Dieser Artikel enthält Protokolle für die Konstruktion und Selbstmontage von Nanostrukturen aus gammamodifizierten Peptidnukleinsäure-Oligomeren in organischen Lösungsmittelmischungen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Selbstmontage von Gamma-modifizierten Peptid-Nukleinsäuren in komplexe Nanostrukturen in organischen Lösungsmittelmischungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Aktuelle Strategien in der DNA- und RNA-Nanotechnologie ermöglichen die Selbstmontage einer Vielzahl von Nukleinsäure-Nanostrukturen in wässrigen oder im Wesentlichen hydratisierten Medien. In diesem Artikel beschreiben wir detaillierte Protokolle, die den Aufbau von Nanofaserarchitekturen in organischen Lösungsmittelmischungen durch die Selbstmontage von eindeutig adressierbaren, einsträngigen, gammamodifizierten Peptidnukleinsäurefliesen ermöglichen. Jede einsträngige Fliese (SST) ist ein 12-Basis-PNA-Oligomer, der aus zwei verketteten modularen Domänen mit jeweils 6 Basen besteht. Jede Domäne kann sich an eine sich gegenseitig ergänzende Domäne binden, die auf benachbarten Strängen vorhanden ist, indem programmierte Komplementarität verwendet wird, um Nanofasern zu bilden, die bis zu Mikron en länge nausen können. Das SST-Motiv besteht aus insgesamt 9 Oligomeren, um die Bildung von 3-Helix-Nanofasern zu ermöglichen. Im Gegensatz zu analogen DNA-Nanostrukturen, die durchmessermonodisperse Strukturen bilden, bilden diese PNA-Systeme Nanofasern, die sich bei der Selbstmontage in organischen Lösungsmittelmischungen entlang ihrer Breite bündeln. Die hier beschriebenen Selbstmontageprotokolle enthalten daher auch ein herkömmliches Tensid, Natriumdodecylsulfat (SDS), um Bündelungseffekte zu reduzieren.
Einleitung
Erfolgreicher Aufbau zahlreicher komplexer Nanostrukturen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 in wässrigen oder im Wesentlichen hydratisierten Medien, die mit natürlich vorkommenden Nukleinsäuren wie DNA1,2,....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. PNA-Sequenzdesign
- Laden Sie die DNA Design Toolbox22 herunter, die vom Winfree Lab bei Caltech23 entwickelt wurde, in den Ordner mit Programmierskripten zum Entwerfen von Sequenzen.
- Öffnen Sie in diesem Sequenzentwurfsordner eine Programmiersprache der vierten Generation, die mit der Dateierweiterung ".m" kompatibel ist, und fügen Sie dann den zuvor heruntergeladenen Ordner "DNAdesign" mit dem folgenden Befehl zum Pfad hinzu:
>> Pfad Hinzufügen DNAdesign - Führen Sie anschließend das folgende Skript mit dem Namen "PNA3nanofiber.m" (siehe Ergänzende Abbildung 1) mit dem f....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die in den obigen Abschnitten besprochenen Protokolle beschreiben die Konstruktion eines angepassten SST-Motivs aus DNA-Nanofasern für die robuste Erzeugung selbstmontierter Nanofaserstrukturen unter Verwendung mehrerer, ausgeprägter PNA-Oligomere. In diesem Abschnitt wird die Interpretation der Daten beschrieben, die aus der erfolgreichen Wiedererstellung der beschriebenen Protokolle gewonnen wurden.
Nach dem in Abschnitt 5 beschriebenen Protokoll für die TIRF-Bildgebung von Proben von PNA-Ol.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Dieser Artikel konzentriert sich auf die Anpassung und Verbesserung bestehender Nukleinsäure-Nanotechnologieprotokolle an organische Lösungsmittelgemische. Die hier beschriebenen Methoden konzentrieren sich auf Modifikationen und Fehlerbehebung innerhalb eines definierten experimentellen Raumes ausgewählter polarer aprotischer organischer Lösungsmittel. Es gibt noch unerforschtes Potenzial für andere etablierte Nukleinsäure-Nanotechnologie-Protokolle, die in diesem Raum angepasst werden. Dies könnte potenzielle Anwendung.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise durch das Stipendium der National Science Foundation 1739308, das NSF CAREER-Stipendium 1944130 und das Air Force Office of Science Research Grant-Nummer FA9550-18-1-0199 unterstützt. "PNA-Sequenzen waren ein großzügiges Geschenk von Dr. Tumul Srivastava von Trucode Gene Repair, Inc. Wir danken Dr. Erik Winfree und Dr. Rizal Hariadi für ihre hilfreichen Gespräche zum DNA Design Toolbox MATLAB Code. Wir danken auch Joseph Suhan, Mara Sullivan und dem Center for Biological Imaging für ihre Unterstützung bei der Erfassung von TEM-Daten.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Γ PNA-Stränge/Oligomere | Trucode Gene Repair Inc. | Sektion 2.1 | |
| UV-Vis Spektralphotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Sektion 3.1.2 |
| Quarzküvetten | Starna | 29-Q-10 | Sektion 3.1.1 |
| Thermocycler | Bio Rad | C1000 touch | Sektion 4.1 |
| 0,2 mL PCR-Röhrchen | VWR | 53509-304 | Sektion 4.5 |
| Wasserfreies DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Sektion 4.6 |
| Wasserfreies DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Abschnitt 4.6 |
| Wasserfreies 1,4-Dioxan | Fisher Scientific | AC615121000 | Abschnitt 4.6 |
| 10X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | VWR | 75800-994 | Abschnitt 3.1.1 |
| Objektträger | VWR | 89085-399 | Abschnitt 5.2 |
| Deckgläser aus Glas | VWR | 48382-126 | Abschnitt 5.2 |
| 2%iges Kollodium in Amylacetat | Sigma-Aldrich | 9817 | Abschnitt 5.2 |
| Isoamylacetat | VWR | 200001-180 | Abschnitt 5.2 |
| Biotinyliertes Rinderserumalbumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Abschnitt 5.3 |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Abschnitt 5.4 |
| Streptavidin | sigma-aldrich | 189730 | Sektion 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Sektion 5.7 |
| Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop | Nikon | Nikon Ti2-E | Sektion 5.8 |
| Transmissionselektronenmikroskop | Joel | JEM 1011 | Sektion 6.6 |
| Pinzette | Dumont | 0203-N5AC-PO | Sektion 6.3 |
| Uranylacetat-Elektron | Mikroskopie Wissenschaften | 22400 | Abschnitt 6.1 |
| Formvar, 300 Mesh, Kupfergitter | Ted Pella Inc. | 1701-F | Abschnitt 6.2 |
| Formvar-Siliziummonoxid Typ A, 300 Mesh, Kupfergitter | Ted Pella Inc. | 1829 | Abschnitt 6.2 |
| DNA-Oligomere/-Stränge | IDT | Abschnitt 7.1 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | VWR | 97064-860 | Abschnitt 8.1 |
Referenzen
- Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
- Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
- Shih, W., Quispe, J., Joyce, G.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
