Method Article

Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen

DOI:

10.3791/61299

⸱

July 2nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird ein chemisch definiertes Protokoll zur Ableitung menschlicher Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen mit hoher Effizienz (>90%) und unabhängig von genetischen Manipulationen oder Subpopulationsselektion vorgestellt. Dieses Protokoll erzeugt den gewünschten Zelltyp innerhalb von 26 Tagen und könnte für Nephrotoxizitätstests und Krankheitsmodellierung nützlich sein.

Abstract

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Nierenerkrankungen betreffen mehr als 10% der Weltbevölkerung und kosten Milliarden von Dollar an Bundesausgaben. Die schwersten Formen der Nierenerkrankung und das eventuelle Nierenversagen im Endstadium werden oft durch die Schädigung der glomerulären Podozyten verursacht, bei denen es sich um die hochspezialisierten Epithelzellen handelt, die zusammen mit Endothelzellen und der glomerulären Basalmembran die Filtrationsbarriere der Niere bilden. Fortschritte in der Nierenmedizin wurden durch die begrenzte Verfügbarkeit von Primärgewebe und das Fehlen robuster Methoden zur Ableitung funktioneller menschlicher Nierenzellen wie Podozyten behindert. Die Fähigkeit, Podozyten aus erneuerbaren Quellen wie Stammzellen abzuleiten, könnte dazu beitragen, das aktuelle Verständnis der Mechanismen der menschlichen Nierenentwicklung und -krankheit zu verbessern und neue Werkzeuge für die therapeutische Entdeckung bereitzustellen. Ziel dieses Protokolls war es, eine Methode zu entwickeln, um reife, postmiotische Podozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) mit hoher Effizienz und Spezifität und unter chemisch definierten Bedingungen abzuleiten. Die mit dieser Methode produzierten hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten exprimieren linienspezifische Marker (einschließlich Nephrin, Podocin und Wilm-Tumor 1) und weisen die spezialisierten morphologischen Merkmale (einschließlich primärer und sekundärer Fußprozesse) auf, die mit reifen und funktionellen Podozyten verbunden sind. Interessanterweise fehlen diese spezialisierten Merkmale in der immortalisierten Podozytenzelllinie, die in diesem Bereich weit verbreitet ist, was darauf hindeutet, dass das hier beschriebene Protokoll menschliche Nierenpodozyten produziert, die einen entwicklungsreiferen Phänotyp aufweisen als die bestehenden Podozytenzelllinien, die typischerweise zur Untersuchung der menschlichen Nierenbiologie verwendet werden.

Introduction

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Fortschritte in der humanen pluripotenten Stammzellkultur sind bereit, die regenerative Medizin, die Krankheitsmodellierung und das Drogenscreening zu revolutionieren, indem sie Forschern eine erneuerbare, skalierbare Quelle für biologisches Material zur Verfügung stellen, die entwickelt werden kann, um fast jeden Zelltyp im menschlichen Körper zu erhalten1. Diese Strategie ist besonders nützlich, um spezialisierte und funktionelle Zelltypen abzuleiten, die sonst schwer zu erhalten wären. Human induced pluripotent stem (hiPS) Zellen2,3,4,

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Protocol

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1. Herstellung von Reagenzien

  1. Verdünnen Sie aufgetaute 5x hiPS Zellkulturmedien (CCM) Ergänzung in hiPS Zellkultur Basalmedium, um eine 1x Lösung von hiPS CCM zu erhalten.
    HINWEIS: Gefrorene 5x hiPS CCM Ergänzung erfordert einen langsamen Auftauprozess, idealerweise bei 4 ° C für über Nacht. Aliquots des 1x hiPS CCM können bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.
  2. Herstellung von Basalmembran (BM) Matrix 1-beschichteten Platten für hiPS Zellkultur: BM Matrix 1 über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Nach dem Auftauen Aliquoten mit geeigneten Verdünnungsfaktoren vorbereiten, wie vom Hersteller vorgeschlagen.
    HINWEIS: Typischerweise werden Aliq....

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Results

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Ziel dieses Protokolls war es zu zeigen, dass reife menschliche Podozyten unter chemisch definierten Bedingungen aus hiPS-Zellen gewonnen werden können. Die in diesem Manuskript vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der DU11 hiPS-Zelllinie17generiert, die zuerst getestet wurde und sich als frei von Mykoplasmen erwiesen hat. Es wurde auch eine Chromosomenanalyse durchgeführt, und die Zellen erwiesen sich als karyotypisch normal. Ausgehend von den undifferenzierten DU11 hiPS-Zellen wurde die i.......

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Discussion

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In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von glomerulären Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen. Die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten weisen morphologische und molekulare Merkmale auf, die mit dem reifen Nierenpodozytenphänotyp13assoziiert sind. In früheren Veröffentlichungen haben wir gezeigt, dass die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten die Struktur und selektive Filtrationsfunktion des Nierenglomerulus nachahmen können, wenn sie mit glomerulären mikrovaskulären Endothelz.......

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Disclosures

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S.M. ist Autor eines zum Patent angemeldeten Patents für Verfahren zur Erzeugung von Nierenpodozyten aus pluripotenten Stammzellen (US-Patentanmeldung 14/950859). Die übrigen Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde von der Pratt School of Engineering an der Duke University, der Division of Nephrology an der Duke Medical School, dem A Chair's Research Award des Department of Medicine der Duke University und einem Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award an S.M unterstützt. M.B wurde durch das Graduate Research Fellowship Program der National Science Foundation unterstützt. Wir danken dem Bursac Lab für die großzügige Bereitstellung der DU11-Stammzelllinie und dem Varghese Lab an der Duke University für die vorübergehende Freigabe ihrer Gewebekultureinrichtung mit unserer Gruppe. Diese Publikation ist Prof. Laura L. Kiessling, Novarti....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
Die iPS-Zelllinie DU11 (Duke University Clone #11) wurde in der iPSC Core Facility der Duke University erzeugt und uns vom Bursac Lab an der Duke University zur Verfügung gestellt. Diese Linie wurde auf Mykoplasmen getestet und zuletzt im Juli 2019 von unserem Labor karyotypisiert und für karyotypisch normal befunden.
Wachstumsfaktoren und Medienergänzungen
All-trans-Retinsäure (500 mg)72262Stem Cell Technologies
B27 serumfreies Nahrungsergänzungsmittel17504044Thermo/Life Technologies
CHIR9902104-0004StemgentKann Schwankungen von Charge zu Charge aufweisen
Komplettes Medium Kit mit CultureBoost-R4Z0-500-RCell SystemsPodozyten-Pflegemedium
DMEM/F1212634028Thermo/Life Technologies
DMEM/F12 mit GlutaMAX-Supplement10565042Thermo/Life TechnologiesDMEM/F12 mit Glutamin-Supplement
Hitzeinaktiviertes FBS10082147Thermo/Life Technologies
Human Activin APHC9564Thermo/Life Technologien
Human BMP7PHC9544Thermo/Life Technologies
Human VEGFPHC9394Thermo/Life Technologies
mTeSR1 Medium05850Stem Cell TechnologieshiPS Zellkulturmedien (CCM)
Penicillin– Streptomycin, flüssig (100&mal;)15140-163Thermo/Life Technologies
Y27632 ROCK-Inhibitor1254Tocris
Antikörper
Alexa Fluor 488– und Alexa Fluor 594– konjugierte SekundärantikörperA32744; Nr. A32754; Nr. A-11076; A32790Thermo/Life Technologies
Brachyury(T)ab20680Abcam
NephrinGP-N2Progen
OCT4AF1759R& D Systems
PAX271-6000Invitrogen
WT1MAB4234Millipore
ECM Molecules
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) FragmentN-892012Iwai NordamerikaBasalmembran (BM) Matrix 2
Matrigel hESC-qualifizierte Matrix, 5-ml-Fläschchen354277BD BiowissenschaftenBasalmembran (BM) Matrix 1. Kann Schwankungen von Charge zu Charge aufweisen
Enzyme und andere Reagenzien
AccutaseA1110501Thermo/Life TechnologiesLösung zur Zellablösung
BSAA9418Sigma-Aldrich
Dimethylsulfoxid (DMSO)D2438Sigma-AldrichDMSO ist giftig. Sollte in einer chemischen Sicherheitshaube gehandhabt werden
Enzymfreier Zelldissoziationspuffer, Hank' s ausgewogenes Salz13150016Thermo/Life Technologies
Ethanollösung, 70 % (vol/vol), biotechnologische Qualität97065-058VWREthanol ist brennbar und giftig
FBS431097Corning
Paraformaldehyd (PFA)28906Thermo/Life TechnologiesPFA sollte in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille gehandhabt werden. Vermeiden Sie das Einatmen und den Kontakt mit der Haut.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)14190-250Thermo/Life Technologies
Steriles destilliertes Wasser15230162Thermo/Life Technologies
Triton X-10097062-208VWR
Trypsin-EDTA, 0,05%25300-120Thermo/Life Technologies
Equipment
Aspirationspipetten, einzeln verpackt29442-462Corning
Avanti J-15R ZentrifugeB99516Beckman Coulter
Konisches Zentrifugenröhrchen, 15 mL352097Konisches
, 50 mL352098Corning
Kryoboxen3395465Thermo/Life TechnologiesZur Lagerung von gefrorenen aliquots
EVOS M7000AMF7000Thermo/Life TechnologiesLeuchtstoffmikroskop zur Aufnahme von Bildern von fixierten und gefärbten iPS-Zellen und deren Derivaten
Hämozytometer100503-092VWR
Heracell VIOS 160i CO2-Inkubator51030403Thermo/Life TechnologiesFür die routinemäßige Kultivierung und Pflege von iPS-Zellen und ihren Derivaten
Invertierter Zeiss Axio Observer ausgestattet mit AxioCam 503 Kamera491916-0001-000 (Mikroskop) ; 426558-0000-000 (Kamera)Carl Zeiss MikroskopieZur Aufnahme von Phasenkontrastbildern von lebenden iPS-Zellen und ihren Derivaten in jeder Phase der Podozytendifferenzierung
Kimberly-Clark Nitrilhandschuhe40101-346VWR
Kimwipes, groß21905-049VWR
Kimwipes, klein21905-026VWR
P10 Präzisions-Barriere-PipettenspitzenP1096-FRDenville Scientific
P100 Barriere-PipettenspitzenP1125Denville Scientific
P1000 Barriere-PipettenspitzenP1126Denville Scientific
P20 Barriere-PipettenspitzenP1121Denville Scientific
P200 Barriere-PipettenspitzenP1122Denville Scientific
Serologische Pipette, 10 mL, einzeln verpackt356551Corning
Serologische Pipette, 25 mL, einzeln verpackt356525Corning
Serologische Pipette, 5 mL, einzeln verpackt356543Corning
Steriflip, 0,22 μ m, PESSCGP00525EMD Millipore
Sterile Mikrozentrifugenröhrchen1138W14Thomas ScientificZur Aliquotierung von Wachstumsfaktoren
Gewebekultur– behandelte 12-Well-Platten353043Corning
Tissue Kultur– behandelte Sechs-Well-Platten353046Corning
VWR weißer Techuni-Laborkittel10141-342VWR
Breit abgeschrägter Zellheber3008Corning
DU11 humane iPS-Zellen Zentrifugenröhrchen von Corning

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
  2. Tabar, V., Studer, L.

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Human iPS CellsPodocyte DifferentiationChemically Defined ConditionsMesoderm InductionIntermediate MesodermBasement Membrane MatrixNephrin ExpressionPodocin ExpressionWT1 MarkerFoot Processes

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