Summary
Este manuscrito descreve um método para gravações contínuas de EEG de vídeo usando eletrodos de profundidade múltiplos em camundongos neonatais submetidos à hipoxia-isquemia.
Abstract
A isquemia de hipóxia é a causa mais comum de convulsões neonatais. Modelos animais são cruciais para a compreensão dos mecanismos e fisiologia subjacentes às convulsões neonatais e à isquemia de hipóxia. Este manuscrito descreve um método de monitoramento contínuo de eletroencefalograma de vídeo (EEG) em camundongos neonatais para detectar convulsões e analisar o fundo do EEG durante a isquemia de hipóxia. O uso de vídeo e EEG em conjunto permite a descrição da semiologia da convulsão e a confirmação de convulsões. Este método também permite a análise de espectrogramas de energia e tendências de padrão de fundo EEG durante o período de tempo experimental. Neste modelo de isquemia de hipóxia, o método permite o registro de EEG antes da lesão para obter uma linha de base normativa e durante a lesão e recuperação. O tempo total de monitoramento é limitado pela incapacidade de separar filhotes da mãe por mais de quatro horas. Embora tenhamos utilizado um modelo de convulsões hipoxica-isquêmicas neste manuscrito, este método para monitoramento de vídeo neonatais poderia ser aplicado a diversos modelos de doenças e convulsões em roedores.
Introduction
A encefalopatia isquêmica hipóxica (HIE) é uma condição que afeta 1,5 em 1000 recém-nascidos anualmente e é a causa mais comum de convulsões neonatais1,2. Os bebês que sobrevivem correm risco para várias deficiências neurológicas, como paralisia cerebral, deficiência intelectual e epilepsia3,4,5.
Os modelos animais desempenham um papel fundamental na compreensão e investigação da fisiopatologia da isquemia de hipóxia e convulsões neonatais6,7. Um modelo vannucci modificado é usado para induzir isquemia de hipóxia (OI) no pós-natal dia 10 (p10)7,8. Filhotes de rato dessa idade traduzem neurologicamente aproximadamente para o termo completo neonato humano9.
O monitoramento contínuo da eletroencefalografia por vídeo (EEG) utilizado em conjunto com este modelo de lesão permite maior compreensão e caracterização de convulsões isquêmicas hipoxicas neonatais. Estudos anteriores utilizaram vários métodos para análise de convulsões neonatais em roedores, incluindo gravações de vídeo, gravações limitadas de EEG e gravações de EEG de telemetria10,11,12,13,14,15,16. No manuscrito a seguir, discutimos em profundidade o processo de gravação contínua de EEG de vídeo em filhotes de camundongos durante a hipoxia-isquemia. Esta técnica de monitoramento contínuo de EEG em filhotes de camundongos neonatais pode ser aplicada a uma variedade de modelos de doenças e convulsões.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia.
1. Construção de eletrodo/cabo
- Use um fio de aço inoxidável isolado unipolar (0,005" de diâmetro nu, 0,008" revestido) para fazer um eletrodo conectado com um conector de soquete feminino (conector de recipiente feminino 0,079).
- Use um cabo feito sob medida para conectar os animais ao amplificador.
- Conecte um conector masculino de 4 pinos (conector masculino de 0,079") à unidade de 4 canais ganha impedância correspondente ao amplificador operacional (op-amp). Conecte um resistor de 10K aos fios que se conectam à bateria de 9 V. Um fio de terra não conectado ao op-amp atua como o ponto médio da bateria.
- Conecte uma extremidade do cabo (AWG, 0,012" OD) ao op-amp e conecte a outra extremidade do cabo ao amplificador.
2. Cirurgia de implantação de eletrodos
- Anestesiar o filhote (pós-natal dia 9) com isoflurane de 4-5% em um capô de fluxo descendente. Antes do início do procedimento, injete os filhotes com bupivacaína (0,02-0,05 mL, 0,25% de infiltração local subcutânea).
- Uma vez que o animal esteja imóvel, transfira para um estágio estereotático com um cone de nariz. Use o lado inverso da barra de ouvido, pois ela é macia para manter a cabeça firme. Nesta idade, os filhotes não têm um ouvido totalmente desenvolvido para usar a extremidade pontiaguda da barra de ouvido.
- Abaixe o fluxo de isoflurane e mantenha-o em 2,5-3%. Fique de olho na respiração constante do filhote durante todo o procedimento cirúrgico. Aperte a cauda para verificar a resposta à dor e, em seguida, proceda à incisão.
- Esterilize a área de incisão no crânio com betadina e álcool (3 ciclos de iodo alternado e 70% de etanol). Drape a parte do corpo circundante de tal forma que a região de incisão é visível.
- Abra o couro cabeludo anterior-posterior ligeiramente acima dos olhos e retraia aproximadamente 0,5 cm de pele. Reposicione a cabeça do rato no estágio estereotaxico para que a pele puxe para fora expondo o crânio.
- Aplique peróxido de hidrogênio no crânio usando um cotonete e raspe o crânio limpo usando uma lâmina de bisturi. O crânio é muito macio; tenha cuidado ao raspar.
- Aplique uma gota (aproximadamente 50 μL) de adesivo e espalhe-a ao redor da área do crânio exposta usando seu aplicador. Exponha à luz UV por 40 s para definir o adesivo.
- Meça as coordenadas usando o bregma exposto como referência. Implante eletrodos bilateralmente na região ca1 do hipocampo [-3,5 mm Dorsal-Ventral (DV), ±2 mm Medial-Lateral (ML), -1,75 mm De profundidade (D)] e bilateralmente no córtex parietal [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] e um eletrodo de referência no cerebelo17. Use uma agulha de 32 G para criar um buraco na região marcada.
- Limpe o sangue da superfície do crânio. Eletrodos inferiores ligados ao conector do soquete feminino no cérebro com a ajuda do braço estereotaxic e fixação no lugar com acrílico dental. Implante o eletrodo no cérebro. O fone de ouvido do conector do soquete fica em cima do crânio colado por acrílico dentário.
- Injete cetoprofeno (5 mg/kg) subcutâneamente na região interescapular quando o eletrodo estiver fixo. Coloque os filhotes de volta com a mãe.
NOTA: Introduza metade da ninhada com o fone de ouvido de uma vez para a mãe em vez de apresentá-los um de cada vez. Isso evitará que a mãe prejudique o fone de ouvido do filhote.
3. Configuração e gravação do EEG (linha de base/pré-lesão)
- Após 24 horas de recuperação após a implantação do eletrodo, coloque cada animal em uma câmara plexiglas personalizada (37 °C) para gravação de EEG. Esta câmara também servirá como uma câmara de hipóxia.
- Conecte filhotes na câmara a um sistema de monitoramento por vídeo-EEG através de um cabo flexível (cabo op-amp personalizado).
NOTA: Com o fone de ouvido no lugar, os ratos são livremente móveis e não apresentam diferenças de comportamento. Uma vez fixados nos fios de eletrodo, os fios devem ser ajustados dentro da corda da câmara, a fim de fornecer a quantidade certa de folga para que o filhote possa se mover livremente por toda a câmara. - Digitalize os dados do EEG a 1000 Hz com ganho de 1K usando um amplificador de grama. Revise o sinal EEG (filtro de passagem de banda entre 3-70 Hz) mais tarde usando software (por exemplo, LabChart Pro).
- Regisso EEG pré-lesão por 30 minutos antes de desconectar animais para procedimento de ligadura da artéria carótida.
4. Ligamento da artéria carótida esquerda
- Anestesiar o filhote (pós-natal dia 10) com isoflurane de 4-5% em um capô de fluxo descendente e colocá-los em configuração especialmente organizada em uma almofada de banho de água. Posicione o supino animal e proteja os membros dianteiros com fita adesiva.
- Reduza o fluxo de isoflurane para 2-3%. Belisque a cauda para obter resposta à dor e monitore a respiração durante todo o procedimento.
- Esterilizar a área de incisão (entre a mandíbula e a clavícula) no lado esquerdo do pescoço com betadina e álcool (3 ciclos de iodo alternado e 70% de etanol).
- Faça uma incisão de aproximadamente 1 cm de comprimento no lado esquerdo do pescoço usando microscisores. Usando um microscópio dissecando, retraia cuidadosamente o tecido subcutâneo e a pele para expor a artéria carótida. Tome cuidado para identificar o nervo vago (correndo lateralmente para a artéria) e delicadamente separá-lo e retraí-lo da artéria.
- Rosqueie uma sutura de seda estéril de 5 cm de comprimento sob a artéria usando microforceps. Amarre uma sutura dupla ao redor da artéria para ocluir o fluxo.
- Corte o excesso de sutura e feche a artéria exposta puxando para trás o tecido subcutâneo e a pele. Use o vínculo veterinário para selar a incisão.
- Coloque o animal de volta no monitoramento contínuo do EEG em uma câmara em temperatura ambiente, que é colocada em um colchão aquecido. Faça verificações de temperatura infravermelha do núcleo do filhote para evitar abrir a câmara. Deixe o animal se recuperar por 1h antes da hipóxia.
5. EEG e hipóxia
- Monitore continuamente o FiO2 (fração de oxigênio inspirado) dentro da câmara através de um monitor de oxigênio.
- Lave a câmara com 60 L/min de 100% N2 e 0,415 L/min para 100% O2. Uma vez que a saturação de oxigênio na câmara atinja 12%, diminua o fluxo de N2 para 10 L/min, mantendo o fluxo de O2 inalterado. Com pequenos ajustes, mantenha o FiO2 em 8% por 45 min.
- Após 45 min de exposição à hipóxia, retorne fio2 a 21%.
- Que os filhotes se recuperem na câmara e monitorem no EEG por 2h pós-hipóxia.
- Após o término do período de gravação, desconecte os ratos da gravação do EEG e retorne à mãe.
6. Análise de EEG
- Analise o arquivo EEG com vídeo no LabChart Pro. Um pesquisador cego marca o EEG para convulsões e padrões de fundo17. As convulsões são definidas como um evento eletrográfico que dura mais de 10 segundos com descargas de ondas acentuadas rítmica de alta frequência (≥3x de base) com clara evolução17.
- Tenha uma segunda revisão de pesquisador cego marcado eventos aleatoriamente para concordância.
- Revise o vídeo associado para cada evento eletrográfico marcado e analise de acordo com o escore de convulsão comportamental do roedor neonatal16. Resumidamente, essa pontuação varia de 0-6 (imobilidade ao comportamento tônico-clonic grave). Para caracterizar ainda mais a semiologia convulsiva, analise o comportamento de lateralidade (movimentos multifoca/bilaterais versus focal/unilateral versus misto).
- Crie um espectrograma de energia. Use um Fast Fourier Transform com uma janela de dados Cosine-Bell com um tamanho de 1024 pontos de dados. Crie um eixo x liso no espectrograma com a ajuda de uma sobreposição de janela de 87,5%. Expresse a potência como μV218.
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Representative Results
Semiologia convulsiva
A exposição à hipóxia neonatal resulta em convulsões generalizadas e focais em camundongos (Figura 1A-C). Gravações de EEG de vídeo permitem que achados eletrográficos sejam correlacionados ao comportamento em vídeo. Esses comportamentos foram pontuados utilizando-se um escore de apreensão comportamental de roedores neonatais (BSS)16. Além da BSS, categorizamos eventos com base em se o comportamento foi focal/unilateral, bilateral ou misto (Figura 1B).
Neste modelo, os camundongos geralmente apresentavam 3 padrões de semiologia convulsiva: 1) repetitivo circulando ao lado da ligadura com extensão de extremidades contralaterais, 2) perda de postura com flexão corporal e cauda enrolada para lado de ligadura, ou 3) perda de postura com remando unilateral ou bilateral de extremidades (gravidade e comprimento variados). A maioria dos eventos observados envolveu comportamentos focais/unilaterais ou mistos (Figura 1B). Além disso, durante o período hipóxico, um subconjunto de camundongos apresentou atividade convulsiva não convulsiva, onde o filhote estava imóvel com atividade convulsiva sustentada no EEG (Figura 1C).
Gravações eletrográficas
A gravação do EEG foi iniciada 30 minutos antes da ligadura carótida, a fim de obter uma linha de base pré-lesão. A atividade da linha de base (Figura 1A e Figura 2A) foi semelhante ao fundo descrito anteriormente em filhotes de rato p1017. Após a ligadura, os filhotes foram imediatamente colocados de volta no vídeo EEG. Durante o período entre ligadura e início da hipóxia, um subconjunto de camundongos exibe convulsões convulsivas (Figura 1A-C).
Após a indução de hipóxia, a amplitude de fundo no EEG reduziu (Figura 3B) e apresentou intermitentemente rajadas de descargas de ondas de pico, seguidas pela supressão (Figura 2A). Os camundongos exibem convulsões eletrográficas, que emergem de um fundo suprimido como descargas rítmicas de ondas de pico e progresso para se tornarem mais complexas e frequentes, com ondas de polispique (Figura 2B). Durante a hipóxia, a análise do espectrograma de energia foi notável para assimemetrias entre o hemisfério isquêmico e contralateral (Figura 3A,B). O hemisfério isquêmico apresentou um padrão de supressão de explosão e o hemisfério contralateral exibiu fundo suprimido (Figura 1A e Figura 3A,B). Em média, as convulsões começam 5,5±8,1 minutos após a indução de hipóxia, com cada evento durando 56±57 segundos. Houve uma taxa de mortalidade de 13% durante a hipóxia (n=4/30), com todos os óbitos após convulsão (BSS=5-6).
Durante a reoxigenação e recuperação, um subconjunto de camundongos continua a ter convulsões durante o restante do período de gravação (2 h pós-hipóxia). O fundo EEG foi suprimido em comparação com a linha de base após a hipóxia (Figura 1A e Figura 3), com recuperação gradual durante o período de registro pós-hipóxia. Durante todo o período de gravação, os camundongos apresentaram, em média, 9±5 eventos de convulsão, cada um com duração de 54±57,7 s.
Figura 1: Características de convulsão em camundongos p10 expostos à hipoxia neonatal-isquemia. (A) Espectrograma de energia representativo do eletrodo do córtex parietal isquêmico através da linha do tempo experimental. (Escala de mapa de calor de amplitude x10-6). Setas indicam o tempo que os rastreamentos de eletroencefalograma bruto abaixo do espectrograma representam. (B) Comportamentos de convulsão durante todo o experimento, pós-disquemia/prehipoxia, durante a hipóxia e pós-hipóxia. (C) Pontuação de convulsão comportamental (BSS) e tempo para todos os eventos de convulsão (n = 30 ratos, cada rato tem um símbolo único, cada ponto é um evento de convulsão discreto). 100% dos camundongos apreendidos durante a hipóxia (caixa azul; tempo = −60 minutos é a conclusão da ligadura carótida, tempo=0 é o início da hipóxia). Treze por cento morreram durante a hipóxia após uma convulsão (grau 5-6). Este número foi modificado de Burnsed et al13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Padrões característicos de eletroencefalografia (EEG) durante a isquemia de hipóxia. (A) Fundo de EEG da esquerda para a direita: linha de base pré-lesão, supressão de explosão durante a hipóxia, supressão pós-hipóxia. Gravação do eletrodo de profundidade do córtex parietal ipsilateral. (B) Evolução de uma convulsão durante a hipóxia. Gravação do eletrodo de profundidade hipocampal ipsilateral. As caixas sombreadas (I-V) corresponderam a trechos de EEG expandidos à direita de (B). Este número foi modificado de Burnsed et al13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Assimemetrias em fundo EEG entre hemisférios isquêmicos e contralaterais. (A) Espectrograma de potência assimétrica em camundongos HI durante a hipóxia (período de 45 minutos) no córtex isquêmico (esquerda) e córtex contralateral (à direita; escala de amplitude x10-6). Padrão de supressão de explosão e convulsões no hemisfério isquêmico, supressão no hemisfério CL. (B) Supressão de fundo durante a hipóxia e reoxigenação nos hemisférios IL e CL. Todas as medidas de tensão média tiradas de trechos aleatórios de 10 segundos do encefalograma durante o período de tempo experimental (linha de base, 30 minutos de pós-casamento, durante a hipóxia — 15 minutos e 30 minutos após o início, após a reoxigenação — 15 minutos e 60 minutos após o início) foram comparadas à linha de base. A linha de base de cada animal serviu como seu próprio controle, e os dados são relatados como uma porcentagem da linha de base (n = 5 ratos). As medidas foram tomadas a partir de eletrodos corticais. Este número foi modificado de Burnsed et al13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresentamos um modelo para monitoramento contínuo de vídeo-EEG em camundongos neonatais durante convulsões hipoximic-isquêmicas. A análise de vídeo em conjunto com o EEG permite a caracterização da semiologia convulsiva. A análise do EEG permite a extração de espectrogramas de energia e análise de amplitude de fundo.
A colocação correta e cuidadosa de eletrodos é crucial neste protocolo, pois lesões durante a colocação de eletrodos ou colocação imprecisa podem afetar significativamente os resultados. A avaliação da atividade normal de EEG de base antes da lesão é primordial, pois sangramento ou lesão durante a colocação de eletrodos, embora raro, pode acontecer. Em segundo lugar, a fim de confirmar a colocação correta do eletrodo, os cérebros podem ser seccionados e examinados para trilhos de eletrodos na colocação adequada. Além disso, a não devolução de filhotes à mãe em grupos (individualmente) pode resultar em fones de ouvido eletrodos sendo danificados ou filhotes sendo mortos ou negligenciados pela mãe.
Uma limitação desse método é o limite de localização espacial de gravações de eletrodos de profundidade em um pequeno cérebro neonatal. Isso restringe a capacidade de localização de focos de apreensão específicos em gravações de EEG. Outra limitação nesse modelo de isquemia de hipóxia é a variabilidade da carga convulsiva. A variabilidade no tamanho da lesão e déficits comportamentais neste modelo de isquemia de hipóxia foi bem descrita anteriormente7,8,19. Não surpreende que essa variabilidade exista na carga convulsão (tanto duração de eventos de convulsão quanto número de eventos de apreensão). No entanto, consistentemente, 100% dos filhotes neste modelo apresentam convulsões durante a hipóxia. Por fim, a quantidade de tempo que os filhotes podem estar no monitoramento de EEG (longe da mãe) é limitada. Portanto, não podemos caracterizar convulsões contínuas com EEG contínuo em pontos posteriores relativos à lesão.
Embora tenhamos usado um modelo de apreensão de hipóxia-isquemia neste manuscrito, este método para monitoramento contínuo de vídeo-EEG em filhotes de camundongos neonatais poderia ser facilmente aplicado a outros modelos de doença/convulsão. As convulsões em roedores neonatais são difíceis de reconhecer com base apenas no comportamento, tornando importante o monitoramento por vídeo-EEG. Investigações futuras poderiam utilizar essas técnicas para analisar carga convulsão e semiologia em outros modelos de convulsão neonatal ou resposta a medidas terapêuticas e neuroprotetoras.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Reconhecemos as seguintes fontes de financiamento: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), University of Virginia School of Medicine (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SURGERY | |||
| Ball Point Applicator | Metrex Research | 8300-F | i-bond applicator |
| Cranioplast (Powder/Resin) | Coltene | H00383 | Perm Reline/Power |
| I-Bond | Kulzer GmbH, Germany | ||
| LOOK Silk Suture | Surgical Specialities Corporation | SP115 | LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture |
| RS-5168 Botvin Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5168 | Forcep for surgery/ligation |
| RS-5138 Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5138 | Forcep for surgery/ligation |
| UV light for I-Bond | Blast Lite By First Media | BL778 | UV ligth for I-bond |
| Vannas Microdissecting Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS5618 | Scissor for ligation |
| Vet Bond | 3M Vetbond | 1469SB | Vet Glue |
| HYPOXIA | |||
| Hypoxidial | Starr Life Science | ||
| Oxygen sensor | Medical Products | MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig | |
| EEG RECORDING | |||
| Female receptacle connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 832-10-024-10-001000 | Ordered from Digikey |
| Grass Amplifier | Natus Neurology Incorporated | Grass Product | |
| LabChart Pro | ADI Instruments | Software to run the system | |
| Male Socket Connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 833-43-024-20-001000 | Ordered from Digikey |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2274CD | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2272ACDR | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Stainless Steel wire | A-M Systems | 791400 | 0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft |
| Ultra-Flexible Wire | McMaster-Carr | 9564T1 | 36 Gauze wire of various color |
References
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