Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Summary

Beschrieben hier ist ein Protokoll, das die kolorimetrische Quantifizierung der Menge der Nahrung ermöglicht, die innerhalb eines definierten Zeitintervalls von Drosophila melanogaster Larven gegessen wird, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Diese Assays werden im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Bildschirms durchgeführt.

Abstract

Futter- und Fütterungsverhalten ermöglichen es Tieren, auf Energiequellen und Nährstoffe zuzugreifen, die für ihre Entwicklung, Gesundheit und Fitness unerlässlich sind. Die Untersuchung der neuronalen Regulation dieser Verhaltensweisen ist für das Verständnis der physiologischen und molekularen Mechanismen, die der Ernährungshomöostase zugrunde liegen, von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung genetisch bestückbarer Tiermodelle wie Würmer, Fliegen und Fische erleichtert diese Art von Studien erheblich. In den letzten zehn Jahren wurde die Fruchtfliege Drosophila melanogaster von Neurobiologen als mächtiges Tiermodell verwendet, die die neuronale Kontrolle von Fütterungs- und Futterverhalten untersuchen. Obwohl zweifellos wertvoll, untersuchen die meisten Studien erwachsene Fliegen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das das einfachere Larvennervensystem nutzt, um neuronale Substrate zu untersuchen, die das Fütterungsverhalten kontrollieren, wenn Larven Diäten ausgesetzt sind, die sich in ihrem Protein- und Kohlenhydratgehalt unterscheiden. Unsere Methoden basieren auf einem quantitativen kolorimetrischen No-Choice-Fütterungstest, der im Rahmen eines neuronalen thermogenetischen Aktivierungsbildschirms durchgeführt wird. Als Auslese wurde die Menge an Lebensmitteln, die von Larven über ein Intervall von 1 h gegessen wurden, verwendet, wenn sie einer der drei mit Farbstoffen gekennzeichneten Diäten ausgesetzt wurde, die sich in ihrem Protein-Zu-Kohlenhydrat-Verhältnis (P:C) unterscheiden. Die Wirksamkeit dieses Protokolls wird im Kontext eines neurogenetischen Bildschirms bei Larven Drosophilademonstriert, indem kandidaten neuronale Populationen identifiziert werden, die die Menge der Nahrung regulieren, die in Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität gegessen wird. Wir waren auch in der Lage, die getesteten Genotypen in phänotypische Klassen zu klassifizieren und zu gruppieren. Neben einem kurzen Überblick über die derzeit verfügbaren Methoden in der Literatur werden die Vorteile und Grenzen dieser Methoden diskutiert und es werden auch einige Vorschläge gemacht, wie dieses Protokoll an andere spezifische Experimente angepasst werden könnte.

Introduction

Alle Tiere sind auf eine ausgewogene Ernährung angewiesen, um die notwendigen Nährstoffmengen für Überleben, Wachstum und Fortpflanzung zu erhalten¹. Die Wahl dessen und wie viel zu essen wird durch eine Vielzahl von interagierenden Faktoren im Zusammenhang mit dem inneren Zustand des Tieres beeinflusst, wie die Sättigungsstufe, und Umweltbedingungen, wie Lebensmittelqualität^2,3,4,5. Protein und Kohlenhydrate sind zwei wichtige Makronährstoffe und seine ausgewogene Aufnahme ist wichtig, um die physiologischen Prozesse der Tiere aufrechtzuerhalten. Daher ist das Verständnis der neuronalen Mechanismen, die das Fütterungsverhalten steuern und eine ausgewogene Aufnahme dieser Makronährstoffe aufrechterhalten, äußerst relevant. Dies liegt daran, dass lebensgeschichtliche Merkmale wie Lebensdauer, Fruchtbarkeit und metabolische Gesundheit direkt durch die Mengen der Proteinaufnahme^6,7,8,9,10beeinflusst werden.

Die Verwendung einfacherer, haltbarer ergewöhnlicher Erregungsorganismen, die evolutionär konservierte Fütterungsgewohnheiten mit komplexen Tieren, einschließlich Säugetieren, aufweisen, ist für diese Art von Studien von wesentlicher Bedeutung. Wichtig ist, dass diese einfacheren Tiermodelle eine gute Gelegenheit bieten, komplexe biologische Fragen in einem kostspieligen, ethisch und technisch effektiveren Kontext zu sezieren. In den letzten Jahrzehnten war Drosophilamit seinem leistungsstarken genetischen Toolkit, komplizierten und stereotypen Verhalten und konservierter Architektur von peripheren und nährstoffsensorischen Mechanismen mit Säugetieren ein fruchtbares Modell für Verhaltensneurobiologen¹¹. Letztlich besteht die Hoffnung, dass wir durch das Verständnis, wie die Nahrungsaufnahme in diesem Tier mit einem einfacheren Nervensystem reguliert wird, dann beginnen können, neuronale Fehlfunktionen zu entwirren, die menschlichen Essstörungen zugrunde liegen.

Die Untersuchung neuronaler Substrate für das Fütterungsverhalten hängt stark davon ab, dass sie gleichzeitig die Nahrungsaufnahme von Tieren messen können, während sie ihre neuronale Aktivität manipulieren. Aufgrund der minimalen Menge an aufgenommenen Lebensmitteln ist die Quantifizierung der Menge an Lebensmitteln, die von Fliegen gegessen werden, äußerst anspruchsvoll, und alle derzeit verfügbaren Methoden stellen erhebliche Einschränkungen dar. Daher ist der Goldstandard eine Kombination komplementärer Methoden¹²zu verwenden. Erwachsene Fliegen wurden historisch als genetisches und Verhaltensmodell bevorzugt. Dennoch, Drosophila Larven, bieten auch Möglichkeiten, neuronale Substrate Codierung Fütterung Verhalten zu untersuchen. Das Larven-Zentralnervensystem (ZNS) mit rund 12.000 Neuronen ist deutlich weniger komplex als das des Erwachsenen, der etwa 150.000 Neuronen enthält. Diese geringere Komplexität ist nicht nur numerisch, sondern auch funktional, da Larvenverhalten auf einfacheren Lokomotivfunktionen und sensorischen Systemen beruht. Trotz der scheinbaren Einfachheit ihres Nervensystems, Larven zeigen immer noch vollständige Fütterungsverhalten, und einige Methoden zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme in Drosophila Larven wurden beschrieben^5,13,14,15. Durch die Kombination mit Manipulationen der neuronalen Aktivität, Drosophila Larven können ein hoch gradlierbares Modell für das Verständnis der neuronalen Regulation der Nahrungsaufnahme bilden.

Hier ist ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme in Larven, die Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualität ausgesetzt sind. Die Diäten, sogenannte Makronährstoffausgleichsdiäten, unterschieden sich in den Protein- und Kohlenhydratgehalten, insbesondere in Bezug auf die Protein-Kohlenhydrat-Verhältnisse (P:C) Verhältnisse: 1:1 (proteinreiche Ernährung), 1:4 (Zwischenernährung) und 1:16 (proteinarme Ernährung), wie in Abbildung 1Adargestellt. Kurz gesagt, wurde ein quantitativer No-Choice-Fütterungstest mit diesen drei isocalorischen Saccharose-Hefe (SY)-basierten Diäten mit einem blauen Lebensmittelfarbstoff gefärbt etabliert. Da Hefeextrakt und Saccharose als Protein- und Kohlenhydratquellen verwendet wurden und beide Kohlenhydrate enthalten, wurde eine Variation der P:C-Verhältnisse durch Änderung des Gleichgewichts dieser beiden Komponenten, wie zuvor beschrieben¹⁶ und wie in Abbildung 1Bangegeben, erreicht. Eine schematische Übersicht über das Protokoll mit den wichtigsten experimentellen Schritten ist in Abbildung 2verfügbar.

Dieses Protokoll wurde mit dem Ziel erstellt, die Rolle spezifischer neuronaler Populationen bei der Regulierung der Larvenfütterungsspiegel in Diäten unterschiedlicher P:C-Verhältnisse und im Rahmen eines thermogenetischen neuronalen Bildschirms zu untersuchen. Ein gut charakterisiertes neurogenetisches Werkzeug wurde aus der Transienten-Rezeptorpotential (TRP)-Familie verwendet: Drosophila Transient Receptor Potential Channel (dTRPA1), ein Temperatur- und spannungsgebundener Kationenkanal, der das Abfeuern von Aktionspotentialen ermöglicht, wenn Umgebungstemperaturen über 25 °C¹⁷steigen. Um die dTRPA1-Transgene auszudrücken, nutzten wir die Gal4-Linien, die auf cis-regulatorischenRegionen aus dem Im Rubin-Labor ansässigen Drosophila-Genom im Rahmen des FlyLight-Projekts am Janelia Research Campus^18,19basieren.

Obwohl das Protokoll, hier beschrieben, im Kontext eines Aktivierungsbildschirms eingerichtet wurde, kann es vom Experimentator leicht an andere spezifische Bedürfnisse oder Interessen angepasst werden, nämlich einen Unterdrückungsbildschirm mit dem temperaturempfindlichen neuronalen Schalldämpfer ShibireTS²⁰durchzuführen, alternativ zu dTRPA1. Diese und andere Anpassungen werden in den Protokoll- und Diskussionsabschnitten diskutiert.

Protocol

1. Zubereitung der Saccharose-Hefe-Diäten (SY)

1. Wiegen Sie alle trockenen Zutaten (Agar, Hefe, Saccharose) für die Makronährstoffausgleich und L3-Aufzucht diäten. Die Mengen in Gramm für jeden der Zutaten, die für die Zubereitung von 1 L Lebensmittel benötigt werden, sind in Abbildung 1Bangegeben.
   HINWEIS: Berücksichtigen Sie, dass ca. 13 ml Lebensmittel benötigt werden, um eine 60-mm-Petrischale zu füllen.
2. Lösen Sie alle Zutaten in sterilem destilliertem Wasser (verwenden Sie ca. 50% der Gesamtmenge an Wasser, die für die Zubereitung des Lebensmittels benötigt wird) und rühren Sie das Medium für 5-10 min.
3. Autoklav für 50 min.
4. Nachdem die Medien abgekühlt werden können, fügen Sie nipagin und Propionsäurelösungen in einer Endkonzentration (v/v) von 3% bzw. 0,3% zu den Diäten hinzu. Zu den Makronährstoff-Ausgleichsdiäten fügen Sie blauen Lebensmittelfarbstoff zu einer Endkonzentration (v/v) von 1% hinzu. Vervollständigen Sie die Gesamtvolumina mit destilliertem Wasser.
5. Gießen Sie die Essensdiäten vorsichtig auf 60 mm Petrischalen, so dass die Menge der gegossenen Lebensmittel in jedem der Teller ungefähr gleich ist. Beschriften Sie die Platten mit den P:C-Verhältnissen der Diäten.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Makronährstoff-Ausgleichsdiäten am Tag des Fütterungstestes vor. Wenn nicht möglich, lagern Sie die vorbereiteten Diäten bei 4 °C, in einem versiegelten Behälter, für eine maximale Dauer von 3 Tagen. Längere Lagerzeiten machen die Ernährung zu trocken und hart, und die Larven können nicht in das Medium graben.

2. Genetisches Kreuz der Elternlinien

HINWEIS: Verwenden Sie das Gal4/UAS-System^21, um die genetischen Kreuze einzurichten. In diesem Protokoll wurden zur Aktivierung der neuronalen Funktion in bestimmten neuronalen Populationen weibliche Jungfrauen der UAS dTRPA1 Linie¹⁷ verwendet und an Männchen aus den Janelia Gal4-Linien gekreuzt (Abbildung 2A). Die verwendete genetische Kontrolle war die Nachkommenschaft einer Kreuzung zwischen der dTRPA1-Linie und einer "leeren GAL4"-Linie, die Gal4 in dem Vektor trägt, der zur Generierung der Rubin Gal4-Sammlung verwendet wird, aber ohne regulatorisches Fragment vorhanden ist (attP2)²². Um die neuronale Unterdrückung zu fördern, kann anstelle von dTRPA1 eine UAS-Linie verwendet werden, die ShibireTS²⁰ kodiert.

1. Richten Sie 60-mm-Embryo-Sammelkäfige mit L3-Aufzucht-Diätplatten ein, ergänzt durch eine aktive Hefepaste.
2. Übertragen Sie die erwachsenen UAS dTRPA1 Jungfrauen und Janelia Gal4 Männchen, im Alter von 5-8 Tagen, in die Embryo-Entnahme-Käfige und lassen Sie die Paarung für 24-48 h auftreten, bei 25 °C, mit 60% Luftfeuchtigkeit und einem 12:12 Hell-Dunkel-Zyklus (Abbildung 2A). Für 60 mm Embryo-Entnahmekäfige verwenden Sie etwa 100 jungfräuliche Weibchen und 30 Männchen pro Kreuz.
3. Entfernen und entsorgen Sie am Ende der Paarungszeit die L3-Aufzuchtplatten, die in den genetischen Kreuzen verwendet werden. Ersetzen Sie sie durch frische L3-Aufzucht-Diätplatten, um die Eierlege und Larven-Inszenierung durchzuführen.

3. Herstellung von Drittsternlarven (L3)

1. Übertragen Sie die gepaarten Erwachsenenfliegen auf frische L3-Aufzucht-Diätplatten und lassen Sie die Eiablage für 3-4 h bei 25 °C auftreten (Abbildung 2B). Stellen Sie sicher, dass alle Platten mit dem Genotyp, P:C-Verhältnis der Ernährung und dem Datum des Eides beschriftet sind.
   HINWEIS: Um Zeit zu sparen, führen Sie die Eiablage direkt in die L3-Aufzuchtdiät durch, wodurch eine zusätzliche Handhabung der Eier vermieden wird. Bei kleinen genetischen Screenings kann die Eiablage durch die Verwendung von Apfelsaft-Agarplatten optimiert werden.
2. Am Ende der Eiablagezeit die Platten aus den Käfigen entfernen und mit Plastikdeckeln bedecken. Falls Hefeextrakt verwendet wird, um die L3-Aufzuchtplatten zu ergänzen, stellen Sie sicher, dass alle Resthefe am Ende der Eiablage entfernt wird. Dies ist wichtig, um eine ungleichmäßige Fütterung während des Larvenwachstums zu vermeiden.
   HINWEIS: Die gepaarten Erwachsenen können auf frische L3-Aufzucht-Diätplatten übertragen werden, so dass mehr Eierlege durchgeführt werden und experimentellere Larven erhalten werden können. Konsekutive Ei-Lays können mit den gleichen Erwachsenen während einer ganzen Arbeitswoche durchgeführt werden.
3. Schätzen Sie die Anzahl der Eier pro Platte und halten Sie die Larvendichte auf maximal 200 Embryonen pro Platte. Diese Schätzung kann durch Zählen der Anzahl der Embryonen in einem Viertel der Platte durchgeführt werden.
   HINWEIS: Eine überfüllte Platte verzögert die Larvenentwicklung und wirkt sich auf das Larvenfütterungsverhalten aus.
4. Inkubieren Sie die L3-Aufzuchtplatten bei 18 °C (zulässige Temperatur), 60% Luftfeuchtigkeit und einem 12:12-Licht-Dunkel-Zyklus, und lassen Sie die Larven 9 Tage lang wachsen (Abbildung 2B).
5. Sammeln Sie am neunten Tag nach der Eiablage (AEL) drei Gruppen von 10 L3 von jedem der zu testenden Genotypen (und für die Repliken). Sammeln Sie zusätzlich Gruppen von 10 L3 für die "Null-Färbe-Lebensmittel"-Kontrolle. Stellen Sie sicher, dass die Larvensammlung während der gleichen Zeiträume des Tages erfolgt, an dem die Eilege durchgeführt werden (z. B. wenn die Eiablage zwischen 10 und 14 Uhr erfolgt ist, die Larven während des gleichen Zeitraums von 9 Tagen AEL sammeln) und so schonend wie möglich mit Zangen #5 oder einer Federgewichtszange durchgeführt wird. Die Larven wie im nächsten Schritt angegeben (3.6) direkt übertragen.
   HINWEIS: Die "Null-Färbe-Lebensmittel" Kontrolltiere sind Larven, die in der Fütterung Assay Erhalten Nahrung ohne Blaufarbstoff gegeben werden. Diese Kontrolle ist zwingend erforderlich, um die Hintergrundabsorption von Denlarvenextrakten zu entfernen.
6. Übertragen Sie die gesammelten Experimentellen Larven auf KunststoffschalengewichtBoote mit 1 ml Wasser. Stellen Sie sicher, dass L3 und nicht L2 gesammelt wird, indem Sie den Anweisungen in Abbildung 3folgen.
   HINWEIS: Die Sammlung von L3 zu Kunststoffbooten, die Wasser oder 1x Phosphat-gepufferte Salzsäure (PBS) enthalten, ist wichtig, um Larven vor Beginn des Fütterungstestes gut hydratisiert zu halten. Dies ist besonders wichtig, wenn mehrere experimentelle L3-Gruppen aus verschiedenen Genotypen gleichzeitig gesammelt werden. Verfolgen Sie die Sammelreihenfolge für jede Gruppe, sodass Unterschiede in der Dauer der Nahrungsentzugszeit für jede Gruppe minimiert werden. Der Einsatz von Kunststoffbooten in diesem Schritt erleichtert den optionalen Schritt 4.3, da es Larven ermöglicht, direkt in das Wasserbad zu schwimmen.

4. Thermogenetische Aktivierung und no-choice Fütterungstest

HINWEIS: Es wird empfohlen, die Fütterungstests ungefähr zur gleichen Tageszeit durchzuführen, um mögliche Variationen im Zusammenhang mit den zirkadianen Rhythmen zu minimieren. Führen Sie auch immer die Kontrollexperimente (die Nachkommen der "leeren Gal4"-Linie zu UAS dTRPA1 und den "Null-Farbstoff-Lebensmittel"-Larven) parallel zu den Genotypen von Interesse.

1. Einrichten eines Inkubators auf 30 °C (nicht-zulässige Temperatur) und halten Sie hohe Luftfeuchtigkeit (mindestens 65%) larvende Austrocknung während des Assays zu vermeiden.
2. Vor Beginn des Fütterungstestes die Temperatur der Assayplatten ausdemieren, indem Sie sie 30 min bei 30 °C erwärmen.
3. (Optional) Hitzeschock der experimentellen Larven für 2 min in einem 37 ° C Wasserbad. Führen Sie diesen Schritt mit den Tieren in den Plastikgewichtsbooten durch, die etwas Wasser enthalten.
   HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist es, die neuronale Aktivierung zu intensivieren, indem das Abfeuern der Neuronen seit Beginn des Fütterungstestes gefördert wird.
4. Halten Sie mehrere Timer für 1 h bereit. Die Anzahl der zu verwendenden Timer hängt von der Anzahl der getesteten Versuchsgruppen und von der Geschicklichkeit des Experimentators im Umgang mit Larven ab.
   HINWEIS: Die Verwendung mehrerer Timer ist entscheidend, um die Dauer des Assays für alle Genotypen konsistent zu halten.
5. Entleeren Sie vorsichtig das Wasser aus den Plastikbooten und übertragen Sie die L3-Gruppen mit einer befeuchteten weichen Bürste vorsichtig von den Booten in die Mitte der Assayplatten. Legen Sie die Deckel der Platten zurück und starten Sie einen Timer für jede Platte (oder Gruppe von Platten), um genaue 1-h-Fütterungssitzungen beizubehalten.
6. Lassen Sie die Larven für 1 h, bei 30 °C, im Dunkeln füttern (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Die Leistung des Assays im Dunkeln ist wichtig, um Unterschiede in den visuellen Hinweisen über die Diäten hinweg zu kontrollieren, da sich die Diäten in Tönen unterscheiden, obwohl sie die gleiche Farbstoffkonzentration enthalten.
7. Stoppen Sie den Fütterungstest, indem Sie die Platten in ein Eisbad übertragen. Drücken Sie das Eis so weit wie möglich nach unten, um eine stabile Oberfläche für die Platten zu schaffen.
   HINWEIS: Kalte Temperaturen fördern das Ende der Fütterung, indem sie das Bohr- und Grabenverhalten hemmen. Die meisten Larven werden die Teller nach einigen Minuten an den Oberfläche, erleichtert ihre Genesung in den folgenden Schritten.

5. Lebensmittelfarbstoffextraktion

1. Bereiten Sie 2 ml Mikroröhren für jede Gruppe von 10 l3 getesteten Mikroröhren vor, die ungefähr die gleichen Mengen von 0,5 mm-Glasperlen (genug, um den unteren Teil des Mikrorohrs zu füllen) und 300 l eiskaltem Methanol enthalten. Halten Sie die Mikroröhren in der Kälte, mit einem Bankkühler.
   VORSICHT: Methanol ist leicht entzündlich und giftig. Befolgen Sie alle Sicherheitsverfahren, die für den Umgang mit diesem Reagenz empfohlen werden, einschließlich der Arbeit in einem gut belüfteten Bereich und dem Tragen von Nitrilhandschuhen.
   HINWEIS: Die Verwendung von Methanol ist wichtig, um die Larvenproben zu fixieren und Melanisierungsreaktionen in der Nagelhaut zu vermeiden.
2. Mit #5 oder Federgewichtszangen die Gruppen von 10 L3 vorsichtig von den Futterprüfplatten bergen und auf die Deckel der Assayplatten übertragen, die etwas Wasser enthalten. Spülen Sie die Larven, um Lebensmittelreste auf ihrem Körper zu entfernen, während Sie die Larven sanft behandeln, um Verletzungen zu vermeiden. Führen Sie eine Aufzeichnung der Anzahl der Larven, die für jeden Genotyp pro Replikation zurückgewonnen wurden, so dass die durchschnittliche Menge der Nahrungsaufnahme pro Larve quantifiziert werden kann.
   HINWEIS: Verletzte Larven sollten entsorgt werden, da sie eine melanisierte Nagelhaut haben, da sie für die kolorimetrische Quantifizierung ungeeignet sind.
3. Übertragen Sie die L3-Gruppen auf die in 5.1 hergestellten 2 ml Mikroröhren.
4. Lyse die Larvengewebe, um die Lebensmittelfarbstoff aus dem Darm durch eine mechanische Lyse-Methode mit einem Gewebe Lyzer und Glasperlen in Schritt 5.1 hinzugefügt zu extrahieren. (wenn kein Gewebelyzer verfügbar ist, verwenden Sie einen homogenisierenden Stößel). Führen Sie diesen Schritt bevorzugt bei 4 °C(Abbildung 2D) aus.
   HINWEIS: Die Dauer dieses Schritts hängt von der verwendeten Ausrüstung ab. Mit einem herkömmlichen Gewebelyser ist 1 min Extraktion ausreichend. Bei zeitlichen Einschränkungen kann das Protokoll am Ende dieses Schritts angehalten und später fortgesetzt werden. Lagern Sie die Proben bei -20 °C.
5. Übertragen Sie die Extrakte auf 1,5 ml Mikroröhren, indem Sie die 2 ml Mikroröhren direkt auf die neuen 1,5 ml Mikroröhren umkehren. Bei sanfter Arbeit bleiben die meisten Glasperlen am bodendes Ende des 2 ml Mikroröhren.
6. Löschen Sie die Zellablagerungen, indem Sie die Extrakte zentrifugieren, mit einer maximalen Geschwindigkeit für 10 min, bei 4 °C.
7. Sammeln Sie die Überräube, um 1,5 ml Mikroröhren zu reinigen. Wenn Zellablagerungen in den Überstand noch sichtbar sind, wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7.

6. Farbmetrische Quantifizierung des Lebensmittelverbrauchs

1. Bereiten Sie Standardlösungen vor, um eine Kalibrierkurve zu erzeugen, indem Sie serielle 1:2-Verdünnungen in Methanol einer beginnenden blauen Farbstofflösung durchführen. Verwenden Sie als Rohling nur Methanol. Die Konzentration der Normen hängt von der Futteraufnahme der Tiere ab.
   HINWEIS: Im Falle des hier vorgestellten Pilotsiebes wurde eine Standardkurve verwendet, die durch Messung der Absorptionen von 8 seriellen Verdünnungen einer 2 L/ml-Blaufarbstofflösung in Methanol ermittelt wurde. Bei Bedarf die Konzentration dieser Lösungen erhöhen oder verringern, abhängig von der Farbstoffkonzentration der Versuchsproben.
2. Übertragen Sie 100 l der Versuchsproben (in Schritt 5.7), Normen und Rohling (Schritt 6.1) auf die Bohrungen einer 96-Well-Mikroplatte und messen Sie die Absorption bei 600 nm, mit einem Plattenleser(Abbildung 2E). Um die Hintergrundabsorption zu entfernen, messen Sie die Absorption von Extrakten aus Larven, die auf Lebensmitteln ohne Blaufärbung gefüttert werden, als "Null" für die Larvenextrakte ("Null-Farbstoff-Lebensmittelkontrolle").
3. Generieren Sie eine Standardkurve und korrelieren Sie die Absorptionswerte für die Proben aus jeder experimentellen Larvengruppe mit der Menge der Nahrungsaufnahme (Volumen in ml). Ermitteln Des durchschnittlichen Nahrungsmittelverbrauchs pro Larve unter Berücksichtigung der Anzahl der für jede Gruppe gesammelten Larven in Schritt 5.2

Results

Drosophila-Larven regulieren ihre Proteinzufuhr auf Kosten der Einnahme überschüssiger Kohlenhydrate²³ (schematische Darstellung in Abbildung 2E). Tatsächlich wurde diese Priorisierung der Proteinzufuhr bei vielen anderen Tieren beobachtet und wird als Protein-Hebel^24,25bezeichnet.

Unter Ausnutzung dieser robusten Fütterungsverhaltensreaktion wurde ein verhaltensbasierter B...

Discussion

Mit diesem Protokoll könnte man die Fähigkeit von Larven unter thermogenetischer Aktivierung bestimmter neuronaler Populationen testen, um die Aufnahmevonwerte von Proteinen und Kohlenhydraten, zwei hauptwichtigsten Makronährstoffen, zu regulieren, wenn sie Diäten unterschiedlicher P:C-Zusammensetzung ausgesetzt sind. Diese Methode wurde im Rahmen eines Larven-Vorscreenings getestet, um neuronale Populationen zu identifizieren, die mit der Kontrolle der Nahrungsaufnahme über Diäten unterschiedlicher Makronährstoffqualitä...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Mikroröhrchen	Sarstedt AG & Co. KG	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2,0 mL Mikroröhrchen	Sarstedt AG & Co. KG	72.695.500
60 mm Petrischalen	Greiner Bio-one, Österreich	628161
96 Well Mikrotiterplatten	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
Agar	Pró-vida, Portugal
Tischkühler	Nalgene, USA	Labtop Kühler 5115-0032
Blauer Lebensmittelfarbstoff	Rayner, Billingshurst, UK
Medien für den Zellaufschluss	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(0,5 mm Glasperlen)
Dish Weight Boats	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
Embryo-Entnahmekäfig für 60 mm Petrischalen	Flystuff, Wissenschaftlicher Laborbedarf,	UK FLY1212 (59-100)
Federleichte Pinzette	BioQuip Products, USA	4750
Fliegenfutter für die Bestandspflege			1 l Futter enthält: 10 g Agar, 100 g Hefeextrakt, 50 g Saccharose, 30 mL Nipagin, 3 mL Propionsäure
Pinzette #5	Dumont	0108-5-PS	Standardspitzen, INOX, 11cm
Inkubator	LMS Ltd, UK	Series 2, Modell 230	Für thermogenetische Fütterungsassays (30? C)
Inkubator	Percival Scientific, USA	DR36NL	Zur Stadierung von Larven (19? C)
	Janelia lines Janelia Research Campus		Detaillierte Informationen in Tabelle 2
Makronährstoffausgleichende Diäten			Zusammensetzung und Nährwertangaben in Abbildung 1
Methanol	VWR	CAS-Nummer: 67-56-1
Nipagin (Methyl-4-hydroxybenzoat)	Sigma-Aldrich	H5501
Nitrilhandschuhe	VWR, USA
Kühlzentrifuge	Eppendorf, Deutschland	5804 R / Seriennummer: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Research Campus		Stoks erhältlich im Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS UAS-Linie	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC-Nummer: 66600	Zur Verfügung gestellt von Carlos Ribeiro Group
Weiche Bürsten			Zum Sortieren von betäubten Fruchtfliegen
Spektralphotometer Plattenleser	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Stereomikroskop	Nikon	1016625
Saccharose	Sidul, Portugal
		Larven im dritten Tier (L3)	Zusammensetzung und Nährwertangaben in Abbildung 1
Timer
Tissue Lyzer / Bead Beater	MP Biomedicals, USA	FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS-Linie	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC-Nummer: 26264	Exprimiert TrpA1 unter UAS-Kontrolle; kann verwendet werden, um Neuronen experimentell bei 25 ? C
Wasserbad	Sheldon Manufacturing Inc., USA	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Hefeextrakt	Pró-vida, Portugal		51% Protein, 15% Kohlenhydrate