Das aktuelle Protokoll demonstriert eine einfache Methode zur Rückverfolgung von ventralen Tegmentalflächen (VTA) Glutamatprojektionen auf den Hippocampus. Die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen wurde mit CA1-Aufnahmen kombiniert, um zu zeigen, wie VTA-Glutamat-Terminals die mutmaßliche pyramidale CA1-Feuerrate in vivo modulieren.
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Methodenartikel
Kombinierte in vivo anatomische und funktionelle Spurensuche von ventralen Tegmentalflächen-Glutamat-Terminals im Hippocampus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die optogenetische Modulation von Neuronensubpopulationen im Gehirn hat es Forschern ermöglicht, neuronale Schaltkreise in vivo und ex vivo zu sezieren. Dies bietet eine Voraussetzung für die Bestimmung der Rolle von Neuronentypen innerhalb eines neuronalen Schaltkreises und ihrer Bedeutung für die Informationscodierung in Bezug auf das Lernen. Ebenso kann die Methode verwendet werden, um die physiologische Bedeutung von zwei oder mehr miteinander verbundenen Hirnregionen bei wachen und betäubten Tieren zu testen. Die aktuelle Studie zeigt, wie VTA-Glutamat-Neuronen die Feuerrate von mutmaßlichen Pyramidenneuronen im CA1 (Hippocampus) anästhesierter Mäuse modulieren. Dieses Protokoll verwendet adeno-assoziierte Virus (AAV)-abhängige Markierung von VTA-Glutamat-Neuronen für die Rückverfolgung von VTA-präsynaptischen Glutamat-Terminals in den Schichten des Hippocampus. Die Expression von lichtgesteuertem Opsin (Channelrhodopsin; hChR2) und Fluoreszenzprotein (eYFP), die durch den AAV-Vektor beherbergt werden, ermöglichte die anterograde Rückverfolgung von VTA-Glutamatterminals und die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronenzellkörpern (im VTA). Hochimige akute Siliziumelektroden wurden im CA1 positioniert, um Reaktionen von mehreren einheiten und einzelnen Einheiten auf VTA-Photostimulation in vivo zu erkennen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die schichtabhängige Verteilung von präsynaptischen VTA-Glutamatterminals im Hippocampus (CA1, CA3 und DG). Auch die Photostimulation von VTA-Glutamat-Neuronen erhöhte die Feuer- und Burst-Rate von mutmaßlichen CA1-Pyramideneinheiten in vivo.
Einleitung
In den letzten zehn Jahren wurde eine Reihe genetischer Werkzeuge entwickelt, um die Spezifität der Modulation vom Neuronentyp und die Kartierung komplexer neuronaler Netze zu erhöhen1. Insbesondere neurotrope Viren mit einer inhärenten Fähigkeit, sich in neuronalen Zellen zu infizieren und zu replizieren, wurden eingesetzt, um bestimmte Proteine in Neuronensubtypen zu exprimieren oder abtränken. Bei der Unterung von Fluoreszenzproteinen oder genetisch kodierten synaptischen Aktivitätsindikatoren kennzeichnen und beschreiben transfizierte AAV-Vektoren neuronale Netzwerke über Gehirnregionen hinweg2,
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Protokoll
Alle experimentellen und Tierhandhabungsverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Louisiana State University School of Veterinary Medicine genehmigt.
1. Versuchstier
- Verwenden Sie 5-6 Wochen alte Mäuse.
- Haus 3-5 Tiere pro Käfig unter Standardbedingungen von 12 h abwechselnd Hell-Dunkel-Zyklus. Nahrung und Wasser sollten ad libitum zur Verfügung gestellt werden.
2. Kraniotomie und tierische Zubereitung
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden prä- und perioperative Verfahren zur Kraniotomie bei der Maus beschrieben. Verwenden Sie Sta....
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Ergebnisse
Anterograde Rückverfolgung
Die AAV-Expression wurde durch Immunfluoreszenz-Bildgebung des Reporterproteins (eYFP) im VTA von C57BL/6-Mäusen 21 Tage nach der Injektion verifiziert(Abbildung 2). Die erfolgreiche anterograde Markierung von präsynaptischen VTA-Glutamatprojektionen im Hippocampus wurde auch durch eYFP-Nachweis in den Schichten von DG, CA3 und CA1 nachgewiesen(Abbildung 6a–d; Film 2 und 3)........
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Diskussion
In den letzten zehn Jahren hat sich das Design von AAV-Konstrukten erheblich weiterentwickelt. Daher wurden mehr neuronenspezifische Promotoren in eine Reihe von AAV-Serotypen integriert, um die Transfektionsspezifität zu verbessern14. Durch die Kombination von Genen für Fluoreszenzproteine, Transporter, Rezeptoren und Ionenkanäle existieren nun Bibliotheken von AAV für bildgebung, neuromodulation und synaptische Aktivitätserkennung. In kommerziell erhältlichen AAV-Konstrukten ermöglicht eine Komb.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wird durch den CBS Bridging Grant finanziert, der ooM verliehen wird. OOM, PAA und AS entwarfen die Studie und führten die Experimente durch. AS und PAA analysierten die Ergebnisse. OOM und PAA bereiteten das Manuskript vor. Wir danken Dr. Karl Disseroth (Stanford University) für die Bereitstellung des AAV für unsere Nutzung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3% Wasserstoffperoxid | Fisher chemikalie | H312 | |
| AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC Kabel | Amazon | ||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Keramik Split Gegenhülse für Ø 1,25 mm Aderendhülsen. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Bohrer | Dremel | LR 39098 | |
| Mit Gelatine beschichtete Objektträger | Fisher | wissenschaftliche OBSLD01CS | |
| Hamilton's Spritze (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Kopftischadapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| Hochohmige Silikonsonde | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
| Jodlösung | Dynarex | 1425 | |
| Isofluran | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Ketamine | Spectrum | K1068 | |
| LED-Treiber | Thorlabs | LEDD1B | |
| LED-Lichtquelle (470 nm)-blaues Licht | Thorlabs | M470F3 | |
| Mikromanipulator | Narishige | M0-203 | |
| Glasfaser | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Schwenkkopf Kreuzschlitzschraube (M0,6 x 2 mm) | Amazon | M0,6 x 2 mm | |
| Vorverstärker Kopfstufe (32 Kanäle) | INTAN | C3314 | |
| Stereotaktischer Rahmen | Kopf | 1530 | |
| TTL Impulsgeber | Prizmatix | 4031 | |
| Urethan | Sigma | U2500 | |
| Xylazin | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | Version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | Version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | Version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | Version 4.5 | |
| ACSF Zusammensetzung: | |||
| sauerstoffhaltiges ACSF mit 95% Sauerstoff/5%CO2 ständig durch das ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 und 25 Glukose). |
Referenzen
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neura....
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Nachdrucke und Genehmigungen
