Methodenartikel

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

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DOI:

10.3791/61388

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14. November 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir einen einfachen Ansatz mit spezifischen Kulturmedien, die die Etablierung von neuron- und astrozytenangereicherten Kulturen oder neuronglia-Kulturen aus dem embryonalen Kortex mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Zusammenfassung

Der ischämische Schlaganfall ist ein klinischer Zustand, der durch eine Hypoperfusion des Hirngewebes gekennzeichnet ist, was zu Sauerstoff- und Glukoseentzug und dem daraus resultierenden neuronalen Verlust führt. Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen gliaalen und neuronalen Zellen nach einem ischämischen Ereignis positive Effekte ausübt. Daher ist es wichtig, Modelle zu entwickeln, die es ermöglichen, neuron-glia Wechselwirkungen in einer ischämischen Umgebung zu untersuchen, um mögliche Schutzmechanismen zu erforschen. Hierin stellen wir einen einfachen Ansatz vor, um Astrozyten und Neuronen aus dem embryonalen Kortex der Ratte zu isolieren, und das ermöglicht durch die Verwendung spezifischer Kulturmedien die Etablierung neuron- oder astrozytierter Kulturen oder neuronglia-Kulturen mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit.

Um den Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen zu untersuchen, schlagen wir einen Ansatz vor, der auf einem Kokultursystem basiert, in dem Neuronen, die in Coverlips kultiviert sind, in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Mehrwellplatten platt sind. Die beiden Kulturen werden durch kleine Paraffinkugeln getrennt gehalten. Dieser Ansatz ermöglicht die unabhängige Manipulation und Anwendung spezifischer Behandlungen auf jeden Zelltyp, was in vielen Studien einen Vorteil darstellt.

Um zu simulieren, was während eines ischämischen Schlaganfalls geschieht, werden die Kulturen einem Sauerstoff- und Glukoseentzugsprotokoll unterzogen. Dieses Protokoll stellt ein nützliches Werkzeug dar, um die Rolle von neuron-glia Wechselwirkungen bei ischämischen Schlaganfällen zu untersuchen.

Einleitung

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sterben jedes Jahr etwa 5,5 Millionen Menschen an ischämischen Schlaganfällen1. Dieser Zustand ist durch die Unterbrechung des Blutflusses in eine bestimmte Hirnregion gekennzeichnet, was zu einem reversiblen oder irreversiblen Verlust in der Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen führt, was die Gewebefunktion verändert und zu mitochondrialer Dysfunktion, Kalziumdysregulation, Glutamatexzitotoxizität, Entzündung und Zellverlustführt 2,3.

Neben Gefäßzellen sind neuronale und gliale Zellen an der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfallsbeteiligt 4. Insbesondere Sind Astrozyten für die Aufrechterhaltung von Neuronen von wesentlicher Bedeutung und haben in jüngster Zeit gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf die ischämische Läsion5spielen. Diese Art von Gliazelle erfüllt Funktionen der strukturellen Unterstützung, Abwehr gegen oxidativen Stress, Synthese von Neurotransmittern, Stabilisierung der Zell-Zell-Kommunikation, unter anderem6. Zusammen mit Neuronen spielen Astrozyten eine direkte Rolle bei der synaptischen Übertragung und regulieren die Freisetzung von Molekülen wie Adenosintriphosphat, Gamma-Aminobuttersäure und Glutamat7. Ein Teil der durch Ischämie induzierten Verletzung wird durch die übermäßige Freisetzung von Glutamat und seine Akkumulation am synaptischen Spalt verursacht, was zur Überaktivierung von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren führt, die nachgeschaltete Signalkaskaden aktivieren, was letztlich zu Exzitotoxizität8führt. Da Astrozyten in der Lage sind, Glutamat aus dem synaptischen Spalten zu entfernen und in Glutamin umzuwandeln, sind sie entscheidend für die Abwehr von Exzitotoxizität und üben damit eine neuroprotektive Wirkung auf Ischämie aus. Diese Zellen spielen auch eine Rolle bei Derischämie-induzierten Neuroinflammation. Nach der ischämischen Beleidigung ereignen sich aktivierte Astrozyten morphologischen Veränderungen (Hypertrophie), vermehren sich und zeigen eine Zunahme der glialen fibrillären sauren Proteinexpression (GFAP). Sie können reaktiv werden (Astrogliose), pro-inflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1 und Interleukin-1" freisetzen und freie Radikale, einschließlich Stickstoffmonoxid und Superoxid, produzieren, die wiederum den neuronalenTod9,10induzieren können. Im Gegensatz dazu können reaktive Astrozyten auch eine neuroprotektive Wirkung spielen, da sie entzündungshemmende Zytokine freisetzen, wie z. B. die Transformation von Wachstumsfaktor-β, das nach Schlaganfall11hochreguliert ist. Darüber hinaus können sie eine gliaale Narbe erzeugen, die die Geweberegeneration durch Hemmung des axonalen Keimens einschränken kann; diese Glianarbe kann jedoch die Verletzungsstelle von lebensfähigem Gewebe isolieren und so eine kaskadierende Welle unkontrollierter Gewebeschäden verhindern12,13.

Daher ist es unerlässlich, Modelle zu etablieren, die die Untersuchung von neuron-glia Wechselwirkungen unter einer ischämischen Verletzung ermöglichen, um therapeutische Strategien zu finden, die die Auswirkungen ischämischer Verletzungen begrenzen oder umkehren. Im Vergleich zu anderen Modellen zur Erforschung ischämischer Verletzungen, nämlich in vivo-Modellen 14,15,16, organotypische Kulturen17,18,19 und akute Hirnscheiben20,21,22, sind primäre Zellkulturen weniger komplex, was die Untersuchung einzelner Beiträge jedes Zelltyps in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls ermöglicht und wie jeder Zelltyp auf mögliche therapeutische Ziele reagiert. Typischerweise werden zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen neuronangereicherten Kulturen und astrozytenangereicherten Kulturen, Neuronen und Gliazellen postnatalen Ursprungs23,,24oder postnatale Gliazellen und embryonale Neuronen25,26verwendet. Hierin wird ein einfacher Ansatz vorgeschlagen, um neuron- oder astrozytenangereicherte Kulturen und Neuron-Glia-Kulturen aus demselben Gewebe zu etablieren. Diese Primärzellen werden aus dem embryonalen Kortex der Ratte gewonnen, einer Region, die häufig von Schlaganfall27,28betroffen ist. Darüber hinaus wird die Dissoziation des Gewebes nur durch ein mechanisches Verfahren durchgeführt. Daher ermöglicht dieses Protokoll die Isolierung von Zellen im gleichen Entwicklungsstadium, auf eine schnelle und kostengünstige Weise und mit hoher Leistung und Reproduzierbarkeit.

Das Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen kann mit einem Kokultursystem erforscht werden, in dem neuronenkultivierte In-Coverlips kultivierte Neuronen in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Multiwell-Platten gesät sind. Kleine Paraffinkugeln können verwendet werden, um die Trennung der beiden Zellkulturen zu gewährleisten. Dieser Ansatz ermöglicht eine unabhängige Manipulation jedes Zelltyps, bevor sie in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel ist es möglich, ein bestimmtes Gen in Astrozyten zum Schweigen zu bringen und zu sehen, wie es die neuronale Verletzlichkeit oder den Schutz vor ischämisch induzierten Schäden beeinflussen kann. Eine etablierte Methode zur Induzieren ischämisch-ähnlicher Bedingungen in vitro ist Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD)3, die darin besteht, die normale Atmosphäre (95% Luft und 5%CO2) durch eine anoxische Atmosphäre (95% N2 und 5%CO2) zu ersetzen, die mit dem Auslassung von Glukose verbunden ist.

Die beschriebene Methode eignet sich zur einfachen, schnellen, reproduzierbaren und kostengünstigen Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Astrozyten im Kontext eines ischämischen Schlaganfalls.

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Protokoll

Alle verwendeten Tiere wurden im CICS-UBI Health Science Research Centre gemäß den nationalen ethischen Anforderungen für die Tierforschung und mit der Europäischen Konvention zum Schutz von Wirbeltieren für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke (Richtlinie 2010/63/EU) gezüchtet.

1. Ratte Embryo Cortex primäre Zellkultur

  1. Kulturmedium Vorbereitung
    1. Bereiten Sie das Neurobasal Medium (NBM) vor, indem Sie die folgenden Ergänzungen hinzufügen: 2% B27, 0,5 mM Glutamin, 25 M Glutamat und 120 g/ml Gentamicin. Homogenisieren, den pH-Wert auf 7,2 einstellen und das Medium mit einem Vakuumfiltrationsschritt sterilisieren, indem man einen 0,22-mm-Filter verwendet. Für die neuron-glia Zellkultur, ergänzen Sie das NBM-Zellkulturmedium mit 10% des heat-inactivated Fetal Bovine Serum (HI-FBS).
    2. Bereiten Sie das Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Medium mit folgenden Ergänzungen vor: Natriumhydrogencarbonat 2,2 g/L, Insulin aus Rinderbauchspeicheldrüse 5 mg/L, D-Glucose wasserfrei 3,4 g/L, Penicillin (12 U/ml) /Streptomycin (12 g/ml) und 10% HI-FBS. Homogenisieren, den pH-Wert auf 7,2 einstellen und das Medium mit einem Filtrationsschritt sterilisieren.
  2. Herstellung von Materialien und Ausrüstungen
    1. Punktieren Sie den Klemmenteil einer 1 ml Kunststoff-Mikropipettespitze von Seite zu Seite, wobei sie eine Nadel mit einem bestimmten Durchmesser (0,5 mm für S; 0,6 mm für M; 0,8 mm für L) verwendet und die Öffnung der Spitze mit einer Flamme versiegeln.
    2. Sterilisieren Sie alle Glaswaren. Während der gesamten Sezierung die verwendeten Werkzeuge (z.B. Schere, Pinzette, Skalpell) in 70% Ethanol getaucht. Sprühen Sie die Materialien mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in die laminare Strömungskammer gelangen.
    3. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur auf 37 °C ein und legen Sie das Zellkulturmedium in das Wasserbad, bevor Sie mit dem Eingriff beginnen.
      HINWEIS: Für immunzytochemische Assays sollte die Poly-D-Lysin-Beschichtung in Multiwell-Platten mit Abdeckungen durchgeführt werden.
  3. Ratte embryonale Kortexkultur
    1. Entfernen Sie die Rattenembryonen von einer weiblichen Wistar-Ratte mit 15-16 Tagen Schwangerschaft (das Ende der Paarung, die 24 h dauern sollte, gilt als der1. Tag der embryonalen Entwicklung). Zu diesem Zweck das Weibchen mit Ketamin (87,5 mg/kg) und Xylazin (12 mg/kg) beastheisieren und die Embryonen entfernen. Dann einschläfern Sie die weibliche Ratte durch Zervixdislokation, nach Standardprotokoll.
    2. Die Embryonen in ein 50 ml steriles Rohr geben, Phosphatpuffer-Saline (PBS) hinzufügen, bis es die Embryonen bedeckt und schnell in den Kulturraum bringen.
    3. Noch im Eisack, legen Sie die Embryonen in eine Petrischale mit 25 ml kaltem PBS. Mit Hilfe von Schere und Pinzette, brechen Sie den Eigelbsack, entfernen Sie den Embryo und übertragen Sie ihn auf eine andere Petrischale, die auch kalte PBS enthält. Die PBS in der Petrischale sollte ausreichen, um den gesamten Embryo abzudecken.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Öffnen des Eigelbsacks, um eine Beschädigung des Embryos zu vermeiden. In 1.3.3 und 1.3.4 verwendeten wir Petrischalen mit 90 mm Durchmesser, die auf Eispackungen mit saugfähigem Papier platziert wurden, um die PBS bei niedriger Temperatur zu halten.
    4. Zur Zerlegung des Embryos auf eine andere Petrischale mit 30 ml kaltem PBS übertragen. Legen Sie den Embryo unter ein Sezierendes Mikroskop und immobilisieren Sie ihn mit einer Pinzette. Machen Sie den ersten Schnitt parallel zum Kortex, von der Augenhöhle bis zum Ende der Schnauze gehen und achten Sie darauf, das Tier nicht zu enthaupten.
    5. Entfernen Sie vorsichtig die Kopfhaut und die Meninges mit einer Pinzette, um das kortikale Hirngewebe nicht zu beschädigen. Machen Sie den nächsten Schnitt, um den Kortex zu trennen. Übertragen Sie das kortikale Gewebe mit einer Pasteurpipette in ein 15 ml-Rohr mit 5 ml PBS.
    6. Führen Sie die mechanische Verdauung des kortikalen Hirngewebes mit den 1 ml Kunststoffspitzen aus, die in 1.2.1 hergestellt wurden. 10 Mal mit einer regulären Pipette trituieren und den Prozess mit Pipetten mit zunehmend kleineren Löchern (L, M und S) wiederholen, bis die Brocken auseinandergefallen sind.
    7. Zentrifugieren Sie nach der mechanischen Verdauung die Suspension bei 400 x g für 3 min. Den Überstand entsorgen und das Sediment mit dem entsprechenden Zellkulturmedium, das zuvor bei 37 °C erwärmt wurde, wieder aufsetzen.
    8. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen, die in der Zellsuspension (Zelldichte) vorhanden sind, mit einer Neubauer-Kammer, machen Sie die entsprechenden Verdünnungen und platten Sie die Zellen. Die anfängliche Zelldichte wurde auf der Grundlage einer früheren Studie5definiert.
      1. Für eine neuronangereicherte Kultur verwenden Sie 0,21 x 106 Zellen/cm2 als anfängliche Zelldichte und halten die Zellen im NBM-Kulturmedium ohne HI-FBS.
      2. Für die Neuron-Glia-Kulturen verwenden 0,14 x 106 Zellen/cm2 als anfängliche Zelldichte und pflegen die Zellen in NBM-Kulturmedium mit 10% HI-FBS ergänzt.2
      3. Für eine astrozytenangereicherte Kultur verwenden Sie 0,26 x 106 Zellen/cm2 als anfängliche Zelldichte und halten die Zellen in MEM, wie zuvor angegeben, aufrechtzuerhalten.
      4. Legen Sie die Zellen in einen Inkubator, der auf 37 °C, 95%O2 und 5%CO2eingestellt ist.
        HINWEIS: Für längere Kulturperioden sollte ein Anti-Mitotik-Gehalt wie 27 -M 5-Fluor-2-Deoxyuridin mit 68 M Uridin hinzugefügt werden, um das Zellwachstum zu unterdrücken.

2. Co-Kultursystem

  1. Herstellung von Materialien
    1. Das Paraffin bei 150 °C in einem Heizblock ca. 7 min erhitzen. Halten Sie bis zum Abschluss des Vorgangs bei 150 °C. Dann, mit Hilfe einer 1 mm Durchmesser sterilen Glas Pasteur Pipette, fügen Sie einen kleinen Tropfen über sterilisierte und PDL-beschichtete Abdeckungen. Die Paraffinkugeln sind unregelmäßig, haben aber einen Durchmesser von ca. 2 mm. Die Kugeln ermöglichen es, die beiden Kulturen durch ca. 1,25 mm zu trennen.
    2. Da das Paraffin nicht steril ist, legen Sie den Multiwell mit den Paraffinkugeln 15 min unter uvvioletter Strahlung.
    3. Um die Co-Kultur zu etablieren, übertragen Sie den Coverslip mit den Paraffinkugeln mit einer Pinzette, die zuvor 15 min in 70% Ethanol getaucht war.
  2. Co-Kultur
    1. Wenn die beiden Kulturen einsatzbereit sind (d.h. nach 7 Tagen in der Kultur unter den in Schritt 1.3.8 genannten Bedingungen), übertragen Sie die in den Coverlips mit Paraffinkugeln gesäten Neuronen auf die Brunnen, die die Astrozyten enthalten.
    2. 24 h, bevor die beiden Kulturen in Kontakt gebracht werden, ändern Sie das Kulturmedium von Neuronen und Astrozyten zu NBM, ergänzt oder nicht, mit HI-FBS, je nach Zweck des Experiments.
    3. Nachdem Sie beide Zelltypen in Kontakt gesetzt haben, warten Sie 8-12 h, bevor Sie die verschiedenen Reize und Verfahren starten.
      HINWEIS: Die schematische Darstellung des Co-Kultursystems ist in Abbildung 1dargestellt.

3. Sauerstoff- und Glukoseentzug

  1. Kultur Medium Vorbereitung
    1. Verwenden Sie für die OGD-Experimente Hankes Balanced Salt Solution (HBSS). Bereiten Sie das HBSS Medium mit folgenden Reagenzien vor: 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mM Na2HPO4. Homogenisieren und den pH-Wert auf 7,2 einstellen. Sterilisieren Sie das Medium durch Filtration.
      HINWEIS: Ergänzen Sie gegebenenfalls die HBSS-Lösung mit Glucose (HBSSglu+), indem Sie 5,56 mM Glukose hinzufügen. Für Kulturen, die der OGD vorgelegt werden, ergänzen sie das HBSS-Medium nicht mit Glukose (HBSSglu-).
  2. OGD-Verfahren
    1. 7 Tage nach dem Aussaat der Zellen, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie zwei Mal mit HBSSglu-. Nach dem Waschen das HBSSglu-Zellkulturmedium hinzufügen und das Multiwell in die Hypoxiekammer legen.
    2. Versiegeln Sie die Hypoxiekammer und fügen Sie eine Gasmischung mit 95% N2/5%CO2 für 4 min mit einem Durchfluss von 20 L/min hinzu, um den in der Kammer vorhandenen Sauerstoff zu entfernen. Danach den Fluss anhalten und die Hypoxiekammer je nach Umfang der beabsichtigten Ischämie bei 37 °C bei 37 °C platzieren.
    3. Ersetzen Sie nach der Zeit der OGD das HBSSglu-Medium durch das entsprechende Kulturmedium für die verbleibenden Verfahren.
      HINWEIS: Das OGD-Experiment zielt darauf ab, die In-vitro-Bedingungen zu simulieren, unter denen die Zellen während eines ischämischen Ereignisses leiden, daher ist es wichtig zu bescheinigen, dass alle zuvor verwendeten Medien entfernt werden.

4. Immunzytochemie-Test

HINWEIS: Führen Sie den Immunzytochemie-Test wie zuvor beschrieben5durch.

  1. Kurz gesagt, um die verschiedenen kortikalen Kulturen zu charakterisieren, inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 4 °C mit Kaninchen Anti-GFAP (1:2000) und Maus Anti-Mikrotubule-assoziiertes Protein 2 (MAP2; 1:500); und dann 1 h bei Raumtemperatur mit den folgenden sekundären Antikörpern: Anti-Kaninchen konjugiert alexa Fluor 546 und Anti-Maus konjugiert Alexa Fluor 488, beide bei 1:1000 Verdünnung.
  2. Beschriften Sie die Zellkerne durch Inkubation mit 2 m Hoechst 33342 für 10 min bei Raumtemperatur.
  3. Mount deckt Die Lips in Fluoreszenz-Montagemedium ab und erfasst Bilder auf einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer 63-fachen Vergrößerung.

5. Statistische Analyse

  1. Express-Daten als Prozentsatz der Gesamtzahl der Zellen oder als Prozentsatz der Kontrolle und als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von mindestens 3 unabhängigen Experimenten, die in Dreifacharbeit durchgeführt wurden.
  2. Führen Sie statistische Analysen mit Software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) mithilfe des nicht gepaarten Schülertests durch. Die Ergebnisse wurden als signifikant angesehen, wenn Werte von p < 0,05.

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Ergebnisse

Um die Kulturen zu charakterisieren, wurde die Immunzytochemie zur Beurteilung der Anzahl der Zellen, die GFAP oder MAP2, weit verbreitete Marker von Astrozyten und Neuronen (Abbildung 2), in jeder Art von kortikaler Kultur exprimiert. Diese Analyse ergab, dass astrozytenangereicherte Kulturen 97% der Zellen zeigten, die GFAP exdrückten (Abbildung 2A). In Bezug auf die neuronangereicherte Kultur 78% der Zellen exprimiert MAP2, 4% der Zellen ausgedrückt GFAP, und...

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Diskussion

Die hier beschriebene Methode besteht aus der Astrozyten- und Neuronenisolation aus dem embryonalen kortikalen Gewebe der Ratte, die die Etablierung neuron- oder astrozytierter Kulturen oder neuronglia-Kulturen ermöglicht. Es wurde aus einer früheren Studie unserer Gruppe5adaptiert, in der die kortikale Neuron-Glia und neuron-angereicherte embryonale Kulturen Isoliertheit beschrieben und die beiden Kulturen charakterisiert wurden. Mit diesen Kulturen, Roque et al. fand heraus, dass Astrozyten spie...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia durch die Projekte UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 und das Stipendium SFRH/BD/135936/2018 an JP, von ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' durch das Projekt CENTRO-01-0145-FEDER-000013 und Finanzierung der PPBI-portugiesischen Plattform von BioImaging durch das Projekt POCI-01-0145-FEDER-022122.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24 -Well KulturplattenThermo Fischer Scientific142475
95% N2/5% CO2 GasflascheArLí quido
Anti-Maus konjugiert mit Alexa Fluor 488InvitrogenA110011/1000 Verdünnung; Inkubationszeit - 1 h bei Raumtemperatur
Anti-Kaninchen konjugiert mit Alexa Fluor 546InvitrogenA110101/1000 Verdünnung; Inkubationszeit - 1 h bei Raumtemperatur
B27 Ergänzung (50x)Gibco17504-044
Dako Fluoreszenz-EindeckmediumDakoS3023
D-Glukose wasserfreiFisher ScientificG/0450/603,4 g/L
EpifluoreszenzmikroskopZeissAxioObserver Z1x63x Objektiv
Fötales Rinderserum (FBS)BiochromS061510%
GentamicinSigma-AldrichG1272120 & Mikro; g/mL
GlutamatSigma-AldrichG841525µ M
GlutaminSigma-AldrichG31260,5 mM
Hoechst 33342InvitrogenH13992 µ M; Inkubationszeit - 10 min bei Raumtemperatur
Hypoxie-InkubationskammerStemcell Technologies27310Kammer für die OGD-Induktion
Insulin aus der Bauchspeicheldrüse des RindersSigma-AldrichI55005 mg/L
KetaminSigma-AldrichK-00287,5 mg/kg
Minimum Essential Medium Eagle MediumSigma-AldrichM0268erwärmen auf 37 &de; C vor Gebrauch
Maus Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-744211/500 Verdünnung; Inkubationszeit über Nacht bei 4 &/Grad; C
Neurobasales MediumGibco21103-049erwärmen bis zu 37°; C vor der Verwendung
Paraffinpastillen für die HistologieSigma-Aldrich1.07164Erstarrungspunkt 56-58° C
ParaformaldehydSigma-AldrichP61484% in PBS
Penicilin/StreptomycinBiochromA 2213Penicillin (12U/ml) /Streptomycin (12µ g/mL)
Poly-D-LysinSigma-AldrichP1024
Kaninchen Anti-GFAPDAKOZ03341/2000 Verdünnung; Inkubationszeit über Nacht bei 4 & Grad; C
NatriumhydrogencarbonatFisher ScientificS/4240/602,2 g/L
XylazinSigma-AldrichX112612 mg/kg

Referenzen

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