Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos

Xinyi Liu; Si Wu; Wenqian Li; Meihong Zhang; Yan Wu; Ning Zhou; Pa Wu

doi:10.3791/61341

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Methodenartikel

Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos

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DOI:

10.3791/61341

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12. September 2020

Xinyi Liu¹^,² , Si Wu¹^,² , Wenqian Li¹^,² , Meihong Zhang¹^,² , Yan Wu¹^,² , Ning Zhou³ , Pa Wu¹^,²

¹Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation, College of Life Science, Hunan Normal University, ²State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, Hunan Provincial Key Laboratory for Microbial Molecular Biology, College of Life Science, Hunan Normal University, ³Department of Infectious Diseases, the Second Xiangya Hospital, Central South University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um die Wirkung einzelner Mückendarmbakterien zu untersuchen, einschließlich Isolierung und Identifizierung von Mücken-Mittelgut-anbaufähigen Mikroben, Antibiotika-Erschöpfung von Mückendarmbakterien und Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart.

Zusammenfassung

Die Mücke Midgut beherbergt ein hochdynamisches Mikrobiom, das den Wirtsstoffwechsel, die Fortpflanzung, die Fitness und die Vektorkompetenz beeinflusst. Es wurden Studien durchgeführt, um die Wirkung von Darmmikroben als Ganzes zu untersuchen; jedoch könnten verschiedene Mikroben unterschiedliche Auswirkungen auf den Wirt ausüben. Dieser Artikel enthält die Methodik, um die Wirkung jeder spezifischen Mückendarmmikrobe und den potenziellen Mechanismus zu untersuchen.

Dieses Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil stellt vor, wie man das Mückenmittelgut seziert, kultivierbare Bakterienkolonien isoliert und Bakterienarten identifiziert. Der zweite Teil sieht das Verfahren zur Erzeugung von antibiotikabehandelten Mücken und zur Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart vor.

Einleitung

Mücken gelten als die wichtigsten Vektoren menschlicher pathogener Krankheiten, die über hundert Krankheitserreger übertragen, darunter das Zika-Virus, das Dengue-Virus und die Plasmodium-Parasiten ¹. Wenn Mücken eine Blutmahlzeit nehmen, um Nährstoffe für die Oviposition zu erhalten, können sie versehentlich Krankheitserreger von einem infizierten Wirt über den Verdauungstrakt²aufnehmen. Wichtig ist, dass das Mückenmittelgut, das sowohl bei der Blutmahlzeit als auch beim Eintritt von Krankheitserregern eine zentrale Rolle spielt, ein hochdynamisches Mikrobiom³beherbergt.

Mehrere Studien haben labor- und feldgesammelte Mückenmikrobiota entweder mit einer kulturabhängigen Methode oder einem Bakteriensequenzierungstest⁴^,⁵^,⁶charakterisiert. Arten wie Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaund Enterococcus sind häufig von Mücken in verschiedenen Studien^{isoliert 5}^,⁷^,⁸^,⁹. Interessanterweise schwankt die Moskitodarmmikrobiota dynamisch sowohl in der Vielfalt der Gemeinschaft als auch in der Menge der Bakterienarten, die von der Entwicklungsphase, der Art, der geografischen Herkunft und dem Fütterungsverhalten betroffen sind⁴. Studien zeigen, dass die Blutfütterung die gesamte bakterielle Belastung mit einer schnellen Ausdehnung der Arten von Enterobacteriaceae und einer Verringerung der Gesamtvielfalt¹⁰^,¹¹dramatisch erhöht. Darüber hinaus wird Mückendarmmikrobiota des Larvenstadiums in der Regel ausgerottet, wenn das Insekt während der Pupation und Scheidung einer Metamorphose unterzogen wird; Daher müssen neu entstandene erwachsene Mücken ihre Mikrobiota⁴wieder bevölkern.

Gut mikrobiota moduliert Insektenphysiologie in verschiedenen Aspekten, einschließlich Nährstoffaufnahme, Immunität, Entwicklung, Reproduktion und Vektorkompetenz¹². Axenic Mückenlarven nicht über den ersten Instar entwickeln, während ein Bakterium orale Versorgung rettet Entwicklung, was darauf hindeutet, dass die Mücke Darm Mikrobe ist wichtig für die Larvenentwicklung¹³^,¹⁴. Außerdem, Erschöpfung der Darmbakterien verzögert Blutmehl Verdauung und Nährstoffaufnahme, wirkt sich auf die Oozytenreifung, und verringert oviposition¹⁵. Darüber hinaus lösen Mücken mit Darmmikroflora höhere Immunantworten im Vergleich zu antibiotikabehandelten Mücken aus, mit ständig erhöhter antimikrobieller Peptidexpression gegen andere Krankheitserreger, um¹⁶zu infizieren. Antibiotika werden in der Regel oral verabreicht, um Pan-Darm-Bakterien in diesen Studien zu entfernen, und dann werden Experimente durchgeführt, um den Unterschied zwischen axtischen Mücken und Mücken mit commenalen Mikroben zu vergleichen. Allerdings beherbergt die Mücke Midgut eine vielfältige Gemeinschaft von Mikroben, und jede Bakterienart könnte eine deutliche Wirkung auf die Wirtphysiologie ausüben.

Mückenmikrobiota reguliert Vektorkompetenz mit divergierenden Effekten. Die Kolonisation durch Proteus, isoliert von feldabgeleiteten Mücken von Dengue-endemischen Gebieten, verleiht eine hochregulierte antimikrobielle Peptidexpression und Resistenz gegen Dengue-Virusinfektionen¹⁶. Der entomopathogene Pilz Beauveria bassiana aktiviert den Toll- und JAK-STAT-Immunweg gegen eine Arbovirus-Infektion¹⁷. Im Gegensatz dazu erleichtert der aus Aedes aegypti midgut isolierte Pilz Talaromyces die Infektion des Dengue-Virus, indem er die Darmtrypsin-Aktivität^{moduliert 18}. Darüber hinaus fördert Serratia marcescens die Arbovirus-Übertragung durch ein sekretorisches Protein namens SmEnhancin, das die Mucin-Schicht auf dem Darmepithel von Mücken^{verdaut 19}.

Dieses Verfahren bietet eine systematische und intuitive Methode zur Zerlegung des Mückenmittelguts, zur Isolierung von kulturierbaren Bakterienkolonien, zur Identifizierung der Bakterienarten und zur Wiedereinführung durch orale Fütterung. Es liefert repräsentative Ergebnisse der Blutfütterung mit einem commensal Bakterium, Chryseobacterium Meningosepticum, auf Mücken EierstockEntwicklung und Oviposition.