Quantifizierung der Aggregation unlöslicher Proteine in Caenorhabditis elegans während des Alterns mit einem neuartigen datenunabhängigen Akquisitions-Workflow

Zusammenfassung

Dieser neuartige Arbeitsablauf extrahiert und isoliert effizient SDS-unlösliche Proteine (Insolublom) aus Caenorhabditis elegans mit minimalem Ausgangsmaterial für die quantitative differentielle proteomische Analyse. Das Protokoll verwendet eine umfassende, datenunabhängige Erfassungs-Massenspektrometrie-Analyse zur Quantifizierung des Insolubloms und bioinformatische Analysen, um biologische Einblicke in Alterungsmechanismen und Pathologien zu gewinnen.

Zusammenfassung

Wir und andere haben gezeigt, dass der Alterungsprozess zu einer proteomweiten Akkumulation von unlöslichen Proteinen führt. Das Ausschalten von Genen, die für die unlöslichen Proteine kodieren, führt in über 40% der Fälle zu einer Verlängerung der Lebensdauer von C. elegans, was darauf hindeutet, dass viele dieser Proteine Schlüsseldeterminanten des Alterungsprozesses sind. Die Isolierung und quantitative Identifizierung dieser unlöslichen Proteine ist entscheidend, um wichtige biologische Prozesse zu verstehen, die während des Alterns ablaufen. Hier stellen wir ein modifiziertes und verbessertes Protokoll vor, das detailliert beschreibt, wie die SDS-unlöslichen Proteine (Insolublom) aus C. elegans effizienter extrahiert und isoliert werden können, um massenspektrometrische Arbeitsabläufe durch eine neuartige markierungsfreie quantitative Proteomik-Analyse zu rationalisieren. Dieses verbesserte Protokoll verwendet einen hocheffizienten Ultraschallator für die Wurmlyse, der die Effizienz der Proteinextraktion erheblich erhöht und es uns ermöglicht, deutlich weniger Ausgangsmaterial (ca. 3.000 Würmer) als in früheren Protokollen (typischerweise mit mindestens 40.000 Würmern) zu verwenden. Die anschließende quantitative Proteomanalyse des Insolubloms wurde unter Verwendung der datenabhängigen Erfassung (DDA) zur Proteinerkennung und -identifizierung und der datenunabhängigen Erfassung (DIA) für eine umfassende und genauere Proteinquantifizierung durchgeführt. Die bioinformatische Analyse quantifizierter Proteine liefert potenzielle Kandidaten, die mit anderen molekularen Methoden in C. elegans leicht nachverfolgt werden können. Mit diesem Workflow identifizieren wir routinemäßig mehr als 1000 Proteine und quantifizieren mehr als 500 Proteine. Dieses neue Protokoll ermöglicht ein effizientes Screening von Verbindungen mit C. elegans. Hier haben wir dieses verbesserte Protokoll validiert und auf den Wildtyp-C . elegans N2-Bristol-Stamm angewendet und bestätigt, dass N2-Würmer im Alter von Tag 10 eine größere Akkumulation des Insolubloms zeigten als junge Würmer am Tag 2.

Einleitung

Die Proteinhomöostase nimmt mit zunehmendem Alter zunehmend ab und führt zu einer erhöhten Proteinaggregation ^1,2,3. Die Proteinaggregation wird mit mehreren neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit, die Huntington-Krankheit und die amyotrophe Lateralsklerose⁴. Das Altern gilt als Hauptrisikofaktor für das Auftreten neurodegenerativer Erkrankungen, die mit der Proteinaggregation einhergehen. Proteine, die zur Bildung unlöslicher Aggregate neigen, sind oft mit zellulärer Toxizität und Gewebedysfunktion verbunden, was die Aggregation anderer Proteine weiter beschleunigen könnte ^5,6,7. Alternativ können unlösliche Proteinaggregate zelluläre Abwehrmechanismen aktivieren, um die toxischen oligomeren Formen des Proteins aus dem System zu entfernen. Das Ausschalten ausgewählter Gene, die für unlösliche Proteine kodieren, moduliert die Lebensdauer von Caenorhabditis elegans (C. elegans) sowohl im Rahmen altersbedingter Erkrankungen als auch im normalen Altern ^5,8,9. Daher ist die Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen der Proteinaggregation entscheidend für das Verständnis des Alterns und kann letztendlich zu Ansätzen zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen führen.

Der Fadenwurm C. elegans hat sich aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften wie einer relativ kurzen Lebensdauer (ca. 2 Wochen), einfacher Kultivierung und genetischer Manipulation zu einem der am häufigsten verwendeten Modellorganismen zur Untersuchung der Proteinaggregation bei Alterung und altersbedingten Krankheiten entwickelt.

Die Fähigkeit, unlösliche Proteine zu extrahieren und zu charakterisieren, spielte eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der altersbedingten Veränderungen, die mit der Proteinaggregation in C. elegans-Modellen verbunden sind. Um den Beitrag der Proteinaggregation zu normalen Alterungsprozessen zu untersuchen, haben wir⁵ und andere² zuvor das Insolublom von jungen und gealterten C. elegans extrahiert und proteolytisch verdaut, chemisch mit iTRAQ-Reagenzien markiert ("isobares Tagging für relative und absolute Quantifizierung") und dann mit MS-basierten Methoden quantifiziert. Unter Verwendung einer isobaren Markierungsmethode und 120 mg Feuchtwürmern (etwa 40.000 Würmer) konnten wir eine signifikante Protein-Insolublom-Tiefe und -Abdeckung gewinnen⁵. Die quantitative Analyse zeigte, dass 203 von 1200 identifizierten Proteinen im Insolublom von gealterten C. elegans im Vergleich zu ähnlichen Insolublomfraktionen von jungen Würmern signifikant angereichert waren⁵. Unabhängig davon verwendeten David et al. auch einen iTRAQ LC-MS/MS-Workflow, um Veränderungen in Proteinaggregaten mit normaler Alterung zu untersuchen². Beginnend mit etwa 300 mg Würmern identifizierten sie ~1000 unlösliche Proteine mit Hilfe von zwei biologischen Replikaten und stellten fest, dass ~700 von etwa 1000 Proteinen sich mit zunehmendem Alter im Vergleich zu jungen Würmern um das 1,5-fache oder mehr ansammelten². Insgesamt deuten diese unabhängigen Ergebnisse darauf hin, dass die weit verbreitete Unlöslichkeit und Aggregation von Proteinen ein inhärenter Bestandteil des normalen Alterns ist und sowohl die Lebensdauer als auch die Inzidenz neurodegenerativer Erkrankungen beeinflussen kann ^2,5.

Die Untersuchung des Insolobloms hatte es uns ermöglicht zu bestimmen, wie Umwelteinflüsse den Alterungsprozess beschleunigen oder verlangsamen können. Klang et al. etablierten markierungsfreie proteomische Arbeitsabläufe in C. elegans , um die Rolle der Metallostase bei der Langlebigkeit zu untersuchen¹⁰. In dieser Studie wurden mindestens 40.000 Würmer verwendet, um das Insolublom¹⁰ zu extrahieren. Die Daten zeigten, dass der Eisen-, Kupfer-, Kalzium- und Manganspiegel mit zunehmendem Alter ansteigt und dass die Fütterung von Würmern mit erhöhtem Eisengehalt die altersbedingte Akkumulation unlöslicher Proteine signifikant beschleunigte¹⁰. Unter Verwendung des gleichen Arbeitsablaufs zur Untersuchung der Auswirkungen von Vitamin D auf das Insolublom von C. elegans wurden 38 Proteine in jungen Würmern (Tag 2) und 721 Proteine in gealterten Würmern (Tag 8) quantifiziert. Die Vitamin-D-Fütterung reduzierte das Insolublom gealterter Würmer signifikant von 721 auf 371 Proteine¹¹. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Fütterung von Vitamin D die Unlöslichkeit von Proteinen mit zunehmendem Alter unterdrückte, die Proteinhomöostase förderte und die Lebensdauer von C.elegans N2-Wildtyp-Würmern verlängerte¹¹. Daher kann die Untersuchung des Insolubloms dazu beitragen, neue Modulatoren des Alterns und altersbedingter Krankheiten zu identifizieren.

Während die Untersuchung des Insolobloms von unschätzbarem Wert für das Verständnis des Alterungsprozesses war, wurde sie durch die Notwendigkeit behindert, große Mengen an Ausgangsprobenmaterial zu sammeln. Groh et al. haben kürzlich einen markierungsfreien proteomischen Quantifizierungs-Workflow eingeführt, um inhärente Veränderungen der Proteinaggregation in C. elegans mit zunehmendem Alter zu untersuchen; Es wurden jedoch große Mengen an Ausgangsmaterial (350 mg gemahlene Würmer) ^benötigt12. Im vorliegenden Bericht haben wir ein verbessertes neues Extraktions- und Isolationsprotokoll etabliert (Abbildung 1). Der Einsatz des hocheffizienten Ultraschallgeräts während der Wurmlyse verbesserte die Extraktionseffizienz erheblich und reduzierte in der Folge die benötigte Menge an Ausgangsmaterial von 40.000 auf 3.000 Würmer. Die Kombination dieses neuartigen Insolublom-Isolationsprotokolls mit einem markierungsfreien massenspektrometrischen Arbeitsablauf (Data-Independent Acquisition, DIA) verbesserte die Proteintiefe und -abdeckung erheblich. Das hier vorgestellte Protokoll ist kostengünstig und leicht zu modifizieren, um die Durchführung von Insolublomanalysen in anderen Modellsystemen zu ermöglichen.

Protokoll

HINWEIS: Für ein besseres Verständnis des experimentellen Verfahrens finden Sie in Abbildung 1 ein Schema des Arbeitsablaufs.

1. Massenkultur von synchronisiert alternden C. elegans

1. Vorbereitung der Platte
   1. Gießen Sie 30 mL NGM-Agar mit oder ohne 50 mM Fluordesoxyuridin (FUdR) in jede 90-mm-Platte und lassen Sie die Platten 2 Tage lang in Kulturhauben trocknen.
   2. Am Tag vor der Aussaat der NGM-Agarplatte wird ein 50-μl-Aliquot gefrorener Glycerinbrühe des OP50-Bakterienstamms in 1 l vorautoklaviertes LB-Medium in einem 2-l-Kolben inokuliert.
   3. Züchten Sie die Bakterien bei 37 °C in einem Schüttelbrutkasten bei 250 U/min für 16 h.
   4. Nach 16 h zentrifugieren Sie die Bakterienkulturen bei einer Geschwindigkeit von 5.000 x g für 10 min.
   5. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Bakterienpellet vollständig in 40 ml autoklavierter S-Basallösung (enthält 50 mM K₃PO₄, 100 mM NaCl in Wasser), um die 25x konzentrierte OP50 E. coli-Kultur zu erzeugen.
   6. Geben Sie 2 mL der 25x konzentrierten Bakterienkultur auf jede NGM-Agarplatte und verteilen Sie sie gleichmäßig, so dass die Bakterienkultur die gesamte Agaroberfläche bedeckt.
   7. Entfernen Sie die Deckel von den Platten in einer Bakterienkulturhaube für 2–3 Stunden, bis die Platten richtig getrocknet sind.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Bakterien gleichmäßig zu verteilen, indem Sie die Platten alle 15 Minuten schwenken. Dies ist wichtig, da Bakterien dazu neigen, sich auf einer Seite der Platte zu konzentrieren, was zu Regionen mit geringer Bakteriendichte führt.
   8. Nachdem die Platten getrocknet sind, schließen Sie die Deckel und lassen Sie die Platten 48 Stunden lang bei Raumtemperatur, um eine vollständige Trocknung der OP50 E. coli-Nahrungsquelle zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die Platten können 2 Wochen im Voraus vorbereitet und vor der Verwendung bei 4 °C gelagert werden.
2. Pflege und Vorbereitung synchronisierter Kohorten von C. elegans
   1. Um die erforderliche Zugabe von Proteinlysat (1,0–1,5 mg) für die Isolierung der SDS-unlöslichen Fraktion zu erhalten, verwenden Sie ca. 3.000 synchronisierte Würmer pro Probe.
   2. Übertragen Sie ~100 N2-Trächtige adulte Wildtyp-Würmer auf eine NGM 25x OP50 E. coli-Platte und halten Sie die Würmer ~72 h lang bei 20 °C, bis die Platte mit trächtigen adulten Würmern gefüllt ist.
   3. Pipettieren Sie ~10 mL S-Basallösung auf jede Platte und sammeln Sie alle Würmer in einem 15-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, während dieses und aller zukünftigen Schritte der Wurmsammlung Spitzen mit geringer Retention oder Pasteur-Pipetten zu verwenden, um den Verlust von Würmern durch Anhaften an den Spitzenoberflächen zu vermeiden.
   4. Die Probe 30 s lang bei 520 x g drehen. Entfernen Sie den Überstand nach dem Schleudern. Um OP50 E. coli zu eliminieren, fügen Sie dem Pellet 10 ml S-Basallösung hinzu und drehen Sie es erneut, gefolgt von der Entfernung des Überstands. Wiederholen Sie diesen Schritt.
   5. Geben Sie 10 ml Natriumhypochlorit-Bleichlösung (enthält 0,5 M KOH und 0,48 % Natriumhypochlorit in Wasser) in ein konisches 15-ml-Röhrchen zum Wurmpellet und wirbeln Sie es 2 Minuten lang bei Raumtemperatur kräftig auf.
   6. Bei 520 x g für 30 s bei Raumtemperatur zentrifugieren, um unvollständig aufgelöste Wurmkörper und Eier zu schleudern. Entfernen Sie dann den Überstand.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.5 und 1.2.6, um sicherzustellen, dass alle Wurmkörper vollständig entfernt und die Eier freigesetzt werden (sehen Sie das Röhrchen unter dem Mikroskop, um sicherzugehen).
   8. Waschen Sie das Eipellet mindestens 4 Mal mit 10 ml S-Basallösung, um eine vollständige Entfernung der Bleichlösung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die vollständige Entfernung von Bleichmittel ist wichtig, da verbleibende Bleiche das Schlüpfen der Eier behindern können.
   9. Die Eier werden in 5 ml S-Basalmedium in einem 15-ml-Röhrchen resuspendiert und 24 h lang bei 20 °C in den Rotor gestellt, damit die Eier schlüpfen können.
   10. Nach 24 h nehmen Sie 10 μl S-Basallarvenlösung, um die Anzahl der darin enthaltenen Würmer zu zählen. Verwenden Sie mindestens drei separate Aliquots von 10 μl S-basaler Larvenlösung zur Replikation der Wurmzahl. Berechnen Sie den Durchschnitt der drei Larvenkonzentrationen. Basierend auf der durchschnittlichen Konzentration verdünnen Sie die Wurmlösung, um ~3.000 Larven pro 200 μl Lösung zu erhalten.
       HINWEIS: Achten Sie darauf, das Röhrchen vorsichtig zu schütteln, indem Sie es umdrehen, da die Larven dazu neigen, sich abzusetzen, wenn sie ungestört bleiben, und dies die Larvenzahl beeinträchtigen kann.
   11. Gut mischen und 200 μl S-basale Larvenlösung auf jede der 90-mm-NGM-Platten geben, die mit Bakterien bestückt sind.
       HINWEIS: Geben Sie Tropfen S-basale Larvenlösung in die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung der Larven zu gewährleisten und eine bakterielle Erschöpfung an bestimmten Stellen zu vermeiden.
   12. Lassen Sie die S-Basallösung trocknen und legen Sie die Platten dann für 48 h umgedreht in einen 20 °C Inkubator.
   13. Nach 48 h werden die Würmer von der Platte in S-basaler Lösung aufgefangen und auf eine frische NGM-Platte mit 50 mM FUDR umgefüllt und bei 20 °C inkubiert.
       HINWEIS: Es ist wichtig, Würmer früh in der L4-Phase zu übertragen, um die Wirksamkeit von FUDR zu gewährleisten.
   14. Entnehmen Sie Proben von Tag 2 für junge Erwachsene nach 48 Stunden, indem Sie 10 ml S-Basallösung auf die Platte geben und die Lösung in ein 15-ml-Röhrchen überführen. Lassen Sie die Würmer sich durch die Schwerkraft absetzen und entfernen Sie die S-basale Lösung, nachdem sie klar geworden ist.
   15. Waschen Sie das Wurmpellet 2-3x in 5 mL S-Basallösung, um anhaftende Bakterien zu entfernen. Entfernen Sie so viel S-Basallösung wie möglich und frieren Sie das Wurmpellet (in 15-ml-Röhrchen) in einem Trockeneis-/Ethanolbad ein. Gefrorene Proben werden bei -80 °C gelagert.
   16. Übertragen Sie die Probenwürmer jeden zweiten Tag bis zum 10. Tag auf eine frische NGM OP50 E. coli-Platte , die FUDR enthält. Sammeln und einfrieren Sie Würmer, wie in den Schritten 1.2.14 und 1.2.15 beschrieben.
       HINWEIS: Beginnen Sie mit einer höheren Anzahl von Würmern für Proben am Tag 10, um einen eventuellen Verlust der Wurmzahl durch Übertragung und Graben zu berücksichtigen.

2. Extraktion der SDS-unlöslichen Fraktion aus Würmern

1. Tauen Sie das gefrorene Wurmpellet auf Eis in Gegenwart von 900 μl eiskaltem Wurmlysepuffercocktail auf, der 20 mM Trisbase, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂ und EDTA-freien Proteaseinhibitor enthält. Proben kurz vortexen, um eine vollständige Resuspension des Wurmpellets im Lysepuffer zu gewährleisten.
2. Legen Sie die 15-ml-Röhrchen in das Beschallungsbad und stellen Sie sie auf 10 Beschallungszyklen (30 s an und 30 s aus für jeden Zyklus) bei hoher Intensität ein. Wiederholen Sie dies für bis zu fünf Zyklen (stellen Sie sicher, dass die Würmer vollständig lysiert sind).
3. Schleudern Sie das Lysat bei 3.000 x g für 4 min im Kühlraum. Entsorgen Sie nach der Zentrifugation das Pellet mit den Wurmresten und geben Sie den Überstand vorsichtig in frische, vorgekühlte 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis.
4. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Assay. Lysat-Aliquots, die typischerweise etwa 1 mg Protein enthalten, werden in frische, vorgekühlte 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
5. Zentrifugieren Sie das Proteinlysat für 15 min bei 20.000 x g im Kühlraum.
6. Ohne das Pellet zu stören, den Überstand in ein frisches 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und als wässrig-lösliche Proteinfraktion aufbewahren.
7. Waschen Sie das Pellet aus dem vorherigen Schritt in 500 μl Wurmlysepuffer mit 1 % SDS bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie es bei 20.000 x g für 15 min bei Raumtemperatur. Den Überstand entfernen und als SDS-lösliche Fraktion aufbewahren. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal, um alle SDS-löslichen Fraktionen zu entfernen. Das verbleibende Pellet nach der dritten Waschrunde wird als 1 % SDS-unlösliche Proteinfraktion definiert.
8. Resuspendieren Sie das SDS-unlösliche Proteinpellet in 60 μl 70%iger Ameisensäure und wirbeln Sie kräftig vortexen, um die Proteine aufzulösen. Wiederholen Sie das kräftige Vortexen so oft wie nötig, um das Pellet aufzulösen.
9. Beschallen Sie das Pellet 30 Minuten lang in einem Ultraschall-Wasserbad bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Das unlösliche SDS-Pellet lässt sich in der Regel nur schwer im Puffer auflösen. Am Ende sollte jedoch das gesamte Pellet in diesem Schritt aufgelöst werden.
10. Trocknen Sie die Proben 1 h lang in einem Vakuumkonzentrator, um die Ameisensäurelösung vollständig zu entfernen.
11. Geben Sie 40 μL 1x LDS Probengelpuffer in das getrocknete Pellet und erhitzen Sie die Probe für 10 min auf 95 °C. Die Proben kurz vortexen und herunterschleudern. Laden Sie 13 μl auf ein 4-12% NUPAGE Bis-Tris-Gel und lassen Sie das Gel laufen. Färben Sie das Gel mit einem fluoreszierenden Proteinfleck für die Bildgebung. Bewahren Sie den Rest der Probe für die massenspektrometrische (MS) Analyse auf.
12. Laden Sie die verbleibende Probe in ein 4-12%iges Bis-Tris-Gel und lassen Sie es etwa 20 Minuten lang für den MS-In-Gel-Aufschluss laufen.

3. In-Gel-Verdau mit Trypsinprotease zur Isolierung von Proteinen für die MS-Analyse

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen (frisch) vor: 25 mM NH₄HCO₃ (pH 7–8), 25 mM NH₄HCO₃ in 50 % Acetonitril (ACN, pH 7–8) und 50 % ACN in 5 % Ameisensäure.
2. Würfeln Sie jede Gelscheibe in kleine Stücke (typischerweise <1 mm²) und geben Sie diese in silikonisierte 0,65-ml-Röhrchen.
3. Etwa 100 μl (oder ausreichend zum Abdecken) einer 25 mM NH₄HCO₃/50%igen ACN-Lösung zugeben und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur vortexen. Den Überstand extrahieren und in ein separates Röhrchen (zur Entsorgung umfüllen). Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Mal.
4. Trocknen Sie die Gelstücke vollständig in einem Vakuumkonzentrator (~20 min).
5. Bereiten Sie frische Lösungen vor und fügen Sie ~100 μl (oder ausreichend zum Abdecken) 10 mM DTT in 25 mM NH₄HCO₃ zu den getrockneten Gelstücken hinzu (verwenden Sie frisch zubereitetes NH₄HCO₃). Vortex und kurz drehen. Lassen Sie die Reaktion 1 h lang bei 56 °C und unter Schütteln bei 1400 U/min auf einem Mischer ablaufen.
6. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 100 μl 55 mM Iodacetamid (IAA) in 25 mM NH₄HCO₃ zu den Gelstücken. Vortex und kurz drehen. Lassen Sie die Reaktion 45 Minuten lang bei RT im Dunkeln ablaufen.
7. Den Überstand entfernen und entsorgen. Waschen Sie die Gelstücke, indem Sie ~100 μL 25mM NH₄HCO₃ hinzufügen und 10 Minuten lang vortexen. Schleudern Sie den Überstand kurz, entfernen Sie ihn und werfen Sie ihn weg.
8. Dehydrieren Sie die Gelstücke, indem Sie ~100 μl (oder genug zum Abdecken) von 25 mM NH₄HCO₃ in 50% ACN zu den Gelstücken hinzufügen und 10 Minuten lang vortexen. Dann kurz drehen, um den Überstand zu entfernen und zu entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei- oder sogar ein drittes Mal, wenn die Gelstücke nicht ganz trocken sind, was durch die kleinere Größe der Gelstücke und die trübe weiße Farbe angezeigt wird.
9. Trocknen Sie die Gelstücke vollständig in einem Vakuumkonzentrator (~20 min).
10. Geben Sie zunächst 15 μl Trypsinlösung (250 ng Trypsin) zu jeder Probe und fügen Sie dann genügend 25 mM NH₄HCO₃ hinzu, um die Gelstücke (~100 μl) zu bedecken. 10 Min. Vortexen. Anschließend kurz schleudern und bei 4 °C im Kühlraum 30 min ohne Mischen inkubieren.
11. Fügen Sie nach Bedarf 25 mM NH₄HCO₃ hinzu, um die Gelstücke vollständig zu bedecken. Schleudern und über Nacht bei 37 °C für 16–20 Stunden bei 1400 U/min auf einem Mixer inkubieren.
12. Am nächsten Tag die Verdauung kurz vortexen und schleudern. Fügen Sie etwa 100 μl Wasser in HPLC-Qualität hinzu, drehen Sie, parafilmen Sie das Röhrchen und beschallen Sie es kontinuierlich für 10 Minuten. Nach der Beschallung kurz drehen.
13. Die Aufschlusslösung, die die wässrige Extraktion darstellt, wird in ein sauberes silikonisiertes Röhrchen von 0,65 mL überführt.
14. ~100 μl 50 % ACN/5 % Ameisensäure zu den Gelstücken geben (genug, um sie zu bedecken), 10 Minuten bei Raumtemperatur vortexen, kurz drehen und die Lösung auffangen und einmal wiederholen. Alle Lösungen, die die extrahierten Peptide aus diesem Schritt und dem vorherigen Schritt 3.13 enthalten, werden in einem einzigen Röhrchen zusammengefasst.
15. Die extrahierten Aufschlüsse werden verströmt. Trocknen Sie die Peptide vollständig in einem Vakuumkonzentrator (~2 h).
16. Fügen Sie 30 μl 0,2%ige Ameisensäure hinzu, um die Peptide auf einem Mischer im Kühlraum für 10 Minuten zu resuspendieren.
17. Schleudern Sie die Proben bei 1850 x g bei Raumtemperatur für 5 min. Aspirieren Sie die Peptidlösung und geben Sie sie in ein neues, sauberes silikonisiertes 0,65-ml-Röhrchen. Entsalzen Sie dann die Peptidlösung mit C18-Entsalzungsspitzen (siehe unten).

4. Entsalzung verdauter Peptide mit der C18-Entsalzungsspitze

1. Stellen Sie die Pipette auf 10 μl ein und setzen Sie die C18-Entsalzungsspitze auf. Befeuchten Sie die Entsalzungsspitze, indem Sie 10 μl 100 % ACN pipettieren und dann verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
2. Waschen Sie die C18-Entsalzungsspitze, indem Sie 10 μl 50 % ACN, 49,8 % Wasser und 0,2 % FA pipettieren und dann entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
3. Äquilibrieren Sie die C18-Entsalzungsspitze, indem Sie 10 μl 0,2 % FA in Wasser pipettieren und dann verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.
4. Stellen Sie die Pipette auf 10 μl ein und laden Sie die Peptide aus der Lösung in das Harz, indem Sie die verdauten Peptide 15x auf und ab durch das Harz pipettieren.
   HINWEIS: Die wiederholte Einwirkung stellt sicher, dass alle Peptide an das Harz der Entsalzungsspitzen gebunden sind.
5. Entsalzen Sie die verdauten Peptide, die an das Harz gebunden sind, indem Sie 10 μl 0,2 % FA in Wasser pipettieren und dann verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt 4x, um den Entsalzungsschritt abzuschließen.
6. In einem neuen Röhrchen eluieren Sie die Peptide mit 10 μl 50 % ACN, 49,8 % Wasser und 0,2 % FA, indem Sie 10x auf und ab pipettieren. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, um den Proteinverdau ein zweites Mal im selben Röhrchen zu eluieren.
7. Trocknen Sie die entsalzten Peptide vollständig in einem Vakuumkonzentrator (~20 min).
8. Resuspendieren Sie Peptide in 15 μl von 0,2 % FA + 1 μl iRT (indexed Retention Time) Peptiden. Voxtex für 10 min, zentrifugieren bei 12.000 x g für 2 min und dann in ein Autosampler-Fläschchen für die MS-Analyse umfüllen (siehe unten).

5. Massenspektrometrische Analyse von verdauten Peptiden mittels DDA und DIA

HINWEIS: Proben können entweder mit DDA- oder DIA LC-MS/MS-Methoden analysiert werden. In dieser Studie wurden die Proben mit einem Nano-LC 2D HPLC-System analysiert, das mit einem hochauflösenden Massenspektrometer gekoppelt ist.

1. Verwenden Sie ein HPLC-System in Kombination mit einem chipbasierten HPLC-System, das direkt mit einem Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer verbunden ist (andere LC-MS-Konfigurationen und -Systeme können ebenfalls verwendet werden).
2. Analysieren Sie Proben mit Umkehrphasen-HPLC-ESI-MS/MS.
   1. Erstellen Sie das Chromatographieprotokoll, um die Peptidprobe auf einen C18-Vorsäulenchip zu laden. Waschen und entsalzen Sie die beladenen Peptide mit Ladelösungsmittel (0,1 % Ameisensäure) für 10 min bei einer Flussrate von 2 μL/min.
   2. Die Peptide werden auf einen C18-Chip der analytischen Säule übertragen und bei einer Flussrate von 300 nL/min mit einem 3-stündigen Gradienten unter Verwendung der mobilen Phase A (2 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure) und B (98 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure) eluiert. Der erste Elutionsschritt besteht aus einem linearen Gradienten von 5% B auf 35% B über einen Zeitraum von 80 min.
   3. Erhöhen Sie die mobile Phase B über 5 min auf 80 % und halten Sie dann die mobile Phase B 8 Minuten lang bei 80 %, bevor Sie auf 5 % B wechseln, um die Säule für 25 min wieder ins Gleichgewicht zu bringen.
3. Richten Sie eine MS-Instrumentenmethode für DDA ein und definieren Sie die Instrumentenparameter wie folgt.
   1. Verwenden Sie die folgenden Parameter für Experiment 1:MS1-Vorläufer-Ionen-Scan von m/z 400–1500 (Akkumulationszeit von 250 ms); Festlegen des Intensitätsschwellenwerts zum Auslösen von MS/MS-Scans für Ionen der Ladungszustände 2–5 bis 200 Zählungen; Legen Sie den dynamischen Ausschluss von Vorläuferionen auf 60 s fest.
   2. Verwenden Sie die folgenden Parameter für Experiment 2: MS/MS-Produktionenscans mit einem MS2-Scanbereich von m/z 100 bis 1500 (Akkumulationszeit von 100 ms pro jedem der 30 Produktionenscans pro Zyklus); Stellen Sie die Kollisionsenergieverteilung auf CES=5 ein und aktivieren Sie "Hochempfindlicher Produktionenscan-Modus".
      HINWEIS: Die DDA-Erfassungsmethode wird verwendet, um Spektralbibliotheken zu erstellen, wie in Schritt 6.3 beschrieben (siehe unten). Hier werden MS/MS-Spektren für die 30 am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen nach jedem MS1-Scan pro Zyklus erfasst. Die Gesamtzykluszeit beträgt ca. 3,3 s.
4. Rufen Sie DIA ab. Richten Sie eine MS-Instrumentenmethode für DIA ein, und definieren Sie die instrumentellen Parameter wie folgt.
   1. Für Experiment 1 sind folgende Parameter zu verwenden: MS1-Vorläufer-Ionenscan von m/z 400-1250 (Akkumulationszeit von 250 ms).
   2. Verwenden Sie die folgenden Parameter für Experiment 2: MS/MS-Produktionenscans für 64 variable SWATH-Segmente mit einem MS2-Scanbereich von m/z 100-1500 (Akkumulationszeit von 45 ms pro jedem der 64 Produktionenscans pro Zyklus); Stellen Sie die Kollisionsenergieverteilung auf CES=10 und aktivieren Sie das Häkchen bei "High Sensitivity Product Ion Scan Mode".
      HINWEIS: Verwenden Sie die von Schilling et ^al.13 beschriebene DIA/SWATH-Erfassungsmethode mit 64 Variablen, um eine markierungsfreie Quantifizierung mit einer Gesamtzykluszeit von etwa 3,2 s durchzuführen. Anstatt den Q1-Quadrupol zur Übertragung von Vorläuferionen eines engen Massenbereichs an die Kollisionszelle zu verwenden, wird für die DDA-Erfassung ein Bereich mit variabler Fensterbreite (z. B. m/z 5–90) verwendet, um den gesamten m/z-Bereich (m/z 400–1250) mit 64 SWATH-Segmenten und einer Akkumulationszeit von 45 ms für jedes Segment inkrementell zu überschreiten. Daraus ergibt sich eine Zykluszeit von 3,2 Sekunden, die einen MS1-Scan mit 250 ms Akkumulationszeit beinhaltet. Die variable Fensterbreite wird entsprechend der Komplexität des typischen MS1-Ionenstroms angepasst, der innerhalb eines bestimmten m/z-Bereichs unter Verwendung eines SCIEX-Algorithmus¹³ beobachtet wird (engere Fenster werden auf "beschäftigte" m/z-Bereiche angewendet, breitere Fenster werden auf m/z-Bereiche mit wenigen eluierenden Vorläuferionen angewendet). Auf anderen MS-Plattformen können auch alternative Strategien zur Auswahl von DIA-Fenstern implementiert werden.

6. Datenanalyse

HINWEIS: Bestimmte Einstellungen für die Datenanalyse sollten auf bestimmte Versuchsbedingungen zugeschnitten sein. Zum Beispiel hängt die ausgewählte Proteindatenbank (Fasta-Datei) von der Spezies ab, von der die Probe hergestellt wurde (in diesem Protokoll haben wir C. elegans verwendet).

1. Verwenden Sie eine MS-Datenbank-Suchmaschine , um DDA-Akquisitionen zu analysieren und Proteine zu identifizieren. Generieren Sie eine darabase-Suchmaschinenmethode wie folgt:
   1. Wählen Sie für Sample Description Parameters die Option Identification; Wählen Sie unter Probentyp die Option Iodessigsäure aus. Wählen Sie unter Cysteinalkylierung die Option Trypsin aus; Wählen Sie unter Aufschluss (unter der Annahme einer C-terminalen Spaltung an Lysin und Arginin) unter Instrument den Namen des Massenspektrometers aus; und wählen Sie unter Spezies die Option Caenorhabditis elegans aus.
   2. Für spezifische Verarbeitungsparameter siehe Biologische Modifikationen; Wählen Sie unter ID Focus SwissProt aus; Aktivieren Sie unter Datenbank die Option Gründliche ID. Wählen Sie unter Suchaufwand die Option 0,05 (10 %) unter Schwellenwert für erkanntes Protein aus. und aktivieren Sie unter Ergebnisqualität die Option Analyse der Falscherkennungsrate durchführen. Speichern Sie die Suchmaschinenmethode und senden Sie die MS-Rohdateien zur Verarbeitung mit der generierten Methode an die Datenbanksuchmaschine.
      HINWEIS: In einem iterativen Prozess wurden alle MS und MS/MS-Scans von der Suchmaschine auf der Grundlage der ersten Anmerkungen und Ergebnisse automatisch neu kalibriert.
2. Klicken Sie nach Abschluss der Suche auf Peptidzusammenfassung exportieren und filtern Sie alle Peptididentifikationsergebnisse nach dem Konfidenzschwellenwert von 99 in Excel (Falschentdeckungsrate (FDR) = 1%).
3. Erstellen Sie MS/MS-Spektralbibliotheken für die weitere Verarbeitung der DIA-Rohdatendatei und für die weitere Quantifizierung relativer Daten.
   1. Öffnen Sie die DIA Quantitative Analysis Software. Wählen Sie die Registerkarte "Bibliothek " aus, klicken Sie dann (unten auf der Seite) auf "Spektralbibliothek aus "Datenbanksuchmaschine" generieren und öffnen Sie einen "Datenbanksuchmaschine"-FDR-Bericht (die *FDR.xlsx-Tabellenkalkulationsdatei), der automatisch als Teil des Suchprozesses für die DDA-Rohdatendatei-Datenbank generiert wurde.
   2. Klicken Sie auf Weiter, wählen Sie das Schema für Bibliothekseinstellungen aus und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie Uniprot_Caenorhabditis elegans-_proteome als Datenbank aus und klicken Sie dann auf Fertig, die Spektralbibliothek wird generiert.
4. Verwenden Sie die DIA Quantitative Analysis Software , um DIA-Akquisitionen für eine umfassende relative Proteinquantifizierung zu analysieren. Die DIA-Datenanalyse-Pipeline wird wie folgt beschrieben.
   1. Um Peptide zu analysieren und zu quantifizieren, öffnen Sie die DIA Quantitative Analysis Software , um ein Analyseschema mithilfe des Vorlagenschemas einzurichten. Das Vorlagenschema ist in der Software verfügbar, indem Sie auf Einstellungen, dann auf DIA-Analyse und schließlich auf BGS-Werkseinstellungen klicken.
   2. Richten Sie die Parameter im Vorlagenschema wie folgt ein:
      1) Wählen Sie unter Identifizierung die Option PTM-Lokalisierung (Wahrscheinlichkeitsgrenzwert = 0,75).
      2) Wählen Sie unter Quantifizierung die Option Hauptgruppenmenge als Summenpeptidmenge aus, richten Sie Hauptgruppe N auf Max 7 und Min 1 ein, wählen Sie Nebengruppenmenge als Summenvorläufermenge und richten Sie Nebengruppe N auf Max 10 und Min 1 ein, wählen Sie Datenfilterung als Q-Wert dünnbesetzt und wählen Sie nicht Cross-Run-Normalisierung.
5. Führen Sie eine relative Quantifizierungsanalyse durch.
   1. Wählen Sie die Registerkarte Pipeline aus, klicken Sie auf DIA-Analyse aus Datei einrichten, öffnen Sie die gewünschten MS DIA-Rohdateien (z. B. Probe und Kontrolle), klicken Sie auf Spektralbibliothek zuweisen, wählen Sie die Bibliothek aus, die in Version 6.3 generiert wurde, klicken Sie auf Laden und klicken Sie schließlich auf Weiter.
   2. Wählen Sie das in Version 6.5.1 eingerichtete Analyseschema aus und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie die entsprechende Datenbank-Fasta-Datei (in diesem Protokoll: Uniprot_Caenorhabditis elegans_proteome) aus und klicken Sie auf Weiter. Definieren Sie die Bedingungseinrichtung, ordnen Sie die verschiedenen Bedingungen entsprechend den Stichproben zu und klicken Sie auf Weiter.
   3. Überprüfen Sie die Analyseübersicht (Zusammenfassung des Experimentaufbaus), navigieren Sie zum Ausgabeverzeichnis , und klicken Sie auf Fertig stellen. Klicken Sie abschließend auf Run Pipeline , um die kennzeichnungsfreie quantitative Analyse durchzuführen.
      HINWEIS: Statistische Module in der "DIA Quantitative Analysis Software" führen automatisch FDR-Analysen durch, generieren Heatmaps und Vulkandiagramme, die die verschiedenen Bedingungen vergleichen, erstellen Listen von identifizierten und quantifizierten Peptiden und Proteinen und liefern Q-Werte zusammen mit relativen Faltungsänderungen, die verschiedene Bedingungen vergleichen. Hier umfassten die Probenbedingungen Würmer am Tag 10 mit zwei biologischen Replikaten und junge Würmer am Tag 2 mit zwei biologischen Replikaten als Kontrolle.

Ergebnisse

Traditionelle Methoden der Wurmlyse haben verschiedene Nachteile. Zum Beispiel erzeugen sondenbasierte Ultraschall- und Bead-Beater-Methoden übermäßige Hitze, indem sie den direkten Kontakt der Metallspitze oder der Kügelchen mit den Proben ermöglichen, was zu variablen Proteinrückgewinnungen und Proteindenaturierung führt. Die Vermahlung von flüssigem Stickstoff mit anschließender Beschallung in einem Lysepuffer kann zeitaufwändig sein und erfordert eine große Anzahl von Würmern. Aufgrund der Einschränkungen traditioneller Wurmlysemethoden erfordern bisherige MS-Arbeitsabläufe, wie z. B. die Markierungsmethoden iTRAQ oder markierungsfreie Methoden, die in der Vergangenheit im C . elegans-Modellsystem verwendet wurden, um quantitative Informationen über das Insoloblom zu gewinnen, einen großen Einsatz von Ausgangsmaterial (mindestens 40.000 Würmer). Um diese Anzahl von Würmern zu erhalten, ist eine aufwendige Wurmzuchtarbeit erforderlich. Darüber hinaus erfordern die Kennzeichnungsmethoden teure isobare chemische Markierungen. Markierungsfreie Quantifizierungsmethoden sind kostengünstig und verfügen über einfachere und unkompliziertere Probenvorbereitungs- und Markierungsmethoden, erfordern jedoch eine signifikant große Anzahl von Würmern, um eine ausreichende MS-Analyseabdeckung zu erreichen.

Der von uns verwendete Ultraschallator erhöht die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Wurmlyse erheblich, indem er mehrere Wurmproben gleichzeitig in einem temperaturgesteuerten Wasserbad-Ultraschallgerät ohne Kreuzkontamination^{lysiert 14}, wodurch die Menge an benötigtem Ausgangswurmmaterial erheblich reduziert wird. Durch die Kombination der hocheffizienten Beschallungsmethode und des quantitativen DIA-markierungsfreien MS-Ansatzes konnten wir das Insolublom von gealterten und jungen Würmern anhand von ~3.000 Würmern robust quantifizieren. Hier haben wir die Wirksamkeit des Protokolls getestet und validiert und das Insolublom von gealterten und jungen Würmern mit einem Wildtyp-Wurmstamm, N2-Bristol C. elegans, verglichen. Wir wandten dieses Protokoll an, um das Insolublom von ~3.000 gealterten und jungen N2 C. elegans zu extrahieren und zu isolieren (zwei biologische Replikate für jede Bedingung), gefolgt von einer MS-Analyse mit einem Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer oder anderen MS-Systemen unter Verwendung einer Kombination aus datenabhängiger Erfassung (DDA) und datenunabhängiger Erfassung (DIA/SWATH) zur Proteinidentifizierung und -quantifizierung. Die unlöslichen Proteine wurden zunächst auf einem Bis-Tris-Gradientengel mit 4-12 % analysiert, um die Proteinmenge in jeder Insolublomprobe zu bestimmen. Wie in Abbildung 2 gezeigt, enthält die Insolublom-Probe von N2-gealterten Würmern (Spuren 2 und 3, biologische Replikatexperimente) signifikant mehr Protein als Proben von den N2-Jungwürmern (Spuren 1 und 4, biologische Replikatexperimente).

Nach dem In-Gel-Verdau wurden die Proteinprofile des Insolubloms mittels HPLC-MS analysiert. Mit diesem Workflow können wir in der Regel 1000–1500 Proteine identifizieren und 500–1.000 Proteine aus der SDS-unlöslichen Fraktion mit hoher Reproduzierbarkeit quantifizieren (unveröffentlichte Daten). Hier konnten wir 989 Proteine aus dem Insolublom von N2-Bristol C. elegans quantifizieren, indem wir die DIA-Daten analysierten und Redundanzen entfernten: 768 Proteine waren signifikant angereichert und 27 Proteine waren im Insolublom eines gealterten N2-Wurms (Tag 10) im Vergleich zu jungen (Tag 2) signifikant reduziert, wobei eine Faltungsänderung von mindestens 1,5 und ein Q-Wert von weniger als 0,01 verwendet wurde (Abbildung 3A). Wie im Histogrammdiagramm (Abbildung 3B) zu sehen ist, zeigt die Faltungsänderung signifikant veränderter Proteine eine Normalverteilung. Es wurde gezeigt, dass gealterte Würmer signifikant mit dem Insolublom angereichert waren: Die größte beobachtete Veränderung zeigte, dass die relative Proteinhäufigkeit im Insolublom bei alten Würmern 592-mal höher war als bei jungen Würmern; Und für 32 Proteine war die relative Proteinhäufigkeit im Insolublom bei den alten Würmern >250-mal höher als bei den jungen, was auf dramatische Veränderungen im Insolublom mit dem Alter hinweist.

Nach der Extraktion der Liste der unlöslichen Proteine, die in den gealterten Würmern signifikant erhöht sind und durch die Wurmbasis (WS271) identifiziert wurden, wurden eine Analyse des KEGG-Signalwegs und der Gene Ontology (GO) durchgeführt, um die Signalwege zu bestimmen, die im gealterten Insolublom angereichert sind, um biologische Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie diese mit dem Altern zusammenhängen. Die KEGG-Signalweganalyse der in dieser Studie identifizierten Proteine zeigt die Anreicherung mehrerer Signalwege, an denen Ribosomen, Mitochondrien, Proteasom und Spleißosom beteiligt sind (Abbildung 4A). Die genontologische Analyse zeigt, dass das Insolublom aus gealterten Würmern viele Proteine in bestimmten Kategorien umfasst, darunter mitochondriale, entwicklungsbezogene, Determinanten der adulten Lebensspanne und ribosomale Proteine (Abbildung 4B und ergänzende Tabelle 1A). Anschließend verglichen wir die Liste der in dieser Studie identifizierten Proteine mit zuvor veröffentlichten Arbeiten von David et ^al.2 und Mark et ^al.11 , wie in Venn-Diagrammen gezeigt (Abbildung 5A,5B). Der Vergleich zeigte eine signifikante Überlappung der identifizierten Proteine 394/721 und 444/721 mit der Studie von David et al. (Abbildung 5A) bzw. Mark et al. (Abbildung 5B). Die biologischen Signalwege, die durch die KEGG-Analyse von Insolublom aus dieser Studie aufgedeckt wurden, wurden in der Vergangenheit ebenfalls identifiziert, was unsere Methodik validiert (Ergänzende Tabelle 1B). Die Identifizierung dieser Signalwege und Proteine deutet darauf hin, dass sie als Kandidaten für weitere biologische Untersuchungen in Bezug auf ihre Funktion im Kontext des Alterns dienen könnten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Einsatz der effizienten Beschallungsmethode die gleichzeitige Lyse mehrerer Wurmproben in einer Umgebung mit gut kontrollierten Temperaturen und reduzierter Kreuzkontamination ermöglicht, um eine hohe Proteinabdeckung mit deutlich weniger Ausgangswurmmaterial zu erreichen. Die Kombination der effizienten Beschallungsmethode mit einem DIA-markierungsfreien Proteinquantifizierungs-Workflow hat zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse für die Quantifizierung unlöslicher Wurmproteine geliefert.

Abbildung 1. Experimenteller Ablauf des Protokolls. C. elegans wurden an verschiedenen Tagen kultiviert und gesammelt. Nach der Wurmlyse mit einem Ultraschallgerät wurde die 1%ige SDS-unlösliche Proteinfraktion (Insolublom) extrahiert und aus dem Lysat isoliert. Das Insolublom wurde dann über einen In-Gel-Trypsin-Verdau verdaut und mittels DIA-Massenspektrometrie quantifiziert, gefolgt von einer bioinformatischen Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. SDS-PAGE Gel aus dem Insoloblom isolierte junge versus alte Würmer des N2-Bristol-Stammes. Die Insolublome von jungen und alten Würmern des N2-Bristol-Stammes wurden mittels SDS-PAGE analysiert, um die Menge des vorhandenen Proteins zu bestimmen. Das SDS-PAGE-Gel wurde mit einer fluoreszierenden Proteinfärbung gefärbt, um Proteinbanden sichtbar zu machen. Lanes 1 und 4: Insolublome aus zwei biologischen Replikationsexperimenten mit jungen N2-Würmern (Tag 2). Lanes 2 und 3: Insolublom aus zwei biologischen Replikatexperimenten mit gealterten N2-Würmern (Tag 10). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. Proteinkandidaten, die eine signifikante Veränderung des alten und des jungen Insolubloms und ihrer Faltungsänderungsverteilungen zeigten. (A) Vulkandiagramm zur Quantifizierung des Insolubloms von gealterten und jungen N2-Bristol-Würmern. Kandidaten mit einer absoluten Fold-Änderung >=1,5 und einem Q-Wert <0,01 werden als rote Punkte dargestellt. (B) Histogrammdiagramm für die Faltungsänderungsverteilung von signifikant angereicherten SDS-unlöslichen Proteinen in gealterten und jungen Wurmproben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4. Analyse des KEGG-Signalwegs und der Genontologie (GO). (A) KEGG-Signalweganalyse des Tages-10-Insolubloms, geordnet nach p-Wert, wobei oben ein hochsignifikanter Signalweg dargestellt ist. (B) Die Analyse der Genontologie zeigt, dass das Insolublom gealterter Würmer für viele Proteine in bestimmten Kategorien angereichert ist, einschließlich mitochondrialer Proteine, Entwicklungsproteine, Determinanten der adulten Lebensspanne und ribosomale Proteine. Die Scatterplot-Ansicht visualisiert die GO-Terme in einem "semantischen Raum", in dem die ähnlicheren Terme näher beieinander positioniert sind. Die Farbe der Blase spiegelt den p-Wert wider, der in der STRING-Analyse erhalten wurde, während ihre Größe die Allgemeingültigkeit des GO-Begriffs in der UniProt-GOA-Datenbank widerspiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5. Insolublom-Proteinüberlappung in Insolublom am Tag 10 im Vergleich dieser Studie mit (A) David et ^al.2 und (B) Mark et ^al.11 Studien identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Tabelle 1 (bezogen auf Abbildung 4 und Abbildung 5). (A) Genontologie (biologischer Prozess) analysiert mit der STRING-Datenbank. (B) Detaillierte Liste der in dieser Studie identifizierten Proteine und KEGG-Signalwege mit Farbcodes, die ihre Überlappung mit der veröffentlichten Arbeit darstellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In diesem Protokoll berichten wir über eine verbesserte Probenvorbereitungsmethode für die Extraktion von unlöslichen Proteinen aus C. elegans. Durch den Ersatz der traditionellen Wurmlyse (z. B. Sondenbeschallung oder Bead-Beater-Techniken) durch den effizienten Ultraschallator konnten wir die Ausbeute der Extraktion unlöslicher Proteine erhöhen und die Anzahl der Würmer, die für die markierungsfreie MS-Analyse benötigt werden, von 40.000 Würmern auf 3.000 Würmer reduzieren. Eine Datenbanksuchmaschine wurde für die Proteinidentifizierung aus DDA-Daten verwendet und die C. elegans-Spektralbibliothek wurde unter Verwendung der "DIA Quantitative Analysis Software" und der entsprechenden DDA-Datenbanksuchergebnisse (Import von FDR-Dateiberichten, die von der Datenbanksuchmaschine generiert wurden) erstellt. Die relative Quantifizierung von älteren und jungen C. elegans insolublome Daten wurde mit der 'DIA Quantitative Analysis Software' durchgeführt, um den neuartigen DIA-Datensatz und die generierte Spektralbibliothek zu verarbeiten.

Mehrere Schritte sind im Protokoll entscheidend. Die kurze Lebensdauer von C. elegans macht es im Vergleich zu anderen Eukaryoten wie Säugetierzellen zu einem idealen System zur Untersuchung des Alterns, aber es ist entscheidend, eine homogene Population von Würmern zu isolieren, wenn es um die Untersuchung altersbedingter Phänomene geht. FUDR wurde in diesem Protokoll verwendet, um synchronisierte alternde Würmer zu erhalten. Es ist wichtig, die Würmer früh in ihrem L4-Stadium auf die NGM-besiedelte Platte mit FUDR zu übertragen, um deren Wirksamkeit zu gewährleisten. Bei der Wurmlyse mit dem effizienten Ultraschallgerät muss die Temperatur im Wasserbad auf 4 °C und die Beschallung auf 30 s EIN und 30 s AUS eingestellt werden, um eine Überhitzung der Proben zu vermeiden. Nach der ersten Beschallungsrunde für 10 Zyklen (10 Minuten) ist es wichtig, unter dem Mikroskop zu überprüfen, ob alle Würmer effizient lysiert wurden. Wenn nicht, sind weitere Beschallungszyklen erforderlich. Während des In-Gel-Aufschlusses muss jede Gelscheibe in Stücke der richtigen Größe (<1 mm²) gewürfelt werden – wenn sie zu klein sind, können sie bei der Probenvorbereitung verloren gehen, und wenn sie zu groß sind, kann der Aufschluss unzureichend sein.

Der Bedarf an deutlich weniger Ausgangsmaterial reduziert den aufwändigen Aufwand für die Wurmkultur zur Gewinnung von Proben für die Insolubolom-Analyse erheblich. Die Extraktion und Isolierung der 1%igen SDS-unlöslichen Proteinfraktion erfordert jedoch mehrere Waschschritte, und eine sorgfältige Probenhandhabung ist erforderlich, um Probenverluste zu vermeiden und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Die Menge des für die MS-Analyse erzeugten Materials reicht für ~3 Injektionen für die nachfolgende DDA- und DIA-Analyse aus, aber nicht, um sie für zukünftige Experimente aufzusparen. Darüber hinaus haben wir trotz seiner potenziell verwirrenden Wirkung¹⁵ die niedrigstmögliche Konzentration von FUdR verwendet, um Würmer während des Alterungsprozesses zu sterilisieren. Zukünftige Studien könnten die Verwendung von FUdR umgehen, indem sterile Mutanten verwendet oder Würmer manuell übertragen und gesammelt werden.

Die Verwendung des hocheffizienten Ultraschallgeräts für die Wurmlyse ermöglicht eine effiziente Extraktion des Insolubloms, was eine gute Proteinabdeckung und eine kostengünstige markierungsfreie DIA-MS-Analyse zur Quantifizierung des Insolubloms mit einer stark reduzierten Anzahl von Würmern ermöglicht. Es reduziert den Arbeitsaufwand erheblich und ermöglicht das Screening auf mehr Bedingungen pro Experiment. Darüber hinaus ist der markierungsfreie MS DIA-Workflow kostengünstig und bietet eine Proteintiefe und -abdeckung auf einem vergleichbaren Niveau wie Markierungsmethoden wie iTRAQ, TMT oder SILAC. Das C. elegans-Modell ist ein schnelles Screening-System für die Alternsforschung. Der Arbeitsablauf kann leicht modifiziert und angewendet werden, um das Altern und die altersbedingte Krankheitsforschung in diesem und anderen Organismen zu untersuchen. In laufenden Studien wenden wir diesen Arbeitsablauf beispielsweise an, um Proteinprofile von Insolublom und Proteostase in verschiedenen C. elegans-Modellen der Alzheimer-Krankheit (AD) zu untersuchen, einschließlich Abeta-, Tau- und dualen Abeta/Tau-Würmern mit oder ohne unterschiedliche medikamentöse Interventionen für zukünftige Hochdurchsatz-Wirkstoffscreenings.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Verwendete Stämme
Esherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
N2 (Bristol)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Puffer/Lösung
NGM (Nematoden-Wachstumsmedien)			Rezept: 3  g/L NaCl, 23 μl; g/L Agar; 2.5  g/L Pepton; 1&dünnsp; mM CaCl2, 5  mg/L Cholesterin, 1 μl; mM MgSO4, 25  mM KH2PO4
S-Basallösung			Rezept: 5,85 g/L NaCl, 1g/L K2HPO4, 6 g/L KH2PO4, H2O auf 1 L
Natriumhypochlorit-Bleichlösung			Rezept: Mischen Sie 0,5 mL 5 N NaOH mit 1 ml Natriumhypochlorit (5%) und erhöhen Sie das Volumen mit H20 auf 5 mL.
Material/ Ausrüstung
Agar	Difco Granulierter Agar, BD Biosciences	90000-782
Bioruptor Plus Beschallungsgerät	Diagenode, USA	B01020001
Cholesterin	Sigma	c8503
2'-Desoxy-5-fluorouridin	VWR	TCD2235
Glycerin	Millipore Sigma	356350-1000ML
LB Brühe, Miller	Millipore Sigma	60801-450
Natriumdodecylsulfat (SDS?	Sigma	L4509-250G
Natriumchlorid	Sigma	59888
M880 Ultraschallbad, 117 V, fasst 5,5 Gallonen	VWR, USA	89375-458
Magnesiumsulfat	Sigma	M506
Magnesiumchlorid	Sigma	208337
NGM Agarplatte	VWR Einweg-Petrischalen	25384-342
NuPAGE LDS Probenpuffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007
NuPAGE Proteingele, 4-12%	Invitrogen	NP 0335BOX
Protease inhibiotr cocktail (PIC)	Roche	11836170001
Pierce BCA Assay	Thermo Fisher Scientific	23225
Natriumhypochlorit 5%	VWR	JT9416-1
SYPRO Ruby Protein Gel Stain	Thermo Fisher Scientific	S12000
MS Section
Acetonitril, Burdick and Jackson LC-MS	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	36XL66
Agilent Zorbax 300Extend C18 Säule	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	770995-902
Ammonium Bicarbonat	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	9830 (1 kg)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9779-5G
Eppendorf Thermomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland	T1317-1EA
Ameisensäure	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507-500ML
Indexierte Retentionszeit (iRT) Normalisierungspeptid Standard	Biognosys AG, Schlieren, Zürich, Schweiz	Ki-3002-2
Iodacetamid (IAA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA	I1149-25G
Methanol, HPLC Grade	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	34885
Nano cHiPLC Trap ChromXP C18-CL, 200 um x 6 mm, 3 um, 120A. (Vorsäulenchip) (200 um x 6 mm ChromXP C18-CL Chip, 3 um, 300 A)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00006
Nano cHiPLC ChromXP 75 μm x 15cm, C18-CL, 3 μm, 120 A (analytischer Säulenchip)	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	804-00001
Orthoganol Quadrupol Time-of-Flight (QqTOF) TripleTOP 6600 Massenspektrometer	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	Pro Angebot
ProteinPilot 5.0	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	software download Sciex
Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	SPD131DDA-115
Sequenzierqualität lyophilisiertes Trypsin	Life Technologies	23225
Spectronaut	Biognosys AG, Schlieren, Zürich, Schweiz	SW-3001
SWATH 2.0 Plugin in PeakView 2.2	Sciex LLC, Framingham, MA, USA	Software-Download Sciex
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC System	Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA	Modell # 845
Wasser, Burdick und Jackson LC-MS	Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA	600-30-76
Waters 1525 binäres HPLC-Pumpensystem	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters 2487 Dual Wavelength UV-Detektor	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT081110
Waters 717plus Autosampler	Waters Corp., Milford, MA, USA	WAT022939
Waters Fraction Collector III	Waters Corp., Milford, MA, USA	186001878