Summary
此协议提出了一种方法，以执行粘液的流变特征，居住在银鲤的刺rakers （GRs） 上。通过测量粘度、储存和损失模组获得的 GR 粘液的粘度弹性特性，用于评估表观产量应力，以了解 GRs 中的滤送机制。
Abstract
银鲤鱼， 假发性毛利特里克斯，是一种侵入性的浮游生物过滤器喂食鱼，由于其高效的过滤喂养机制，侵扰了密西西比河上游流域的天然水道。在许多此类过滤器中发现称为刺拉克（GRs）的特征器官，有助于有效过滤大小只有几微米的食物颗粒，如浮游植物。
研究GR粘液的流变学的动机源于我们渴望了解它在帮助银鲤鱼过滤喂养过程中的作用。富含粘液的液体，在"厚和粘性"状态可能促进食物颗粒的粘附。通过 GR 膜的渗透和运输由外部剪切力作用促进，这些切变率会变化。因此，粘液流变学可以为过滤鱼池中银鲤的巨大超能力提供重要线索。在此基础上，GR粘液可以为食物颗粒提供粘合功能，并作为运输工具协助过滤器喂养过程。
该协议的主要目标是确定粘液的产量应力，归因于启动流所需的最小剪切应力，在结构粘胶材料上首先观察不可逆的塑料变形。因此，GR粘液的流变特性，即粘度、储存和损失模组，使用旋转测温仪对其非牛顿、剪薄性质进行了调查。
这里提出的一个协议被用来分析从银鲤鱼的刺车中提取的粘液的流变特性，在密苏里河的哈特克里克位置捕鱼。该协议旨在制定一个有效的策略，用于风湿学测试和粘液的材料特征，假定是一种结构化粘性材料。
Introduction
银鲤鱼，假体，是浮游生物过滤器，是一种侵入性物种，已经渗透到美国的几个天然水道。该物种最初是在密西西比河上游流域引进的，以控制藻类开花1、2、3。银鲤是一种非常高效的喂食器。通常，其消耗性食物颗粒大小从4到20μm到更大的浮游动物，大约是80μm 3，4，5。该物种已经超过其他本地鱼类，并可能造成巨大的损害，本地水道限制可用资源1，2，6。因此，过滤喂养鱼类，如银鲤鱼和大头鲤鱼对五大湖1，2，6，7，8构成重大威胁。
过滤器喂养鱼具有特殊的器官称为刺rakers（GRs），其表面有一层薄薄的粘液。这些器官可提高从传入的液体中过滤和聚合小颗粒的效率。此处提出的协议的目标是描述非牛顿、剪薄材料特性和从银鲤刺拉克尔内部表面获得的 GR 粘液的产生应力。使用旋转流变计确定的GR粘液的产量应力值对本研究很感兴趣。测得的产量应力又称"表观产量应激"，取决于稳定剪切率或动态振荡应变型9、10等测试方法。剪切变薄的"产应力流体"在关键的应用应力9、11中经历了从固体状到液体状行为的过渡。明显的产量应力是启动流所需的最小剪切应力，或者当粘液从凝胶状材料过渡到液体状材料时，首先观察到不可逆的塑料变形。这种行为可以在结构粘性材料中观察到。GR 粘液从凝胶状行为过渡到液体状行为需要两个功能，即收集食物颗粒物的粘合作用和运输车辆的作用，以协助颗粒物的输送和过滤过程。粘液的扩展功能包括在抗病和呼吸方面创造扩散屏障，提供营养因子、有毒成分和排泄物的可控释放，为喂养和筑巢创造代谢途径，帮助保护捕食者，以及产生边界层的改变，提高运动和推进效率12，13，14。
与简单的流体不同，粘液等复杂流体具有随流条件变化的特性，需要额外的测量参数来定义其体积尺度物理行为。为了监测 GR 粘液的粘度和产量应力，使用旋转流变计进行流变测量。旋转测流仪通过与流体样品接触的旋转盘施加稳定或振荡的剪切应力或应变，并测量其反应。使用这种仪器和技术的理由是，测流仪可以提供一组测量来描述银鲤的GR粘液的物质特性，而这种物质特性不能仅靠粘度来定义。
粘液是一种粘性材料，它对强加变形的机械反应是纯固体（由胡克的弹性定律控制）和纯液体（受牛顿粘度定律控制）之间的。粘液中包含的复杂大分子网络可以根据外部力或变形进行拉伸和重新定位。旋转测流仪由圆锥形几何和 Peltier 板组成，如图1和图 2中所示（参见仪表规格表 1）。这项研究的目的是制定一个协议，以确定GR粘液的流变特性。旋转测流仪比粘度计的优点是它能够使用较小的样品量进行动态测量。本研究中的 GR 粘液样本量约为 1.4 mL。另一方面，粘度计仅限于恒定的剪切速率，需要大量的样品量。
粘液的流变特性在银鲤解剖学中预计会有很大的不同。例如，居住在 GR 表面的粘液的特性可能与表皮器官不同。为了说明鱼不同区域粘液特性的潜在变异性，对获得的GR粘液样品进行了稀释，并利用旋转测血仪创建并测试了三种浓度的溶液。执行协议后报告的粘液流变学数据和结果证明了测量技术的有效性。本文中提出的说明性数据并不是要在整个银鲤种群中推广。此处提出的协议可以扩展，以调查较大样本集的粘液流变学，以测试其他假设。
本研究的目的是用三种不同的粘液浓度（400毫克/毫升、200毫克/毫升和100毫克/毫升）来证明GR粘液流变学的流变特性。400毫克/mL浓度代表从鱼类GRs中采集的生粘液样品。 去离子化水（DI）用于将生粘液样品稀释成200毫克/mL和100毫克/mL浓度。稀释粘液样本可以评估剪切变薄和明显产量应力的程度，作为浓度的函数，并确定 GR 粘液过渡到非牛顿行为的浓度。摇床用于分解样品中任何大块粘液，以减轻由于不血源性导致的流变数据错误。
在大多数脊椎动物，包括鱼类，主要的粘液形成大分子是糖蛋白（粘液），往往膨胀在水中纠缠或化学交叉连接，并产生凝胶状材料12，13，17，18，19，20。高分子量、凝胶形成大分子和高含水量反映了粘液13中的滑度。高度的大分子间相互作用导致凝胶形成，而低水平的间大分子相互作用或断裂的键导致高粘度流体21。
过滤器喂养鱼类中的食物颗粒过滤过程得益于GR粘液相关特性，如粘性和粘度，这些特性决定了其粘附和粘附的潜力。粘液粘附的强度取决于特定的间质、静电或疏水相互作用23。桑德森等人24日对黑鱼进行了暂停喂养研究，结果发现了粘液粘附的证据。他们指出，悬浮食物颗粒与粘膜表面的粘附，其后由指示水流在粘膜表面上进行定向水流，将聚集的颗粒团与粘液结合在一起。水流产生的切变率暴露在剪切应变率下的粘液有助于将食物颗粒输送到消化器官。内窥镜技术用于观察过滤颗粒24。
关于 GR 粘液流变学测试的剪切率范围和实际限制的文献很少。因此，从胃、鼻腔、宫颈和肺粘液、鲑鱼皮肤粘液、黑鱼粘液和骨关节表面润滑剂的流变学研究中寻求指导，其中流变特征和非牛顿属性研究了11、12、25、26、27、28、29、30、31。最近，利用恒定的剪切率粘度研究了鱼皮粘液对运动和推进效率的影响。皮肤粘液流变学研究（没有任何稀释或同质化）有关海布雷姆，海贝和微薄证明非牛顿行为在典型的低剪率14。 在另一项相关研究中，从塞内加尔鞋底的腹腔和腹腔两侧的原始皮肤粘液样本被发现表现出非牛顿行为，表明在所有剪切率被认为是32的较高粘度。其他与水凝胶脚手架开发有关的流变方案，以及使用恒定剪切速度粘度计的高浓度悬架的流变方案，也已报告在文献33，34。
在这项研究中，GR粘液的特性被研究使用应变率控制，旋转流变计，已广泛应用于流变实验的复杂生物流体25。对于牛顿流体，表面粘度保持不变，是剪切率独立和剪切应力线性变化与剪切应变率（图3A，B）。对于非牛顿流体（如剪薄液）的粘度是切变率依赖或变形历史依赖（图3A，B）。损失模态（G）表示材料抵抗流动趋势的程度，并代表流体粘度（图4）。存储模组 （G'） 表示材料在应力诱导变形后恢复其原始形状的趋势，相当于弹性（图 4）。相位角（δ）或损失切线值，根据 G"/G'的反切线计算。它代表能量损失和存储之间的平衡，也是描述粘性弹性材料（胡克固体δ = 0°;粘性液体δ = 90°;粘性固体δ < 45°，粘性液体δ > 45° （图 4）25。结构化流体中的表观屈产应力（σy）表示状态的变化，可从稳定的状态扫描和动态应激扫描10的流变数据中观察到。如果外部施加应力小于明显的产量应力，则材料会弹性变形。当应力超过表观产量应力（图3B中标记为"平均应力"）时，材料将从弹性过渡到塑料变形，并开始在其液态35中流动。测量粘液样本中的存储模态 （G'） 和损失模态 （G）在振荡应力 （或应变） 条件下的变量，可量化材料状态从凝胶状到粘性液体样行为的变化。
此处描述了为监控存储模态 （G'）、损失模态 （G） 和明显粘度 （η） 相关数据而执行的测速仪测试类型。动态振荡测试（应变扫描和频率扫描）在锥形几何的受控振荡下监测G'和G"。动态应变扫描测试通过监测内在材料响应（图4）确定了粘液的线性粘度区域（LVR）。应变扫描用于确定在恒定振荡频率和温度下的产生行为。动态频率扫描测试以恒定振幅（应变或应力）和温度监测材料对增加频率（变形速率）的反应。应变保持在线性粘性区域 （LVR） 进行动态频率扫描测试。稳定状态剪切速率测试监测锥体几何稳定旋转下的明显粘度（η）。GR 粘液受到增量应力步骤的约束，并监测明显的粘度（η，Pa.s）的剪切率变化（+，1/s）。
本文提出的协议将GR粘液视为具有一定线性粘度响应范围的未知粘度的复杂结构材料。1、2、36日，帕特里夏·埃尔南德斯教授（乔治·华盛顿大学生物科学系）在密苏里河哈特溪进行捕鱼考察时，从银鲤的GRS中提取了鱼粘液。 图5A显示银鲤口内的GRS阵列，图5B中显示示意图图。图 5C中显示了一个切除的GR。 从银鲤的GRS中提取粘液，作为示意图图的示例，图5D，E。所有的测流仪测试都是在恒定的，受控的温度22±0.002°C，温度记录在捕鱼地点1，2，36。 每个粘液样本用流变计测试了三次，平均结果与统计误差条一起呈现。
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Protocol
1. 准备各种浓度的粘液溶液
注：为本实验准备了三浓度的粘液溶液（400毫克/mL、200毫克/mL 和 100 毫克/mL，体积分别为 1 mL、1 mL 和 2 mL）。
- 要计算粘液的质量，用（M带粘液）测量小瓶的平均质量：毫克）和没有粘液（M瓶：毫克） 。然后减去小瓶的质量与粘液没有粘液（M粘液= M与粘液- M瓶;毫克） 。
- 将粘液稀释成三浓度（400、200、100、mg/mL），并加入去离子（DI）水。
- 使用微管将 0.6 mL DI 水添加到粘液中，准备粘液溶液的第一浓度 400 毫克/毫升。
注：由于提取粘液的大致体积为 1.4 mL，400 毫克/mL 溶液的总体积为 ±2 mL。 - 将 400 毫克/mL 粘液液小瓶放在摇床上，以确保粘液溶液充分均匀化，并缓解任何粘液颗粒聚集。
- 准备粘液溶液的第二浓度，200毫克/mL，通过使用微管将第一浓度粘液溶液的一半体积绘制到新瓶中，并在新小瓶中加入1mL的DI水。
- 重复步骤 1.2.2 的第一个和第二瓶与粘液解决方案。
- 使用微管将 200 毫克/mL 溶液的一半体积（1 mL）绘制成新小瓶，并将 DI 水加入新小瓶中，从而准备粘液溶液的第三浓度 100 毫克/mL。
- 重复步骤1.2.2的所有三浓度的粘液溶液在各自的瓶（见补充图1）。
- 将粘液溶液小瓶存放在冰箱中，直到进行测速仪校准和测试。
- 使用微管将 0.6 mL DI 水添加到粘液中，准备粘液溶液的第一浓度 400 毫克/毫升。
2. 使用测流仪进行测量和数据采集
注：此协议中用于使用测速仪进行仪器控制和数据采集的软件在 材料表 中注明。此软件将被称为"测速仪控制软件"。
- 设置和校准测速仪。
- 打开流变器的压缩空气供应，确保气动表和流变计使用气泡计调平。拧开测流仪轴上的保护帽，在拧开时保持轴静止。
- 打开测流仪主开关以激活流变计的磁性轴承。
- 打开流变器控制计算机，其中安装了流变仪控制软件，并启动流变仪控制软件（见补充图2）。
- 通过选择选项卡进行仪器校准，"校准|仪器'从软件窗口。选择"仪器"选项。单击"惯性"下的"校准"。将仪器惯性校准值记录在μN .m.s2中，重复校准至少 3 倍，以确保校准值彼此在 10% 以内（参见补充图 3）。
- 在流变计的轴上安装流变计几何形状。
- 单击测速仪仪器控制软件中的"几何"选项卡。
- 用所需的几何形状（直径为 40 毫米、直径为 1= 0' 11''）和 Peltier 板用异丙醇清洁圆锥体（参见表 1、材料表、图 1和图 2）。
注：在测流仪上安装佩尔蒂埃板;它可以用同位素清洁，而它直接固定在测流仪上。 - 确保 Peltier 板夹具不含任何可见的灰尘，并在必要时使用同丙酚清洁。如果没有在测温仪中预装并连接散热器连接，则安装 Peltier 板。
- 按测速仪上的"锁按钮"到连接到圆锥体几何形状的锁轴。这会阻约轴的位置，但它可以在位置自由旋转。
- 单击"智能交换|启用"在测流仪仪器控制软件选项卡，以便自动检测几何形状（见补充图4）。
- 将测流仪顶部的轴拧在几何形状上。该软件将检测40毫米直径，1+ 0'11'圆锥角几何在这个阶段（见 表1 和 材料表）。
- 重复步骤 2.2.5 和 2.2.6 以确保检测到几何形状。
- 在测速仪仪器控制软件的"控制面板"下选择"差距"，单击"选项"图标并选择"轴向力"选项。将轴向力设置为"1 牛顿";这是为了确保圆锥体几何接触佩尔蒂埃板零间隙初始化（见补充图5）。
- 执行流变计几何校准。
- 从软件窗口中选择选项卡"几何"。单击"惯性"下的"校准"。将几何惯性校准值记录在μN .m.s2中，并重复此 2-3 次，以确保校准值彼此的 10% 以内。
- 单击软件窗口中的"摩擦"下的"校准"。记录μN.m//（rad/s）中的几何摩擦校准值，并重复此 2-3 次，以确保校准值彼此的 10% 以内（参见补充图 6）。
- 执行零间隙初始化
注：由于在没有参考"零"位置的情况下，无法准确将几何形状提升到 Peltier 板上方以执行测量，可以执行零间隙初始化。用于测量目的，几何形状内置几何间隙为 24 μm，修剪间隙为 28 μm。修剪间隙旨在有效清洁可能溢出几何表面积外的多余流体。这些间隙对于使用样品和测温仪准确测量数据至关重要。步骤 2.4.1 是绝对必要的，以确保几何设置为零间隙，以实现几何学和修剪间隙分别为 24 μm 和 28 μm。- 单击软件窗口中"控制面板"中的"差距"选项卡下的"零间隙"图标。当几何体经历的轴向力大于或等于 1 N 时，初始化就完成了，因为它触及了 Peltier 板。确保测流仪间隙为零，使其参考位置准确（参见附图 7和辅助图 8）。
- 在测流仪仪器控制软件的"Gap"选项卡下按"上下箭头"控制流变仪仪器或"几何升降"图标，将几何形状提升到任意高度。流变仪仪表上的控制屏幕和流变仪控制软件的控制面板将显示（相同的）间隙高度。
- 在测流仪控制软件中设置实验程序。在 22 °C 下使用锥体上 Peltier 板几何，执行流变特性的特征。
注：美国地质调查局网站于2018年9月20日用于确定河流水温，当时用于GR粘液实验的银鲤鱼在哈特溪36号地点被捕捞。粘液的温度会影响风湿性。将值调整到河流温度的意义在于大致匹配粘液特性的温度，从而可以现实地估计粘液特性。- 在测流仪控制软件中选择标签"实验"，并填写相关信息，如"名称"，"操作员"，"项目"等。 （见补充图9）
- 选择选项卡"几何"，并确保信息与步骤 2.2.5 一致。- 2.2.7.（见补充图10）。
- 选择选项卡"程序"，并使用设置"1：振荡振幅"程序的箭头键。（见补充图11）。
- 初始化"环境控制"设置如下："温度 = 22 °C";"浸泡时间 = 120s"，并检查框"等待温度"（参见补充图 11）。
- 初始化"测试参数"设置如下："频率 = 1 Hz";设置"数向扫描";"扭矩 = 10 到 10000 μN.m";"每十年加分 = 5 点"（见补充图 11）。
- 设置实验以确定已知浓度粘液的线性粘胶弹性范围 （LVR） （100 毫克/毫升）
- 使用适当的微管和移液器尖端绘制约0.3 mL的鱼粘液溶液浓度100毫克/mL（见步骤1.2， 材料表）。
- 使用微管将粘液溶液引入 Peltier 板（见图 2）。
- 按测速仪上的"修剪间隙"按钮，将几何形状降低到 Peltier 板上。或者，单击测速仪控制软件中"控制面板"选项中的"盖普"选项中的"修剪间隙"图标（参见附图 12）。
- 使用带移液器尖端的微管切除任何多余的粘液溶液，并确保流体在几何形状下方，不会在几何外围附近溢出。
注：液体装载不当将导致测量错误。填充样本下将降低扭矩分布，过度填充的样品将导致错误的压力分布，由于沿边缘溢出。 - 交替选择"电机"和"速度"选项卡到 5 rad/s 和 0 rad/s，直到几何下方样品中具有最小的惯性和速度。测速仪仪表上的控制屏幕和测流仪控制软件的控制面板将显示速度（见补充图13）。
- 按测流仪上的"几何差距"按钮，将几何形状降低到每个特定几何形状的预设适当间隙。或者，单击测速仪控制软件中"控制面板"选项中的"盖普"选项中的"几何间隙"图标（参见附图 14）。
- 运行实验以确定已知浓度粘液的线性粘胶范围 （LVR）（100 毫克/毫升）。
- 单击测速仪仪器控制软件上的"开始"图标（参见附图 15）。
注：测流仪执行自动测量：按下"开始"按钮后，测速仪大约需要 20 分钟才能完成测试。第 2.5.5 步中的"每十年点"设置决定了测流仪完成测量所需的时间。 - 通过单击弹出框上的"是"来运行实验，并建议将几何间隙降低到正确的距离以开始实验，如果不是已经降低的话。
- 观察报告存储 （G'） 和损失 （G'） 模组的测流仪生成的实时图。
注：G'和G"分别是存储和损失模组。存储模态表示材料在应力诱导变形后恢复其原始形状的趋势，相当于弹性。损失模态表示材料抵抗流动趋势的程度，并代表流体粘度（见图4）。 - 将绘图的 X 轴设置为"振荡应变百分比"。要做到这一点，请直接点击显示的图形并选择"图形变量"选项卡（参见补充图 16）。
- 在材料进入非线性粘胶弹性范围之前，记录振荡应变百分比范围，一旦测试完成。
- 在测流仪仪器控制软件的"Gap"选项卡下按"上下箭头"控制流变仪仪表或"几何升降"图标，将几何形状提升到 Peltier 板上方的任何任意高度。
- 保存包含实验过程的文件，并以测血仪仪器控制软件的原生文件格式结果，以确定粘液样本的线性粘度区域 （LVR）。
注：这可以通过在
数据进入非线性粘度区域 （NLVR） 之前将图兹的 X 轴设置为应变振幅 （%） 和/或振荡应力来完成（见补充图 16）。
- 单击测速仪仪器控制软件上的"开始"图标（参见附图 15）。
- 在线性粘胶弹性范围 （LVR） 中运行动态扫描和稳定状态剪切速率流量测试实验，以检测已知浓度 100 mg/mL 的粘液，从 100 毫克/mL 的三个独立粘液样本中生成结果。在可用粘液浓度样本上单独执行这些步骤。
- 重复步骤 2.5.1 和 2.5.4。
- 初始化"测试参数"设置如下："频率 = 1 Hz";设置"数向扫描";"应变 % = 100 至 10000%;"每十年加分 = 10 分"。
- 选择"程序"选项卡，并使用设置"2：振荡频率"程序的箭头键。
- 初始化"环境控制"设置如下："温度 = 22 °C";"浸泡时间 = 0.0 s" 。
- 初始化"测试参数"设置如下："应变 % = 1%";设置"数向扫描";"频率 = 20 至 1 Hz";"每十年加分 = 10 分"。
- 选择"程序"选项卡，并使用设置"3：流扫描"程序的箭头键。
- 初始化"环境控制"设置如下："温度 = 22 °C";"浸泡时间 = 0.0 s" 。
- 初始化"测试参数"设置如下："剪切率 = 1 到 10000 1/s";"每十年加分 = 10 分";复选框"稳定状态感应"。
- 重复步骤 2.7.1 和 2.7.2，等待实验完成，大约 45 分钟。
- 在测流仪仪器控制软件的"Gap"选项卡下按"上下箭头"控制测流仪或"几何升降"图标，将几何形状提升到任意高度。
- 使用一次性湿巾和手套，用同位素溶液去除和清洁 Peltier 板上的粘液（参见 材料表）。
- 保存包含实验过程的文件，并在测速仪仪器控制软件的原生文件格式中结果。
3. 重复 200 毫克/mL 和 400 毫克/mL 的其他粘液溶液浓度的协议。
- 执行步骤 2.5 + 2.8，包括其中列出的其余两个粘液溶液浓度的所有子步骤，200 毫克/mL 和 400 毫克/mL。
4. 图形表示和数据分析
注：补充代码文件中提供的代码执行数据平均值并生成可重复性错误，覆盖所有实验的数据。测速仪仪器控制软件中不提供标准偏差计算功能。代码以编程语言编写，用于数据分析、后处理和图形表示（详情请参阅 材料表 ）。
- 从第 2.8 步生成的出口数据与 100 毫克/mL GR 粘液浓度有关，第 3.1 步与 200mg/mL 和 400 毫克/mL GR 粘液浓度相关，通过单击选项卡将粘液浓度转化为电子表格格式，"文件|出口|在测流仪仪器控制软件中Excel（见补充图17）。
- 运行补充代码，生成不同剪切应变率 （） 和损失模态 （G） 的明显粘度 （η） 的地块
，存储模态 （G'） 和相位角度 （δ） 用于不同的振荡应力 （） 并生成具有代表性的结果。
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Representative Results
在本节中，我们使用圆锥体几何（直径为 40 mm，1° 0' 11'）和 Peltier 板的旋转流变计介绍 GR 粘液实验的结果。这些实验有助于描述GR粘液的非牛顿剪薄行为和描述粘液从凝胶状材料向液体状材料过渡的明显产量应力。具有代表性的结果包括对旋转测流仪仪器的低扭矩极限和二次流动效应的定量描述。仪器极限和稳定状态和动态应变率测量有助于准确确定 GR 粘液的粘性行为趋势和明显产量应力。明显的产量应力测量提供了一种手段来观察 GR 粘液不可逆塑料变形所需的最小应力并启动流。GR粘液的流动启动趋势可归因于食物颗粒粘附和运输功能。GR粘液的粘附和传输功能是协议实验中流变测量所告知的宏观材料属性。因此，GR粘液的宏观流变学特征是用此协议执行的。
实验中使用的粘液是从几只多达三条银鲤鱼的刺车中获取的，没有任何可见的血液痕迹。根据协议中所述，获得的样品被稀释成另外两个样品。所有测量均在22±0.002°C36的受控温度下进行。这个温度保持在测血仪的Peltier板上。选择圆锥体几何形状，是因为它在测量各种粘度（如 GR 粘液）中的粘度方面具有多功能性。表1中介绍了稳定状态剪切条件下的最低扭矩（10 x 10-9 Nm）、振荡条件下的最低扭矩（2 x 10-9 Nm），以及锥角（1× 0' 11"）和评估低扭矩和二次流量系统所需的流变计规格摘要。我们报告最后三个样本的复制，用于非牛顿和剪切稀释行为的特征和比较。
成功执行协议后的广泛推论
协议和分析的成功执行导致（宏观）流变特征的特征，包括非牛顿，剪薄行为粘液从银鲤刺拉克， 下垂的米利特里克斯。 特别是，产量现象得到解决，并确定了粘液的明显产量应力（400毫克/毫升浓度，最接近实际提取粘液的一致性）（σy = 0.2736 Pa）。该协议非常适合测量涉及非常小的样本量（约1.4兆瓦）的粘液。由于与GR粘液特征有关的文献稀缺，这些数据将有助于分析建模和扩展测温研究。
动态扫描实验结果
动态频率和振幅扫描实验的结果在本节中介绍。这些是在第 2.8.2 - 2.8.5 步中创建的程序的结果。在图6A、B中标明了400毫克/毫升浓度的GR粘液振荡频率扫描和振幅扫描的低扭矩极限。
频率扫描数据 （图 6A） 是获得角频率范围， 6.28 ≤ = ≤ 125.66 rad s-1在 0.01 的恒定振荡应变振幅.角频率值，6.28 rad/s （1 Hz）被选为在刺车的间歇中，在图6A中标记的宫殿褶皱运动的近似频率。应变振幅值的选择来自协议步骤 2.7 中确定的线性粘度弹性区域。在图6A中，低扭矩机型的两个潜在下限分别使用0.01和0.001（γ 0）的应变振幅计算，以及2x10-9 Nm和10×10-9 Nm（T分钟，见表1.）的最低扭矩计算。 图6A中提供的数据以宫殿折叠运动的近似频率（1 Hz或6.28 rad/s）开始，并增加到高于本研究中物理解释范围的更高角度频率。因此，这些数据没有进一步分析，因为它们需要对应变振幅和苍白折叠运动频率进行更详细的参数调查。
振幅扫描数据 （图 6B）以 6.28 rad/s （1 Hz） 的固定角频率 （+） 获取。需要注意的是，振幅扫描数据不受仪器低扭矩系统（图6B）的影响。因此，对所有三种粘液浓度（100毫克/毫升、200毫克/mL 和 400 毫克/毫升）进行了进一步分析，以确定粘度和产生行为的程度。
图4中显示的图形表示用作对振幅扫描实验进行扩展分析的指南。下面讨论了浓度为 100 毫克/mL、200 毫克/mL 和 400 毫克/mL 的三种粘液溶液的结果。
100毫克/mL粘液浓度（图7A）的结果表明，在低振荡压力（0.01≤≤0.1 
帕）下，存储和损失模组（G'和G）重叠显著。在振荡压力大于0.1 Pa时，存储模态下降，表示弹性较低。代表粘度的损失模态在全方位振荡应力（0.01 ≤≤ 0.5 Pa）中保持不变。这种现象可归因于牛顿流体样的行为，并符合100毫克/mL粘液浓度的恒定明显粘度（图7A 和 图8A，B）。相应的相位角（δ）数据显示，在中度和高振荡应力（0.05≤≤0.3 Pa），值在55°和70°之间（图7D）。因此，可以推断出，100毫克/mL粘液溶液表现出液体样的行为，具有微不足道的明显产量压力。
如图7B所示，在低振荡压力（0.02≤≤0.04 Pa）下浓度为200毫克/mL），存储模态（G'）减少，但仍大于损失模态（G）。 在振荡应力范围内（0.04 ≤≤ 0.07 Pa），有一个"交叉"区域，其中 G'和 G"值保持大致相等。此区域标记在图 7B中，并注明了冲线和相应的振荡应力值（0.04193 ≤≤ 0.06467 Pa）。 在这个区域之外，G"获得了比G"更高的价值，这表明向流体行为过渡。然而，G"（表示粘度）在振荡应力的全范围内保持不变（0.01 ≤≤0.5 Pa）。图7E中显示的相位角数据显示差异程度较高，特别是在振荡应力范围内（0.04193 ≤≤ 0.06467 Pa）。 从图7B中，E可以推断出流体从线性粘性向非线性粘性区域过渡。此外，200毫克/mL粘液浓度表示非牛顿特性和屈服倾向与振荡应力范围，（0.04193 ≤≤0.06467 Pa）。非牛顿式、剪薄型液体般的行为与图 8A中提供的明显粘度数据和图8B中的相应应力变化一致。
400毫克/mL粘液浓度数据在图7C，F.图 7C中的 G'和 G"趋势清楚地显示了 G"和 G"之间的交叉点的产生现象。表观收益率应力（σ）值记录为0.2736 Pa，表明粘液状态从凝胶状状态明显变化为非牛顿流体状状态。图 7F中显示的相位角度数据显示，表观收益率应力（σ= 0.2736 Pa）从大约 20° 急剧增加到 65°。当材料产生并开始像流体一样流动时，相位角度会急剧增加。非牛顿流体样的行为可以进一步支持与图8A，8B报告的稳定状态剪切测试的结果。在稳定状态剪切测试中报告的明显产量压力为0.2272 Pa（图8B）。
稳定状态剪切率实验结果
稳定状态剪切率实验的结果是，本节中采用图形表示作为指导，采用浓度为100毫克/mL、200毫克/mL和400毫克/mL的三种粘液溶液（图3A，B）。这些结果与协议步骤 2.8.6-2.8.8 中初始化的程序相对应。
图8A为100毫克/mL粘液浓度，在低切变速率（1≤≤4 
s-1）的高差异的明显粘度数据与坡度-1.4一样显示。低扭矩政权的位置也被标记。该范围内 100 毫克/mL 数据的高方差（1 ≤≤ 4 s-1），假定是（阴影）低扭矩系统的影响。在图 8B中，与剪切率数据相应的应力变化表明，当样本达到"应力高原"（或平面区域）时，剪切率范围较小。由于相应的粘度数据受到低扭矩影响，因此在产量应力估计方面忽略了此区域。 在高剪切速率范围内（2500 ≤≤ 10000 s-1），明显的粘度数据受到二次流量系统的影响。因此，100 毫克/mL 粘液溶液作为牛顿流体，独立于低扭矩和二次流动系统外的剪切速率，且持续的明显粘度为 0.0008 Pa s（±1.656 x10-5 Pa s）。
图8A显示，粘液的200毫克/mL浓度不受低扭矩限制的影响，在剪切速率范围内表现出切变效应，1≤≤15s-1。 零剪应变率粘度 （ηo） 被注明为 0.032 Pa s （±0.024 Pa s） 和无限剪切应变率粘度（η∞）在剪切率 （），1995s-1，被称为0.00085帕（±2.495 x 10-5帕）。该液体的剪切稀释效果在剪切速率范围内呈-1.8的坡度 ，1≤≤4s-1。 图8B的相应应力变化，显示了一个"压力高原"，代表一个产生现象，平均收益率应力为0.1446 Pa（±0.0037 Pa）。
粘液的 400 毫克/mL 浓度最不稀释，因此在材料稠度上与实际提取的 GR 粘液最接近。在图8A中，请注意，与200毫克/mL粘液浓度相比，剪切变薄特性对400毫克/mL粘液浓度有明确的定义。零剪切（ηo）和无限剪切应变率粘度（η∞）在剪切率 （），1995s-1，分别为0.137帕（±0.032帕）和0.00099帕（±9.323 x 10-5 Pas）。此外，剪切稀薄区的坡度被确定为-0.91在剪切速率范围内 ，1≤≤32s-1。 图8B中观察到的压力变化与剪切率的对应"应力-高原"表示明显的产量应力为0.2272 Pa（±0.0948 Pa）。
| 元件 | 型号/第 1 部分/版本 | 参数描述 | 规格 |
| 莱米 | DHR-2 | 频率范围 | 1 x 10×7 - 100 赫兹 |
| 最大角速度 | 300 rad/s | ||
| 稳定剪切下的最小扭矩 | 10 nN.m | ||
| 振荡下的最小扭矩 | 2 nN.m | ||
| 最大扭矩 | 200 μN *m | ||
| 扭矩分辨率 | 0.1 nN.m | ||
| 剪切率范围 | 5.73 x 10×6 至 1.72 x 104 [1/s] | ||
| 最大正常力 | 50 N | ||
| 正常力分辨率 | 0.5 mN | ||
| 几何学 | 513404.905 | 尺寸 | 直径40毫米 |
| 1° 0' 11" 锥角 | |||
| 佩尔蒂埃板 | 533210.901 | 温度范围 | -40°C 至 200°C ± 0.1°C |
表1：测流仪规格
图1：测流仪组件的CAD渲染。（A） 40 毫米 1° 锥形几何，（B） 佩尔蒂埃板附件。锥体几何应连接到流变计的轴上，Peltier 板应连接到旋转测血仪的基础。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：将液体放入佩尔蒂埃板块。流体样品应放置在 Peltier 板的中心，以确保在几何形状降低时，液体均匀地扩散到整个板中。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：稳定流变特性的图形表示。（A） 明显粘度 （η） 和（B） 剪应力 （ ） 与剪应变率的变化。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：动态流变特性的图形表示。存储 （G'） 和损失 （G） 的变异 Modulii 和相位角度 （δ） 与振荡应力。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：刺车（GR）的代表图像和示意图图。（A） 刺刺拉克阵列和花面褶皱（B） 刺刺拉克阵列的示意图绘图和刺刺拉克 （D）刺刺拉克（D） 示意图绘图，具有刺铲器中粘液提取的显著特征（E） 位置。图像5A和5C是在乔治华盛顿大学生物科学系的L.帕特里夏·埃尔南德斯教授进行解剖时拍摄的。请单击此处查看此图的较大版本。
图6：低扭矩效应。存储和损失模态变化为 400 毫克/毫升，粘液浓度与（A）频率扫描在应变振幅 = 0.01 和（B）振幅扫描在振荡频率 = 1 Hz （或 6.28 rad/s）.请单击此处查看此图的较大版本。
图7：银鲤粘液三浓度的振幅扫描。测试以 f = 1 Hz 或 + 6.28 rad/s（A）存储和损失模态变异完成，用于粘液浓度， 100毫克/mL（B） 粘液浓度的存储和损失模态变异，GR粘液浓度的 200 毫克/mL（C）存储和损失模态变异，GR 粘液浓度的 400 毫克/mL（D）相角变异， 粘液浓度的100毫克/mL（E）相角变异，粘液浓度的200毫克/mL（F）相角变异，400毫克/mL。请单击此处查看此图的较大版本。
图8：鱼粘液所有三个浓度的明显粘度（η）和应力（σ）与剪切率 （）的变化。 （A） 粘液浓度的明显粘度变化，400毫克/mL，200毫克/mL和100毫克/mL，以及低扭矩效应和二次流动效应（B） 与 GR 粘液浓度剪切率的应力变异， 400毫克/mL、200毫克/mL和100毫克/mL，用虚线标记"应力高原"（或平面区域）。虚线表示三个 GR 粘液浓度的平均表观产量应力值。请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：三浓度的银鲤GR粘液。从左到右：400毫克/mL，200毫克/mL，100毫克/毫升。最初浓度为400毫克/mL，其标准是一旦稀释样品将含有合理数量的鱼粘液，同时提供足够大的体积来进行几次测试。随后的两个浓度被 50% 的 DI 水按体积稀释。 请点击这里下载此文件。
补充图2：推出 测流仪控制软件。 此软件必须在机器打开后才启动。否则，仪器可能无法正确校准。 请点击这里下载此文件。
补充图3：仪器校准。 惯性校准是仪器唯一需要的校准。安装几何后还进行了其他校准。 请点击这里下载此文件。
补充图 4： 智能交换切换。 此选项用于启用或禁用智能交换。智能交换是一种测流仪仪器控制软件功能，一旦安装在测流仪轴上，就会自动检测几何形状。 请点击这里下载此文件。
补充图 5：测量间隙选项 访问 "差距"选项选项，以设置测量头的零间隙模式和横向速度的条件。几何形状和Peltier板之间的轴向接触力被设置为1N，以确保零间隙参考，即锥体几何学和Peltier板表面之间的接触。然后，测量头准确穿过 40 mm 1° 圆锥体几何形状和 Peltier 板之间的 24 μm 测量间隙。 请点击这里下载此文件。
补充图6：几何附件的校准。安装 40 mm 1° 圆锥体几何形状并通过测流仪控制软件进行检测后，几何形状的校准方式与仪器校准相同，以确保在实验期间进行精确测量。 请点击这里下载此文件。
补充图 7：零间隙图标。 使用此图标执行零间隙初始化。一旦零间隙初始化完成，测流仪可以准确地引用轴的位置，其几何形状连接到轴上，因为它被提升或降低。 请点击这里下载此文件。
补充图8：零间隙参考后锥形几何和Peltier板的CAD渲染。几何形状设置为在与Peltier板接触时产生1N的轴向接触力时建立零间隙。请点击这里下载此文件。
补充图9：协议第2.5.1步。该图表示样本命名、文件和数据输出的设置方式。 请点击这里下载此文件。
补充图10：协议第2.5.2步。 该图表示如何设置几何设置，如示例量、几何间隙和修剪间隙。对于某些几何形状，即本实验中使用的圆锥体，这些设置是不可改变的，并且根据几何形状进行定义。 请点击这里下载此文件。
补充图11：协议第2.5.3步。 该图表示在此程序步骤中如何设置测试设置和调理。 请点击这里下载此文件。
补充图 12：修剪间隙图标。 设置修剪间隙，以便降低几何形状，以修剪泄漏出 Peltier 板和锥体几何之间的区域的多余的流体。差距取决于使用中的几何形状。对于协议中使用的 40mm、1° 锥体几何形状，修剪间隙为 28 μm。 请单击此处下载此文件。
补充图 13：电机速度图标。 电机设置用于调整轴的旋转速度，并最大限度地减少几何惯性。 请点击这里下载此文件。
补充图 14：几何间隙图标。 几何间隙将几何学降低到锥板几何学所指定的 Peltier 板上方的特定距离。对于协议中使用的 40 mm、1° 锥体几何形状，几何间隙为 24 μm。 请单击此处下载此文件。
补充图15：开始图标。启动按钮启动之前设置的整个程序序列。 请点击这里下载此文件。
补充图 16：更改图形变量。 该数字表示运行程序时可用于数据表示的变量。特别是，在协议中的动态扫描实验中，振荡应变和振荡应力非常重要。 请点击这里下载此文件。
补充图17：将流变仪仪器控制软件文件导出到电子表格软件中。 文件作为电子表格导出后，使用其他编程软件进行数据分析是可行的。 请点击这里下载此文件。
补充代码文件： 使用数据分析程序处理数据文件后。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
制定此协议的主要目标之一是确定它非常适合在样本量非常小时对 GR 粘液进行流变特征。我们承认，需要更多的银鲤鱼学校样本，以充分描述GR粘液的流变特性，此处提供的数据不是整个银鲤鱼种群的泛泛而论。我们的技术是合理的，因为它的功效与流变特征的小样本量和扩展调查涉及较大的粘液样本合奏。
协议中的关键步骤是使用旋转测速仪准备各种浓度、测量和数据采集的粘液解决方案，以及图形表示和数据分析，以获得物理见解。
对 GR 粘液数据的物理见解来自图 3 和图 4中显示的图形表示，这些表示以预期物质行为的属性为注释。 零剪应变率粘度 （ηo） 值可以在材料分子占主导地位的低剪切应变率下观察到 （图 3A和图8A）。非牛顿流体中的无限剪切应变粘度（η∞）值是比零剪应变率粘度低的量级级。这些数据可以注意到在高剪切率，其中很少或没有依赖间脑相互作用（图3A和图8A）。对于非牛顿液体，随着剪切率的增加，明显的粘度逐渐降低，并达到恒定的低值（图3A和图8A）。在稳定状态测量下，GR 粘液中的屈服行为可以用图 3A中的坡度表示，并在方程 1 中表示，其中η表示明显的粘度，σy是（恒定）产量应力， 是剪切应变率。
图 3A 和 图 8B 在日志刻度上显示，因此方程 1 达到以下形式：
k - 表示明显的产量压力。在日志刻度上，表层的明显粘度随着"-1"的倾斜度而降低，如图3A10中所示的材料产量表示。 200毫克/mL和400毫克/mL粘液浓度分别具有-1.8和-0.91的坡度，并表现出屈服行为（图8A）。在动态振荡测量下，粘度弹性特性独立于线性粘胶区 （LVR） 的应变振幅（图 4）。当粘性材料 （GR 粘液） 进入非线性粘度区域 （NLVR） 时，当存储模态 （G'） 减少时，可以观察到 GR 粘液中的产生行为（图 4）。在 NLVR 系统中，如果存储模态大于损失模态（G' > G"），粘胶状材料将表现出固体凝胶样的行为。当损失模态超过存储模组（G' < G"）时，就会发生 G'和 G 之间的"交叉"数据。如图7B，C所示，200毫克/mL和400毫克/mL GR粘液浓度显示了以G'和G之间的"交叉"数据为标志的液体样行为。在稳定状态测量下的表观产量应力表示为应力的平均值，直到达到拐点（图3B）。此后，压力开始急剧增加，剪切应变率增加，如图3B和图8B所示。GR粘液数据（200毫克/mL和400毫克/mL浓度）显示剪切稀释液的行为，直到材料开始产生（图8A，B）。由于其非牛顿特性（图8B），在200毫克/mL和400毫克/mL粘液浓度中清楚地观察到明显的产量应力。动态振荡测量下的表观收益率应力显示在图4和图7B，C为G'和G"数据之间的"交叉"区域，然后是G"值超过G"。400毫克/mL GR粘液数据显示剪薄，非牛顿行为。观察到材料产量的发源点，其明显产量应力约为0.2736 Pa（图7C）。水凝胶到流体的转换（δ = 晒黑-1 （G"/G'） 变化在图 4和 7D-F 中显示。相位角中的极端与 0° 的胡克安固体和 90° 的粘性流体相关联，如图 4所示。45° 左右的相位角值归因于材料凝胶状行为向流体样行为的过渡。400毫克/mL粘液浓度清楚地显示，通过产生具有 ±0.2736 Pa（图 7F）的明显屈产过程，材料特性从水凝胶到液体样行为发生了变化。
了解测量限制和避免不适合物理解释的数据是复杂和柔软的生物流体的挑战，特别是在涉及小样本卷11的研究中。在低扭矩和二次流动效应下生成的数据不适合物理解释，并且依赖于测流仪中使用的几何形状（如本研究中的圆锥体和板）。查明这些制度是为了避免因动量扩散而歪曲因仪器分辨率和测量伪影而遭受的实验数据。低扭矩极限（图6A 和 图8A）是仪器产生的几何和最小扭矩的函数（表1）。在稳定的剪切测量条件下，Ewoldt 等人讨论了拒绝受半径锥板几何 （R） 圆锥形几何 （R） 低扭矩限制影响的数据的标准（T分钟 = 10 x 10-9 Nm， 表 1），并呈现在11以下：
剪切应变率在哪里。 与 100 毫克/毫升 GR 粘液浓度不同，200 毫克/毫升和 400 毫克/毫升 GR 粘液浓度不受低扭矩效应的影响，清楚地表明在低剪切应变率下具有高零剪切应变粘度的非牛顿剪薄行为。Ewoldt等人讨论了动态振荡测量下最小可测量粘度弹性模组的标准，并提出了以下（方程4）11。在方程 4 中，对于半径 （R） 的圆锥形几何，振荡剪切下的最小扭矩（T分钟= 2 x 10-9 Nm，表 1）。
其中 G分钟 是存储模组 （G'） 或损失模组 （G），是剪切应变率。受低扭矩效应影响的仪器限制制度在 图6A 和 6B中都有标记。稳定状态测量下的二次流动系统通过居住在旋转锥体和板几何11中的涡流来控制流体的向内动量扩散。二次流动模式增加扭矩错误，使流体看起来是剪增（图8A）。Ewoldt等人在 图8A 中提出的二次流量限制是使用以下关系11绘制的：
其中 L = é R， β锥角， R 是圆锥半径， + 1000 公斤米-3，Recrit = 4， 是剪切率。该制度有助于估计GR粘液样本中的无限剪切应变粘度（η∞）值。
可以通过使用平面几何形状而不是此处介绍的协议中显示的锥板几何来修改协议。平板测试应与旋转测流仪中测量间隙的参数变化进行，以揭示表观产量应力对测量间隙和几何形状的依赖性。本文所述对协议的建议改进如下。应执行线性粘度系统 （LVR） 和振荡频率中应执行应应执行应执行应变振幅的参数变异。应进行"粘合和剥落"流变学测试，以全面了解 GR 粘液的粘合性。GR粘液的流变特征应与测量血细胞任何痕迹的研究一起在较大的样本量组合上进行，以解释其对GR流变整体特性的影响。
协议的限制如下所述。GR粘液提取程序的复杂性以及粘液样本中血细胞或组织片段的存在可能会影响粘液的流变。然而，应该指出，协议中使用的粘液没有任何可见的血液痕迹。GR粘液样本是一种异质材料，由于提取后的位置和条件的差异，具有不同的流变特性。通过使用摇床对 GR 粘液进行充分均质化，以分解任何大块粘液和组织存在，解决了这一限制。另一个重要的限制是非常小的GR粘液样本量（约1.4 mL），收获用于分析，限制了GR粘液特性的泛化。
此协议的意义在于，它允许对非牛顿生物流体（如粘液）进行准确的流变特征。本协议为研究与人类、动物和植物分泌物相关的其他类似生物液体铺平了道路。此外，模拟生物流体的合成流体或聚合物溶液可以使用此协议进行测试，以了解不同应力、振荡频率和温度下的材料特性。该协议非常适合生物流体的流变特征，当非常小的样本量可用。
协议的扩展结果是，GR粘液的明显粘度和明显产量应力将促进创建分析模型，以解释过滤器馈送的基本流动力学调查的结果，以及需要和涉及交叉流和膜过滤的先进技术的结果。
宏观流变学研究认为，与食物颗粒接触的粘液最初处于凝胶状状态，用作粘合剂。开始流动和剪切力后，粘液达到明显的产量应力，并经历塑料变形。使用旋转测流仪执行协议有助于描述粘液从凝胶状行为向流体状行为的过渡。这种转变是实验观察到的，在旋转测流仪实验中，表观的产量应力记录在0.2736 Pa。当粘液的外部应力低于明显的产量应力时，粘液将表现出凝胶状的行为，以促进食物颗粒的粘附。当外部应力超过明显的产量应力时，粘液将表现出剪切稀释行为，促进聚集食物颗粒向银鲤中的消化器官输送。
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Disclosures
没有宣布任何利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢GW生物识别和生物灵感工程中心的支持和资助。我们感谢乔治华盛顿大学生物科学系的L.Patricia Hernandez教授鼓励调查和持续的合作，提供银鲤生理学方面的生物学专业知识，并提供粘液样本。我们感谢学生，大卫·帕伦博先生、卡莉·科恩女士、艾萨克·芬伯格先生、多米尼克·彼得罗西诺先生、亚历克西斯·伦登多斯先生、普里西拉·瓦尔盖斯先生、卡特·泰根先生和拉加夫·帕朱尔先生在实验室中提供帮助，以及TA仪器公司的托马斯·埃文斯先生和詹姆斯·托马斯先生，新城堡、DE支持测速仪的培训和维护。图5A，C的图像是在乔治华盛顿大学生物科学系的L.帕特里夏·埃尔南德斯教授进行解剖时拍摄的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | - | - | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
References
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