Wir beschreiben ein Protokoll für die Lasermikrodissektion von Untersegmenten der menschlichen Niere, einschließlich des Glomerulus, proximalen Tubuli, dick aufsteigender Gliedmaße, Sammelkanal und Interstitium. Die RNA wird dann aus den erhaltenen Kompartimenten isoliert und die RNA-Sequenzierung wird durchgeführt, um Veränderungen in der transkriptomischen Signatur innerhalb jedes Teilsegments zu bestimmen.
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Methodenartikel
Anwendung der Laser-Mikrodissektion zur Aufdeckung der regionalen Transkriptomik im menschlichen Nierengewebe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Genexpressionsanalyse des menschlichen Nierengewebes ist ein wichtiges Werkzeug, um Homöostase und Krankheitspathophysiologie zu verstehen. Es ist notwendig, die Auflösung und Tiefe dieser Technologie zu erhöhen und sie auf die Ebene der Zellen im Gewebe auszudehnen. Obwohl die Verwendung von einzelnuklearen und einzelzelligen RNA-Sequenzierungen weit verbreitet ist, behalten die Expressionssignaturen von Zellen, die aus der Gewebedissoziation gewonnen werden, keinen räumlichen Kontext bei. Lasermikrodissektion (LMD) auf Basis spezifischer fluoreszierender Marker würde die Isolierung spezifischer Strukturen und Zellgruppen von Interesse mit bekannter Lokalisierung ermöglichen und so den Erwerb von räumlich verankerten transkriptomischen Signaturen im Nierengewebe ermöglichen. Wir haben eine LMD-Methodik optimiert, die von einem schnellen fluoreszenzbasierten Fleck geleitet wird, um fünf verschiedene Kompartimente innerhalb der menschlichen Niere zu isolieren und anschließende RNA-Sequenzierungen von wertvollen menschlichen Nierengewebeproben durchzuführen. Wir stellen auch Qualitätskontrollparameter vor, um die Angemessenheit der gesammelten Proben beurteilen zu können. Der in diesem Manuskript beschriebene Workflow zeigt die Durchführbarkeit dieses Ansatzes, subsegmentale transkriptomische Signaturen mit hoher Sicherheit zu isolieren. Der hier vorgestellte methodische Ansatz kann auch auf andere Gewebetypen mit Substitution relevanter Antikörpermarker angewendet werden.
Einleitung
Technologische Fortschritte bei der Untersuchung von Gewebeproben haben das Verständnis des Gesundheitszustands und der Krankheit in verschiedenen Organen verbessert. Solche Fortschritte haben unterstrichen, dass Pathologie in begrenzten Regionen oder in bestimmten Zelltypen beginnen kann, aber wichtige Auswirkungen auf das gesamte Organ hat. Daher ist es im gegenwärtigen Alter der personalisierten Medizin wichtig, die Biologie sowohl auf Zell- als auch auf regionaler Ebene zu verstehen und nicht nur weltweit1. Dies gilt insbesondere für die Niere, die aus verschiedenen spezialisierten Zellen und Strukturen besteht, die differenziell pathologis....
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Protokoll
Die Studie wurde vom Institutional Review Board (IRB) der Indiana University genehmigt.
HINWEIS: Verwenden Sie dieses Protokoll mit Nierennephrektomiegewebe (bis zu 2 cm in der X- und Y-Dimension), das in der Verbindung optimale Schnitttemperatur (OCT) konserviert und bei -80 °C gelagert wird. Führen Sie alle Arbeiten in einer Weise durch, die die RNA-Kontamination begrenzt, verwenden Sie saubere Einweghandschuhe und eine Gesichtsmaske. Sorgen Sie für die Sauberkeit aller Oberflächen. Die Ausrüstung, für die dieses Protokoll optimiert wurde, ist ein Laser-Mikrodissektionssystem mit gepulsten UV-Laser.
1. Kryosekti....
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Ergebnisse
Proben
Wir präsentieren Daten von neun Referenznephrektomien (3 Proben, die an der Indiana University gewonnen wurden, und 6 Proben, die durch das Kidney Precision Medicine Project gewonnen wurden), wobei das schnelle Fluoreszenz-Färbeprotokoll verwendet wird, um Nierennephronsegmente und interstitielle Bereiche zu isolieren. Die in diesem Prozess verwendeten Abschnitte wurden von verstorbenen Nierenspendern oder nicht betroffenen Tumornephrectomien gewonnen. Diese Proben hatt.......
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Diskussion
LMD-basierte Transkriptomik ist eine nützliche Technologie, die die Genexpression an bestimmten Bereichen im Gewebe verankert. Die Basis dieser Technologie und ihre mögliche Anwendung in der Niere wurde zuvor beschrieben8. Die Optimierung, Modernisierung und Rationalisierung der fluoreszenzbasierten Dissektion, die speziell auf eine hochpräzise Sesektion für die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung ausgerichtet ist, ist jedoch weniger allgegenwärtig. Da diese Methode räumlich im Gewebe begründet ist,.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Allgemeines: Die Autoren danken den Forschern des Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) für ihre gnädige Unterstützung und Beratung.
Finanzierung: Unterstützung für diese Arbeit wurde vom NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.) bereitgestellt; NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Die in diesem Manuskript berichtete Forschung wurde vom National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), unter der Auszeichnungsnummer U2CDK114886 unterstützt.
Daten- und Materialverfü....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Aceton | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Trockenmittelkartusche | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD-Puffer ist im Paket |
| enthalten Laser-Mikrodissektionsmikroskop | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antikörper | Abcam | ab76969 | Direkt konjugiert mit Alexa Fluor 568 |
| Mikrozentrifugenröhrchen | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Mikroskopkamera | Leica | DFC700T | |
| PBS ( RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-Membran-Objektträger | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 & micro; g | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq oder NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | ||
| Tamm-Horsfall-Protein-Antikörper | R& D Systems | AF5144 | Direkt konjugiert mit Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
Referenzen
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analy....
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Nachdrucke und Genehmigungen
