Hier wird ein chemisch definiertes Protokoll zur Ableitung menschlicher Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen mit hoher Effizienz (>90%) und unabhängig von genetischen Manipulationen oder Subpopulationsselektion vorgestellt. Dieses Protokoll erzeugt den gewünschten Zelltyp innerhalb von 26 Tagen und könnte für Nephrotoxizitätstests und Krankheitsmodellierung nützlich sein.
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Methodenartikel
Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nierenerkrankungen betreffen mehr als 10% der Weltbevölkerung und kosten Milliarden von Dollar an Bundesausgaben. Die schwersten Formen der Nierenerkrankung und das eventuelle Nierenversagen im Endstadium werden oft durch die Schädigung der glomerulären Podozyten verursacht, bei denen es sich um die hochspezialisierten Epithelzellen handelt, die zusammen mit Endothelzellen und der glomerulären Basalmembran die Filtrationsbarriere der Niere bilden. Fortschritte in der Nierenmedizin wurden durch die begrenzte Verfügbarkeit von Primärgewebe und das Fehlen robuster Methoden zur Ableitung funktioneller menschlicher Nierenzellen wie Podozyten behindert. Die Fähigkeit, Podozyten aus erneuerbaren Quellen wie Stammzellen abzuleiten, könnte dazu beitragen, das aktuelle Verständnis der Mechanismen der menschlichen Nierenentwicklung und -krankheit zu verbessern und neue Werkzeuge für die therapeutische Entdeckung bereitzustellen. Ziel dieses Protokolls war es, eine Methode zu entwickeln, um reife, postmiotische Podozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) mit hoher Effizienz und Spezifität und unter chemisch definierten Bedingungen abzuleiten. Die mit dieser Methode produzierten hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten exprimieren linienspezifische Marker (einschließlich Nephrin, Podocin und Wilm-Tumor 1) und weisen die spezialisierten morphologischen Merkmale (einschließlich primärer und sekundärer Fußprozesse) auf, die mit reifen und funktionellen Podozyten verbunden sind. Interessanterweise fehlen diese spezialisierten Merkmale in der immortalisierten Podozytenzelllinie, die in diesem Bereich weit verbreitet ist, was darauf hindeutet, dass das hier beschriebene Protokoll menschliche Nierenpodozyten produziert, die einen entwicklungsreiferen Phänotyp aufweisen als die bestehenden Podozytenzelllinien, die typischerweise zur Untersuchung der menschlichen Nierenbiologie verwendet werden.
Einleitung
Fortschritte in der humanen pluripotenten Stammzellkultur sind bereit, die regenerative Medizin, die Krankheitsmodellierung und das Drogenscreening zu revolutionieren, indem sie Forschern eine erneuerbare, skalierbare Quelle für biologisches Material zur Verfügung stellen, die entwickelt werden kann, um fast jeden Zelltyp im menschlichen Körper zu erhalten1. Diese Strategie ist besonders nützlich, um spezialisierte und funktionelle Zelltypen abzuleiten, die sonst schwer zu erhalten wären. Human induced pluripotent stem (hiPS) Zellen2,3,4,
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Protokoll
1. Herstellung von Reagenzien
- Verdünnen Sie aufgetaute 5x hiPS Zellkulturmedien (CCM) Ergänzung in hiPS Zellkultur Basalmedium, um eine 1x Lösung von hiPS CCM zu erhalten.
HINWEIS: Gefrorene 5x hiPS CCM Ergänzung erfordert einen langsamen Auftauprozess, idealerweise bei 4 ° C für über Nacht. Aliquots des 1x hiPS CCM können bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden. - Herstellung von Basalmembran (BM) Matrix 1-beschichteten Platten für hiPS Zellkultur: BM Matrix 1 über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Nach dem Auftauen Aliquoten mit geeigneten Verdünnungsfaktoren vorbereiten, wie vom Hersteller vorgeschlagen.
HINWEIS: Typischerweise werden Aliq....
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Ergebnisse
Ziel dieses Protokolls war es zu zeigen, dass reife menschliche Podozyten unter chemisch definierten Bedingungen aus hiPS-Zellen gewonnen werden können. Die in diesem Manuskript vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der DU11 hiPS-Zelllinie17generiert, die zuerst getestet wurde und sich als frei von Mykoplasmen erwiesen hat. Es wurde auch eine Chromosomenanalyse durchgeführt, und die Zellen erwiesen sich als karyotypisch normal. Ausgehend von den undifferenzierten DU11 hiPS-Zellen wurde die i.......
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Diskussion
In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von glomerulären Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen. Die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten weisen morphologische und molekulare Merkmale auf, die mit dem reifen Nierenpodozytenphänotyp13assoziiert sind. In früheren Veröffentlichungen haben wir gezeigt, dass die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten die Struktur und selektive Filtrationsfunktion des Nierenglomerulus nachahmen können, wenn sie mit glomerulären mikrovaskulären Endothelz.......
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Offenlegungen
S.M. ist Autor eines zum Patent angemeldeten Patents für Verfahren zur Erzeugung von Nierenpodozyten aus pluripotenten Stammzellen (US-Patentanmeldung 14/950859). Die übrigen Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Pratt School of Engineering an der Duke University, der Division of Nephrology an der Duke Medical School, dem A Chair's Research Award des Department of Medicine der Duke University und einem Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award an S.M unterstützt. M.B wurde durch das Graduate Research Fellowship Program der National Science Foundation unterstützt. Wir danken dem Bursac Lab für die großzügige Bereitstellung der DU11-Stammzelllinie und dem Varghese Lab an der Duke University für die vorübergehende Freigabe ihrer Gewebekultureinrichtung mit unserer Gruppe. Diese Publikation ist Prof. Laura L. Kiessling, Novarti....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Cells | |||
| Die iPS-Zelllinie DU11 (Duke University Clone #11) wurde in der iPSC Core Facility der Duke University erzeugt und uns vom Bursac Lab an der Duke University zur Verfügung gestellt. Diese Linie wurde auf Mykoplasmen getestet und zuletzt im Juli 2019 von unserem Labor karyotypisiert und für karyotypisch normal befunden. | |||
| Wachstumsfaktoren und Medienergänzungen | |||
| All-trans-Retinsäure (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serumfreies Nahrungsergänzungsmittel | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | Kann Schwankungen von Charge zu Charge aufweisen |
| Komplettes Medium Kit mit CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podozyten-Pflegemedium |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 mit GlutaMAX-Supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 mit Glutamin-Supplement |
| Hitzeinaktiviertes FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human Activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologien | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 Medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS Zellkulturmedien (CCM) |
| Penicillin– Streptomycin, flüssig (100&mal;) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK-Inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antikörper | |||
| Alexa Fluor 488– und Alexa Fluor 594– konjugierte Sekundärantikörper | A32744; Nr. A32754; Nr. A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R& D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) Fragment | N-892012 | Iwai Nordamerika | Basalmembran (BM) Matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualifizierte Matrix, 5-ml-Fläschchen | 354277 | BD Biowissenschaften | Basalmembran (BM) Matrix 1. Kann Schwankungen von Charge zu Charge aufweisen |
| Enzyme und andere Reagenzien | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Lösung zur Zellablösung |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO ist giftig. Sollte in einer chemischen Sicherheitshaube gehandhabt werden |
| Enzymfreier Zelldissoziationspuffer, Hank' s ausgewogenes Salz | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanollösung, 70 % (vol/vol), biotechnologische Qualität | 97065-058 | VWR | Ethanol ist brennbar und giftig |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyd (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA sollte in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhen, Laborkittel und Schutzbrille gehandhabt werden. Vermeiden Sie das Einatmen und den Kontakt mit der Haut. |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Steriles destilliertes Wasser | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0,05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirationspipetten, einzeln verpackt | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Zentrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Konisches Zentrifugenröhrchen, 15 mL | 352097 | Konisches | |
| , 50 mL | 352098 | Corning | |
| Kryoboxen | 3395465 | Thermo/Life Technologies | Zur Lagerung von gefrorenen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Leuchtstoffmikroskop zur Aufnahme von Bildern von fixierten und gefärbten iPS-Zellen und deren Derivaten |
| Hämozytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2-Inkubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | Für die routinemäßige Kultivierung und Pflege von iPS-Zellen und ihren Derivaten |
| Invertierter Zeiss Axio Observer ausgestattet mit AxioCam 503 Kamera | 491916-0001-000 (Mikroskop) ; 426558-0000-000 (Kamera) | Carl Zeiss Mikroskopie | Zur Aufnahme von Phasenkontrastbildern von lebenden iPS-Zellen und ihren Derivaten in jeder Phase der Podozytendifferenzierung |
| Kimberly-Clark Nitrilhandschuhe | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, groß | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, klein | 21905-026 | VWR | |
| P10 Präzisions-Barriere-Pipettenspitzen | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 Barriere-Pipettenspitzen | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 Barriere-Pipettenspitzen | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 Barriere-Pipettenspitzen | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 Barriere-Pipettenspitzen | P1122 | Denville Scientific | |
| Serologische Pipette, 10 mL, einzeln verpackt | 356551 | Corning | |
| Serologische Pipette, 25 mL, einzeln verpackt | 356525 | Corning | |
| Serologische Pipette, 5 mL, einzeln verpackt | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0,22 μ m, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Mikrozentrifugenröhrchen | 1138W14 | Thomas Scientific | Zur Aliquotierung von Wachstumsfaktoren |
| Gewebekultur– behandelte 12-Well-Platten | 353043 | Corning | |
| Tissue Kultur– behandelte Sechs-Well-Platten | 353046 | Corning | |
| VWR weißer Techuni-Laborkittel | 10141-342 | VWR | |
| Breit abgeschrägter Zellheber | 3008 | Corning |
Referenzen
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
