Etablierung und Pflege von Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobitische Tiere haben sich als unschätzbare Werkzeuge für Mikrobiomstudien^{erwiesen 1,2,3}. Keimfreie und definierte Flora-Tiere haben die Aufklärung von Wirt-Mikroben-Interaktionen ermöglicht, einschließlich immunologischer Reaktionen des Wirts, der Epithelreifung des Darms und des Wirtsstoffwechsels^1,4,5,6,7. Gnotobitische Tiere, die mit einer vereinfachten Gemeinschaft geimpft wurden, haben auch zu einem vollständigeren Verständnis der Mikroben-Mikroben-Interaktionen in einer Darmgemeinschaft beigetragen, insbesondere bei der Entschlüsselung von Kreuzfütterung und antagonistischen Beziehungen^8,9,10,11. Das derzeit bevorzugte Modellsystem für Untersuchungen im Darmmikrobiom von Säugetieren ist das murine Modell. Während dieses System bei den oben beschriebenen Entdeckungen von entscheidender Bedeutung war, sind die damit verbundenen Kosten ein wesentliches Manko. Spezialisierte Ausrüstung und hochqualifizierte Techniker sind notwendig, um eine gnotobitische Einrichtung einzurichten und zu warten. Dies, in Kombination mit zusätzlicher Sorgfalt, die jedem Aspekt der gnotobitischen Tierpflege gewidmet werden muss, führt dazu, dass ein gnotobiotisches Tier zehn- bis zwanzigmal mehr kostet als ein Standardtiermodell¹². Aufgrund hoher Kosten können sich viele Forscher möglicherweise kein gnotobiotisches Mausmodell leisten. Während murine Modelle die am weitesten verbreitete Wahl für Studien sind, die auf die menschliche Gesundheit übertragen werden sollen, gibt es immer noch viele physiologische und morphologische Unterschiede zwischen menschlichen und Mausdärmen¹³. Offensichtlich reicht kein singuläres Modell aus, um die ständig wachsende Anzahl von Fragen zu den vielen Aspekten des Darmmikrobioms zu beantworten.

Insektenmodelle sind aufgrund ihrer geringeren Wartungskosten im Vergleich zu Säugetierarten eine günstigere Alternative. Umfangreiche keimfreie und gnotobiotische Forschung an einer Vielzahl von Insektenarten hat zur Entwicklung mehrerer häufig verwendeter Modelle geführt. Mücken und Drosophila sind aufgrund ihrer Relevanz für globale Krankheiten und genetische Traktierbarkeit gängige Modelle für keimfreies Arbeiten^14,15. Ein weiteres aufkommendes Modellsystem ist das der Honigbiene (Apis mellifera), da es für die Bestäubungs- und Sozialitätsforschung^{von Bedeutung ist 16}. Vielen dieser häufig verwendeten Insekten fehlt jedoch die taxonomische Komplexität, die in Säugetier-Darmgemeinschaften¹⁷beobachtet wird, was ihre Fähigkeit einschränkt, Interaktionen höherer Ordnung zu modellieren. Nicht nur, dass die gesamte Vielfalt der Mikroben, die im Darm von amerikanischen Kakerlaken gefunden werden, Säugetieren ähnlicher ist, sondern viele der im Kakerlakendarm vorhandenen Mikroben gehören zu Familien und Phyla, die häufig in der Darmmikrobiota von Säugetieren und Menschen gefunden werden¹⁸. Das Hinterdarm der Kakerlake ist auch funktionell analog zum Dickdarm von Säugetieren, da es sich um eine Fermentationskammer handelt, die dicht mit Bakterien gefüllt ist, um die Extraktion von Nährstoffen zu unterstützen^19,20. Schließlich ermöglicht die Allesfresser-Natur von Kakerlaken eine Vielfalt von Diätregimen, die mit Diätspezialisten nicht möglich wären.

Amerikanische Kakerlaken können ein nützliches Modellsystem zum Verständnis der mikrobiellen Darmgemeinschaften in höheren Organismen sein, aber der Status der Kakerlake als Schädling macht dieses System auch für die Schädlingsbekämpfung relevant²¹. Die Nutzung grundlegender Kenntnisse über den Einfluss der Darmgemeinschaft auf die Gesundheit und Physiologie von Kakerlaken hilft bei der Entwicklung neuer Techniken zur Schädlingsbekämpfung.

Das Ziel dieser Methode ist es, eine umfassende Beschreibung der Etablierung und Aufrechterhaltung von gnotobitischen amerikanischen Kakerlaken (Periplaneta americana) zu skizzieren, aber dieses Protokoll könnte verwendet werden, um Nymphen jeder oviparen Kakerlake zu erzeugen. Es umfasst eine Methode zur effizienten, nichtinvasiven Sammlung reifer Oothekanen und eine zerstörungsfreie Technik zur Überwachung des gnotobitischen Status der Insekten^22,23,24. Während frühere Methoden zur Erreichung und Aufrechterhaltung von gnotobiotischen Kakerlaken die Oothekasammlung^{23,24,25,26,27}beschreiben, wird die Oothekareife entweder in Form von artspezifischen Hinweisen interpretiert (in Blattella germanica^22,24,25) oder nicht explizit beschrieben^27,28, was die Implementierung für diejenigen, die mit dem System nicht vertraut sind, erschwert. Da die hier beschriebene Methode natürlich fallengelassene Oothekanen verwendet, fehlt der Fehler, Eier vorzeitig zu entfernen. Dieses Protokoll enthält sowohl kulturabhängige als auch kulturunabhängige Methoden der Qualitätskontrolle, und die kulturabhängige Methode erfordert keine Opfer von Insekten. Schließlich führt diese Methode Informationen aus mehreren gnotobiotischen Kakerlakenstudien zusammen, um ein umfassendes Protokoll mit allen notwendigen Informationen zur Erreichung und Aufrechterhaltung von gnotobitischen Kakerlaken zu erstellen.

1. Materialaufbereitung

1. Pflege von Kakerlakenkulturen
   HINWEIS: Es gibt viele Möglichkeiten, diese robusten Insekten aufzuziehen. Die Besonderheiten bei der Bereitstellung von Schutz und Wasser können je nach zugänglichen Materialien (z. B. Eierkartons anstelle von Papptuben) unterschiedlich sein. Das folgende Sterilisationsprotokoll funktioniert für jede Lagertankeinrichtung.
   1. Verteilen Sie genug Hackschnitzelbettwäsche in einem 37,85 L (10 Gallonen) Aquarium, um den Boden des Tanks mit etwa 1 Zoll Bettwäsche zu bedecken. Bereiten Sie das Gehäuse vor, indem Sie (flachen) Karton auf 2 x 4 in Stücken schneiden. Legen Sie Kartonstücke in Kartonrohre (z. B. Toilettenpapiertuben) und Stapelrohre an einem Ende des Tanks ein (Abbildung 1).
   2. Schmieren Sie eine dünne Schicht Vaseline auf die oberen zwei Zoll des Inneren des Tanks, um das Entweichen von Insekten zu verhindern.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Innenseite der Ecken des Tanks richtig zu beschichten.
   3. Fügen Sie Kakerlaken hinzu, indem Sie (besetzte) Pappröhren aus einem früheren Lagertank übertragen und sie schütteln, um ihre Bewohner freizulassen. Bewegen Sie für jeden Transfer 100-200 gemischtgemischte, gemischtgeschlechtliche Kakerlaken. Fügen Sie Hundefutter (20-30 Stück) hinzu, überwachen Sie die Menge an Hundefutter im Tank und füllen Sie nach, wenn sie niedrig ist.
   4. Stellen Sie eine Wasserschale auf.
      1. Füllen Sie einen kleinen Wiederverwendbarenbehälter aus Kunststoff mit doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O). Zelluloseschwämme und Löcher im Deckel des Lebensmittelbehälters auf ungefähr die gleiche Größe schneiden.
         HINWEIS: Die Zelluloseschwämme verhindern, dass Kakerlaken in der Wasserschale ertrinken.
   5. Schwämme in Löcher im Deckel einführen und den Deckel auf den gefüllten Behälter legen. Stellen Sie den Behälter in den Tank und füllen Sie ihn nach, wenn er niedrig ist. Decken Sie den Tank mit Baumwolltuch ab und befesten Sie ihn mit einem elastischen Band.
   6. Wenn Tanks beginnen, übermäßige Mengen an Frass und Insektenkadavern anzusammeln, richten Sie neue Tanks ein und übertragen Sie Kakerlaken.
      HINWEIS: Tanks werden in der Regel alle 6 Monate übertragen. Alle verbleibenden Kakerlaken / Eier in stillgelegten Lagertanks werden durch Einfrieren bei -20 ° C für 1 h eingeschläfert und der Inhalt des Lagertanks wird dann vor der Entsorgung in einen Autoklavenbeutel überführt und autoklaviert (1 h, Schwerkraftzyklus). Lagertanks werden zwischen den Anwendungen mit 2% Bleichmittel sterilisiert.
2. Desinfizieren Sie einen sekundären Behälter.
   HINWEIS: Dieser Behälter enthält keinen Filter, sondern ermöglicht einen freien Luftaustausch.
   1. Besprühen Sie die Innenseite des Deckels und des Bodens mit 2% Bleichmittel und lassen Sie sie 10 Minuten einweichen. Wischen Sie das Bleichmittel mit einem sauberen Papiertuch ab.
   2. Besprühen Sie die Innenseite des Deckels und des Bodens mit 70% Ethanol und wischen Sie es mit einem sauberen Papiertuch trocken. Ersetzen Sie den Deckel bis zur Verwendung.
3. Stellen Sie BHI-Slants und -Kolben zum Inkubieren von Eiern und zum Beherbergen von Nymphen herstellen.
   1. Bereiten Sie BHI gemäß den Anweisungen der Verpackung vor und fügen Sie 2% Agar hinzu. Kochen Sie die BHI-Agarlösung bis zur Klärung.
   2. Für Slants 5 mL Aliquoten auf 18 mm x 150 mm Glas reagenzgläser und Kappe übertragen. Sterilisieren über Autoklaven (Sterilisationszeit = 20 min, Flüssigkeitszyklus). Legen Sie autoklavierte Rohre in einem Winkel von 45 °, um sie zu Schrägen abzukühlen. Nach dem Erstarren bis zum Gebrauch kühlen, um ein Austrocknen zu verhindern.
   3. Für Kolben 10 ml Aliquoten gekochter BHI-Agarlösung in 250 ml Erlenmeyerkolben geben, um den Boden des Kolbens vollständig abzudecken. Den Kolben mit Folie abdecken und per Autoklaven sterilisieren (20 min, Flüssigkeitszyklus). Autoklavkolben abkühlen lassen und kühlen, bis sie verwendet werden, um ein Austrocknen zu verhindern.
      HINWEIS: Für dieses Setup ist kein Luftfilter erforderlich. Die Folienabdeckung ist ausreichend, um den Gasaustausch zu ermöglichen und gleichzeitig eine Kontamination durch den Freiluftstrom zu verhindern.
4. Sterilisieren über Autoklaven: autoklavierbare Rattensuppe in halben Größen (~1/2 Zoll Stück) in einem folienbedeckten Becherglas (Sterilisationszeit = 1 h, Schwerkraftzyklus), ddH₂O in einer verschlossenen Flasche (Sterilisationszeit = 20 min, Flüssigkeitszyklus) und Eine zette in einem mit Folie überzogenen Becherglas (Sterilisationszeit = 20 min, Schwerkraftzyklus).
   HINWEIS: Überfüllen Sie das Rattenbecherbecherglas nicht. Pellets schwellen im Autoklaven an.
5. Richten Sie einen Tank für die "Entbindungsstation" ein.
   HINWEIS: Dieser Tank enthält die gleichen Materialien wie die Lagertanks (Kartonschläuche, Wasserschalen mit Schwämmen, Hundefutter, Hackschnitzelbettwäsche; siehe Abbildung 1) und sollte leer von Kakerlaken sein, es sei denn, er wird zur Oothekensammlung übertragen (siehe Abschnitt 2).
6. Befeuchten Sie einen Inkubator, indem Sie ein Becherglas voller übersättigter Natriumchlorid (NaCl) -Lösung vorbereiten. Bereiten Sie diese Lösung vor, indem Sie 37 g NaCl pro 100 ml_ddH2O hinzufügen und rühren, bis sie gelöst sind.
   HINWEIS: Typischerweise befeuchten 500 ml gesättigte Salzlösung typischerweise einen Inkubator mit den Kammerabmessungen 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x B x T) für etwa einen Monat, bevor mehr Wasser hinzugefügt werden muss.

2. Sammlung von Oothecae

1. Übertragen Sie Weibchen (in beliebiger Anzahl, je nach geplanten Experimenten), die Oothekane(Abbildung 2)tragen, vom Lagertank zur "Entbindungsstation", indem Sie mit einer Zette Kartonröhren bewegen, die gravide Weibchen enthalten.
   1. Wenn ein Kartonrohr neben dem graviden Weibchen mehrere Insekten enthält, schütteln Sie das Rohr zuerst in einen zusätzlichen Kunststoffbehälter, der mit Vaseline beringt ist, und ermutigen Sie dann das Zielinsekt, allein in das Papprohr zurückzuklettern.
2. Übertragen Sie die Weibchen zurück in den Lagertank, sobald sie ihre Oothecae fallen gelassen haben. Holen Sie die Oothecae mit einer Zette aus dem Wurf im Tank.
   HINWEIS: Oothecae werden oft innerhalb von 24 Stunden nach dem Transfer des Weibchens fallen gelassen.

3. Reinigung von Oothecae

1. Oothekane in ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 3 ml Natriumdodecylsulfat (SDS) geben. Wirbel für 10 s. Wiederholen Sie den zweiten Waschschritt mit einem Zentrifugenröhrchen, das frisches SDS enthält.
   HINWEIS: Pro 3 ml SDS können bis zu fünf Oothecae verwendet werden.
2. Mit einem zarten Aufgabentuch die Oberfläche jeder Oothek vorsichtig schrubben, um Ablagerungen zu entfernen. Weitere SDS können hinzugefügt werden, um die gründliche Reinigung zu unterstützen. Reinigene Oothecae in ein Wiegeboot geben, bis sie zur Sterilisation bereit sind.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, aber wenn sie die Ootheken für längere Zeit (Tage bis Wochen) in Umgebungen mit niedriger Luftfeuchtigkeit belassen, werden sie dehydrieren und ihre Lebensfähigkeit verlieren.

4. Sterilisation und Inkubation von Oothecae

1. Aliquot steriles Wasser für die Nachsterilisation spülen. Füllen Sie für jede zu sterilisierende Oothek zwei 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem Wasser.
2. Fügen Sie 10 μL konzentriertes (32%) Peressigsäure-Stammlösung zu 3,2 mlddH2 O in einem 5-ml-Zentrifugenröhrchen, um eine 0,1% ige Lösung für die Sterilisation zu erzeugen. Kappen und mehrmals umkehren, um zu mischen.
   VORSICHT: Peressigsäure ist schädlich bei Kontakt mit Haut oder Lunge. In einem Abzug verdünnen.
   HINWEIS: Dies muss am selben Tag wie die Sterilisation erfolgen. Wenn die Lösung im Voraus verdünnt wird, zersetzt sie sich schnell und sterilisiert daher nicht richtig. Bis zu fünf gereinigte Oothekane können in 3,2 ml verdünnter Säure sterilisiert werden.
3. (bis zu fünf) gereinigte Oothecae für 5 min in die 0,1% ige Peressigsäurelösung geben. Kehren Sie das Rohr mehrmals alle 60 s um.
4. Verwenden Sie in einer Laminar-Flow-Haube eine sterile Zinnen, um jede Oothek mit aliquoteiertem sterilem Spülwasser in ein eigenes Zentrifugenröhrchen zu überführen (Schritt 4.1). Mehrmals umkehren, um zu mischen. Wiederholen Sie dies für eine zweite Spülung und übertragen Sie dann jede gespülte Oothek mit einer sterilen Handzette in ihre eigene BHI-Neigung.
5. Legen Sie Schrägen in den sterilisierten Sekundärbehälter. Den Behälter 4−5 Wochen lang bei 30 °C in den befeuchteten Inkubator bringen, bis er geschlüpft ist.
   HINWEIS: Slants können von einem kleinen Reagenzglasgestell oder einem mittleren/kleinen Becherglas aufrecht gehalten werden.
6. Überprüfen Sie die Slants regelmäßig (1-2x pro Woche). Wenn Pilz- oder Bakterienkoloniewachstum auf dem Agar auftritt, entfernen Sie die kontaminierte Neigung. Wenn sich der Vier-Wochen-Zeitpunkt nähert, überprüfen Sie jeden Tag die Neigungen.
   HINWEIS: Einmal geschlüpft, können Nymphen bis zu mehreren Wochen allein auf BHI überleben, wachsen aber nicht optimal.

5. Erhaltung von gnotobitischen Nymphen

1. In einer Laminar-Flow-Haube wird ein Pellet sterilisierter Rattensuppe aseptisch mit einer sterilen Zette in einen vorbereiteten BHI-Kolben (ab Schritt 1.3.3) überführen. Als Sterilitätsprüfung den Kolben 24 h lang in den Sekundärbehälter in einen 30 °C-Inkubator geben und nicht verwenden, wenn Wachstum auftritt.
2. Nymphen mit sterilem Futterpellet in den BHI-Kolben geben. Schütteln Sie sie aus ihrer BHI-Neigung und lassen Sie sie in einer laminaren Strömungshaube in den Kolben fallen.
   HINWEIS: Die Nymphen haben keine Traktion an den Glaswänden des Reagenzglases. Das Schütteln des Rohrs, um sie von der Schräge abzustoßen, und dann das Kippen des Rohrs, damit sie das Glas in den Kolben gleiten können, ist effektiv. Während Nymphen mit einer Zette übertragen werden können, ist das Risiko tödlicher Verletzungen hoch.
3. Wassernymphen mit 300 μL sterilem Wasser einmal pro Woche in einer Laminar-Flow-Haube durch Pipettieren direkt auf den BHI-Boden des Kolbens.
4. Wenn Nymphenkot beginnt, den BHI-Boden zu bedecken, in einen neuen BHI-Kolben übergehen und den sterilisierten Rattenchow 24 Stunden im Voraus hinzufügen (um die Sterilität zu überprüfen) wie in Schritt 5.1.

6. Qualitätskontrolle der Sterilität

1. Entfernen Sie eine Nymphe aus dem BHI-Kolben, um für eine kulturunabhängige Qualitätskontrolle des gnotobitischen Status mittels Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) zu opfern. Gießen Sie dazu die Nymphe in ein steriles Zentrifugenröhrchen (ähnlich dem Nymphentransfer ab Schritt 5.1) oder legen Sie einen sterilen Holzapplikator in den Kolben und warten Sie, bis eine Nymphe mit dem Klettern beginnt, und übertragen Sie ihn dann in das Zentrifugenröhrchen.
2. 0,5 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Nymphe im Zentrifugenröhrchen geben und mit einer sterilen Mikropest homogenisieren, bis alle großen Stücke zerbrochen sind. Vortex gut.
3. Extrahieren Sie DNA aus Nymphenhomogenat mit einembakteriellen DNA-Extraktionskit( Materialtabelle ) wie folgt.
   1. Zentrifuge die homogenisierte Nymphe für 10 min bei 5.000 x g und entferne den Überstand. Einen Thermoschüttler auf 37 °C vorheizen.
   2. Fügen Sie 100 μL 1x Tris-EDTA und Wirbel hinzu, um das Pellet vollständig wieder aufzubestellen. 10 μL Lysozym fügen und mischen, gefolgt von einer 30-minütigen (kein Schütteln) Inkubation im vorgewärmten 37 °C Thermoschüttler.
   3. Fügen Sie 25 mg Glasperlen zu den Proben hinzu und wirbeln Sie mit maximaler Geschwindigkeit für 5 minuten. Den Thermoschüttler auf 55 °C vorheizen.
   4. Lassen Sie die Perlen absetzen, bevor Sie den Überstand in ein neues 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 100 μL Proteinase K-Puffer und 20 μL Proteinase K übertragen.
   5. Inkubieren Sie mit Schütteln bei 600 U / min in einem 55 °C Thermoschüttler für 60 min. Zentrifuge bei 10.000 x g für 2 min und überstand in ein neues 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen. Den Thermoschüttler auf 65 °C vorheizen. Beginnen Sie mit dem Vorwärmen des Elutionspuffers in einem 65 °C Hybridisierungsofen.
   6. Fügen Sie 220 μL 100% Ethanol hinzu. Wirbel bei maximaler Geschwindigkeit für 20 s. Brechen Sie sichtbare Niederscheidung auf, indem Sie 10x auf und ab pipettieren.
   7. Führen Sie eine DNA-Säule in ein 2-ml-Sammelröhrchen ein und übertragen Sie die Probe in die Säule, einschließlich aller Ausfällungen, die sich möglicherweise gebildet haben. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 1 min, entsorgen Sie Filtrat aus dem Sammelrohr und ersetzen Sie das Auffangrohr.
   8. Fügen Sie 500 μL Bindungspuffer zur Säule hinzu und zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 1 min. Entsorgen Sie Filtrat aus dem Sammelrohr und ersetzen Sie das Auffangröhrchen.
   9. 700 μL DNA-Waschpuffer in die Säule geben und bei 10.000 x g zentrifugieren für 1 min. Entsorgen Sie Filtrat aus dem Sammelrohr und ersetzen Sie das Auffangröhrchen. Wiederholen Sie dies für einen zweiten Waschschritt.
   10. Zentrifugieren Sie die leere Säule für 2 min, um sie zu trocknen, und übertragen Sie die Säule anschließend in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenrohr. 50 μL vorgewärmter Elutionspuffer direkt in die DNA-Säulenmatrix geben und bei 65 °C für 5 min inkubieren.
   11. Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min zu eluierten. Quantifizieren Sie die extrahierte DNA im Filtrat mittels Spektrophotometrie oder Fluorometrie.
4. Amplifizieren und verdauen Sie das ganze 16S-Gen. Visualisieren Sie Fragmente mit Gelelektrophorese.
   1. Verwenden Sie 12,5 μL 2x Master-Mix, 0,5 μL jedes Primers 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) und 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng DNA und molekulares Wasser für ein Gesamtreaktionsvolumen von 25 μL.
   2. Führen Sie das folgende Thermocycler-Programm aus: 94 °C für 60 s; gefolgt von 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 50 °C für 45 s, 68 °C für 90 s; gefolgt von 68 °C für 5 min.
   3. Reinigen Sie das Polymerase-Kettenreaktionsprodukt (PCR) mit einem DNA-Reinigungskit (Table of Materials).
      1. Fügen Sie dem PCR-Produkt 120 μL Reinigungspuffer hinzu und mischen Sie den Wirbel. Kurz zentrifugiert, um Tröpfchen im Deckel zu sammeln. Eine DNA-Säule in ein 2 ml Sammelröhrchen einführen, die Flüssigkeit in die vorbereitete Säule geben und bei ≥13.000 x g für 1 min zentrifugieren.
      2. Entsorgen Sie das Filtrat und ersetzen Sie das Auffangrohr. 700 μL DNA-Waschpuffer und Zentrifuge bei ≥13.000 x g für 1 min hinzufügen. Entsorgen Sie das Filtrat und ersetzen Sie das Auffangrohr. Wiederholen Sie dies für einen zweiten Waschschritt.
      3. Zentrifugieren Sie die leere Säule für 2 min zum Trocknen und übertragen Sie die Säule in ein neues 1,5 ml Zentrifugenrohr. 50 μL vorgewärmter Elutionspuffer direkt in die DNA-Säulenmatrix geben und bei Raumtemperatur für 2 min inkubieren.
      4. Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min zu eluierten. Quantifizieren Sie die extrahierte DNA in Filtrat mittels Spektrophotometrie oder Fluorometrie.
   4. 1 μg gereinigtes PCR-Produkt zu 5 μL Aufschlusspuffer, 10 Einheiten RsaI und molekularem Wasser für ein Gesamtreaktionsvolumen von 50 μL geben. Mischen Sie durch Pipettieren auf und ab und inkubieren Sie bei 37 °C für 60 min.
   5. Trennen Sie das verdaute Produkt durch Gelelektrophorese, indem Sie 20 μL verdaute DNA auf ein 2% iges Agarosegel laufen lassen. Visualisieren Sie das Gel, um den gnotobitischen Status zu bestätigen.
      HINWEIS: Gnotobiotische Insekten sollten nur zu Bändern bei 402 bp, 201 bp und einem Abstrich von 163 bis 148 bp führen, basierend auf der 16S rDNA-Sequenz des Endosymbionten Blattabacterium. Alle zusätzlichen Bänder, die im Gel zu sehen sind, deuten auf eine Kontamination mikrobieller Spezies hin.

7. Aseptische Verfolgung des Nymphenwachstums

1. Zeichnen Sie die Körperlänge auf, um das Nymphenwachstum zu verfolgen, indem Sie die Insekten durch den durchscheinenden BHI-Boden des Kolbens messen.
   HINWEIS: Nymphen können für 15 Minuten bei 4 ° C platziert werden, um ihre Bewegung zu verlangsamen und dadurch leichter zu messen.

Lagertanks werden wie in Abbildung 1dargestellt aufgestellt. "Schwangere" Weibchen werden durch die Oothek identifiziert, die am hinteren Bauch befestigt ist, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Inkubation von Oothecae auf BHI-Agar ermöglicht eine zerstörungsfreie gnotobitische Qualitätskontrolle. In einigen Fällen ist die Sterilisation nicht erfolgreich, und das Wachstum erscheint um die Ootheka herum, wie in Abbildung 3B. Diese Oothekanen sollten entfernt und entsorgt werden. In unseren Händen wurde eine durchschnittliche Ausfallrate von 10% für die Sterilisation beobachtet (n = 51). Die Ootheken schlüpfen durchschnittlich 34 Tage nach der Sterilisation ohne Wachstum auf dem Medium, wie in Abbildung 3A zu sehenist. Wir haben typische Schlupfraten von 41% (n = 46) für sterilisierte, nicht kontaminierte Ootheken beobachtet, mit durchschnittlich 11 Nymphen pro Oothek. Größere Nymphen werden in BHI-Kolben überführt, die mit Folie bedeckt sind, wie in Abbildung 4dargestellt. Die Folie verhindert eine Kontamination, und die Nymphen haben Platz zum Wachsen. RFLP der 16S rDNA von einer homogenisierten Nymphe wird verwendet, um den gnotobiotischen Status zu bestätigen. Es wurde beobachtet, dass gnotobitische Nymphen langsamer wachsen als ihre nicht sterilen Gegenstücke, wie abbildung 5 dargestellt. Abbildung 6 zeigt Ergebnisse von erfolgreich gnotobitischen Insekten sowie Standardnymphen (nichtsterilen) Nymphen.

Während dieser Test noch keine Kontamination in Ermangelung eines positiven Kulturergebnisses identifiziert hat, wurde dieser Schritt routinemäßig während kritischer Experimente durchgeführt, um das Vorhandensein von kontaminierenden sauerstoffempfindlichen oder anspruchsvollen Mikroben auszuschließen. Ein langsameres Wachstum wurde bei den gnotobiotischen Kakerlaken im Vergleich zu Standard- / nichtsterilen Insekten beobachtet.

Abbildung 1: Aufbau der Kakerlaken-Bestandskultur.
Kartonrohre sind am anderen Ende des Tanks gestapelt zu sehen. Essen und Wasser befinden sich beide in der Nähe der Vorderseite des Tanks. Baumwolltuchbezug und Gummiband wurden aus Sichtgründen entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Eine "schwangere" amerikanische Kakerlake.
Der Pfeil zeigt die Ootheka an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Bilder von erfolgreich gnotobitischen Nymphen, die auf BHI-Slants geschlüpft und erfolglos sterilisiert wurden.
Oothecae wurden sterilisiert und inkubiert, wie in diesem Protokoll beschrieben. (A) Das Fehlen eines mikrobiellen Wachstums auf der BHI-Neigung deutet darauf hin, dass die Insekten frei von kultivierbaren Organismen sind. (B) Oothecae auf Slants, die zur Koloniebildung führen, sollten als kontaminiert verworfen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Gnotobiotischer Aufzuchtapparat.
Insekten werden in sterilen Kolben gehalten, die mit einem Foliendeckel bedeckt sind, um eine Kontamination zu verhindern. Der sekundäre Behälter (grüner Deckel) wird mit 2% Bleichmittel sterilisiert, gefolgt von 70% Ethanol. Der Luftstrom ist im Sekundärbehälter nicht eingeschränkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Repräsentative Wachstumsratendaten, die Körperlängen von gnotobitischen und nichtsterilen Nymphen vergleichen. Beide Insektengruppen wurden mit autoklavierten Nagetieren gefüttert. Gnotobiotische Insekten (hier: n = 105) werden wie beschrieben auf BHI gehalten. Nichtsterile Insekten (hier: n = 50) leben in Kolben mit autoklaviertem Hackschnitzelbett mit kleinem Geschirr für Wasser. Nichtsterile Nymphen wachsen durchschnittlich 0,059 mm / Tag, während gnotobitische Nymphen mit 0,028 mm / Tag wachsen (p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Ein repräsentatives Gelbild der RFLP-Ergebnisse zur Qualitätskontrolle.
Whole-16S-Genamplikone wurden mit RsaI verdaut. DNA für PCR wurde aus Nymphen extrahiert, die in 1x PBS homogenisiert wurden. "G Nymph" -Bahnen entsprechen gnotobitischen Nymphen, während "Kon-Nymphen" -Bahnen konventionellen, nichtsterilen Gegenstücken entsprechen. Basierend auf der virtuellen Restriktionsverdauung wird erwartet, dass das Endosymbiont (Blattabacterium) Bänder in den Größen 402 bp, 206 bp und 163 bp mit einem Abstrich von Bändern zwischen 163 bp und 148 bp aufwies. Ein gnotobiotisches Insekt sollte nur das Blattabacterium-Banding-Muster zeigen. Es wird erwartet, dass eine gemischte Bakteriengemeinschaft einen Abstrich von Bändern mit unterschiedlichen Größen hat, die hier als "andere bakterielle 16S-Fragmente" bezeichnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.