossen ist, wählen Sie das Dateiformat aus.
    HINWEIS: Hier wurde der ca1-neuronale Spike im .rhd-Format aufgezeichnet. Andere Dateiformate (.rhs und .dat) können ebenfalls ausgewählt werden, um den von der Analysesoftware zulässigen Dateiformaten zu entsprechen.

7. Optogenetische In-vivo-Aufzeichnung und -Einstellungen

  1. Öffnen Sie die Pulssteuerungssoftware (TTL), die verschiedene einstellbare Pulsparameter anzeigt. Wählen Sie den entsprechenden COM-Port in der Software aus. Stellen Sie die Pulsparameter ein, indem Sie die Zug- und Gruppeneinstellungen anpassen.
    HINWEIS: Die Pulsbedingung sollte unter Berücksichtigung experimenteller Variablen und des Designs bestimmt werden.
  2. Klicken Sie in der Verstärkersteuerungssoftware auf Ausführen, um neuronale Spitzen im Hippocampus oder im gewünschten Gehirnbereich zu erkennen. Passen Sie bei Bedarf die Elektrodentiefe an, um lebensfähige und aktive Neuronen zu erkennen.
  3. Sobald die extrazelluläre Spannungsaktivität erkannt wurde, beobachten Sie 15 Minuten lang Die Basislinienspitzen und überwachen Sie die Vitalwerte des Tieres. Testen Sie auch den Lichtpuls, um reaktionsschnelle Neuronen innerhalb des CA1 oder der gewünschten anatomischen Zielregion zu erkennen.
    HINWEIS: Überprüfen Sie auf photoelektrische Artefakte und beseitigen Sie sie, indem Sie die Lichtintensität oder die Position der optischen Faser anpassen.
  4. Zeichnen Sie die Basislinienaktivität für ~10 min auf, bevor Sie den Lichtimpuls mit der gewünschten Frequenz auslösen(Abbildung 5a,b). Dies ermöglicht den Vergleich von Feuer- oder Berstraten mit und ohne Beleuchtung.
    HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde die Basisaktivität für 10 Minuten ohne Beleuchtung aufgezeichnet, gefolgt von einer Beleuchtung bei 50 Hz (Film 1).

8. Analyse

  1. Konvertieren Sie die .rhd-Datei in das Nex5-Ausgabeformat.
  2. Dateiname des Prozesses. Nex5-Datei in einer Offline-Sorter-Software zur Erkennung von Rasterzügen und Wellenformen mit einer Einheit (Abbildung 5a–b).
    1. Wählen Sie den gewünschten Kanal aus dem Dropdown-Fenster aus.
      HINWEIS: Die kontinuierlich aufgezeichneten Spike-Daten können in einem separaten Fenster des OFSS angezeigt werden. Die Zeitskala kann ebenfalls angepasst werden. Wenn eine Tetrode verwendet wird, kann das OFSS so eingestellt werden, dass die 4 Kanäle als Tetrode sortiert werden.
    2. Legen Sie den Spannungspegel für die Wellenformextraktion fest, die schwellenwertüberquerend ist.
      ACHTUNG: Verwenden Sie mindestens 5x RMS für die ordnungsgemäße Spike-Erkennung.
    3. Erkennen Sie Wellenformen und führen Sie dann eine Spike-Sortierung mit der Talsuche (automatisch) oder der K-Means-Methode (halbautomatisch) durch. Führen Sie bei Bedarf Einheiten zusammen, die ähnliche Bereiche des 3D-PcA-Raums (Principal Component Analysis) einnehmen.
    4. Export sortiert . Nex5-Dateien zur weiteren Analyse (Abbildung 5c–d).
      HINWEIS: Analyseergebnisse für das Interspike-Intervall, die Feuerrate und die Burst-Rate können in andere Analyseplattformen exportiert werden.

9. Fluoreszenzdetektion der AAV-Expression

  1. Nach der Aufnahme das Tier in einer Isoflurankammer einschläfern.
  2. Transkardperfusion mit 10 mM PBS (~10 mL), gefolgt von 4% phosphatgepufferten Paraformaldehyd (PB-PFA, ~10 mL).
  3. Entfernen Sie das gesamte Gehirn intakt und fixieren Sie es in 4% PB-PFA für 48 h.
  4. Übertragen Sie das fixierte Gehirn in 4% PB-PFA mit 30% Saccharose zur Kryokonservierung bei 4 °C. Nach 72 h das Gehirn in einen Kryostaten schneiden und Scheiben auf einem gelatinebeschichteten Objektträger montieren.
    HINWEIS: Im aktuellen Protokoll wurden Abschnitte ausgewählt, die den geschlossenen Teil des Hippocampus (Rostral) enthalten, um AAV-markierte Terminals in DG, CA3 und CA1 zu demonstrieren.

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Ergebnisse

Anterograde Rückverfolgung

Die AAV-Expression wurde durch Immunfluoreszenz-Bildgebung des Reporterproteins (eYFP) im VTA von C57BL/6-Mäusen 21 Tage nach der Injektion verifiziert(Abbildung 2). Die erfolgreiche anterograde Markierung von präsynaptischen VTA-Glutamatprojektionen im Hippocampus wurde auch durch eYFP-Nachweis in den Schichten von DG, CA3 und CA1 nachgewiesen(Abbildung 6a–d; Film 2 und 3)....

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Diskussion

In den letzten zehn Jahren hat sich das Design von AAV-Konstrukten erheblich weiterentwickelt. Daher wurden mehr neuronenspezifische Promotoren in eine Reihe von AAV-Serotypen integriert, um die Transfektionsspezifität zu verbessern14. Durch die Kombination von Genen für Fluoreszenzproteine, Transporter, Rezeptoren und Ionenkanäle existieren nun Bibliotheken von AAV für bildgebung, neuromodulation und synaptische Aktivitätserkennung. In kommerziell erhältlichen AAV-Konstrukten ermöglicht eine Komb...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wird durch den CBS Bridging Grant finanziert, der ooM verliehen wird. OOM, PAA und AS entwarfen die Studie und führten die Experimente durch. AS und PAA analysierten die Ergebnisse. OOM und PAA bereiteten das Manuskript vor. Wir danken Dr. Karl Disseroth (Stanford University) für die Bereitstellung des AAV für unsere Nutzung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3% WasserstoffperoxidFisher chemikalieH312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYPAddgenePlasmid #26969
BNC KabelAmazon
BNC SplitterAmazon
Keramik Split Gegenhülse für Ø 1,25 mm Aderendhülsen.ThorlabsADAL1-5
BohrerDremelLR 39098
Mit Gelatine beschichtete ObjektträgerFisherwissenschaftliche OBSLD01CS
Hamilton's Spritze (Neuros)WPI Inc.06H
KopftischadapterNeuronexusAdpt-Q4-OM32
Hochohmige SilikonsondeNeuronexusQ1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording ControllerINTANRHD2000
JodlösungDynarex1425
IsofluranPiramalNDC 66794-017-25
KetamineSpectrumK1068
LED-TreiberThorlabsLEDD1B
LED-Lichtquelle (470 nm)-blaues LichtThorlabsM470F3
MikromanipulatorNarishigeM0-203
GlasfaserThorlabsCFMLC14L05
Schwenkkopf Kreuzschlitzschraube (M0,6 x 2 mm)AmazonM0,6 x 2 mm
Vorverstärker Kopfstufe (32 Kanäle)INTANC3314
Stereotaktischer RahmenKopf1530
TTL ImpulsgeberPrizmatix4031
UrethanSigmaU2500
XylazinAlfa AesarJ61430
SoftwareCompany Version
Graphpad PrismGraphPad SoftwareVersion 8
Intan Recording ControllerIntantechVersion 2.07
NeuroexplorerNex TechnologiesVersion 5.215
Plexon Offline Spike SorterPlexon IncVersion 4.5
ACSF Zusammensetzung:
sauerstoffhaltiges ACSF mit 95% Sauerstoff/5%CO2 ständig durch das ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 und 25 Glukose).
stark

Referenzen

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