Summary
肌肉葡萄糖摄取的完全调节对于维持全身葡萄糖稳态非常重要。该方案在描述各种生理干预对全身葡萄糖代谢的影响时，评估孤立和孵育成熟骨骼肌中胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取。
Abstract
骨骼肌是一种胰岛素反应组织，通常占据饭后进入血液的大部分葡萄糖。此外，据报道，与静息条件相比，骨骼肌在运动期间可能使血液中葡萄糖的提取增加多达50倍。运动和胰岛素刺激期间肌肉葡萄糖摄取的增加取决于葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）从细胞内隔室到肌肉细胞表面膜的易位，以及葡萄糖通过己糖激酶II磷酸化为葡萄糖-6-磷酸。小鼠肌肉（如 米氏 支原肌和 长指伸 肌（EDL））的分离和孵育是研究胰岛素和电诱导收缩（运动模型）对成熟骨骼肌葡萄糖摄取的影响的适当离体模型。因此，离体模型允许评估肌肉胰岛素敏感性，并使得在收缩期间匹配肌肉力量的产生成为可能，从而确保在测量肌肉葡萄糖摄取期间肌肉纤维的均匀募集。此外，所描述的模型适用于可能对肌肉胰岛素敏感性产生影响的药理学化合物测试，或者在试图描绘骨骼肌葡萄糖摄取的调节复杂性时可能有所帮助。
在这里，我们描述并提供有关如何使用放射性标记的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇作为细胞外标志物来测量小鼠的分离和孵育的比目鱼和EDL肌肉制剂中胰岛素和收缩刺激葡萄糖摄取的详细方案。这可以准确评估成熟骨骼肌中的葡萄糖摄取，而没有可能干扰完整动物模型的混杂因素。此外，我们提供有关孵化小鼠骨骼肌代谢活力的信息，表明在研究肌肉能量代谢时，所应用的方法在某些条件下具有一些警告。
Introduction
骨骼肌具有从细胞外空间提取大量葡萄糖的能力，以响应胰岛素和运动。这有助于维持全身葡萄糖稳态，并在高能量需求期间确保葡萄糖供应。由于骨骼肌葡萄糖摄取的完整调节已被证明对整体健康和身体表现很重要1，2，因此在各种条件下测量肌肉葡萄糖摄取受到了很多关注。在人类和动物中，高胰岛素 -正血糖钳夹已被用作评估体内胰岛素敏感性的金标准技术3，4.与口服葡萄糖耐量试验的结果相反，高胰岛素-正血糖钳夹技术不需要完整的胃肠功能或胰腺分泌胰岛素，因此可以在胃肠和/或胰腺功能变化的受试者之间比较胰岛素反应。自20世纪60年代以来，人类运动期间体内肌肉葡萄糖摄取的测量一直很频繁5。首先通过使用动静脉平衡技术6 ，后来通过使用正电子发射断层扫描（PET）成像结合发射葡萄糖类似物，例如18F-氟脱氧葡萄糖7。在啮齿动物中，运动刺激的肌肉在体内葡萄糖摄取通常通过使用放射性或稳定同位素标记的葡萄糖类似物8，9，10进行。
测量体内肌肉葡萄糖摄取的补充方法是从啮齿动物中分离和孵育小肌肉，然后使用放射性或稳定同位素标记的葡萄糖类似物11，12，13测量葡萄糖摄取。该方法可以准确可靠地量化成熟骨骼肌中的葡萄糖摄取率，并且可以在存在各种胰岛素浓度和通过电刺激引起的收缩期间进行。更重要的是，在研究经过各种干预（例如营养，身体活动，感染，治疗）的小鼠的肌肉代谢表型时，分离和孵育骨骼肌中葡萄糖摄取的测量具有相关性。分离的骨骼肌模型也是可能影响葡萄糖摄取本身和/或改变胰岛素敏感性的药理学化合物测试 的 合适工具12，14。通过这种方式，设计用于调节肌肉葡萄糖代谢的化合物的功效可以在高度受控的环境中进行测试和评估，然后再在临床前动物模型中进行后续的体内测试。
在某些条件下，代谢活力可能对孤立和孵育的骨骼肌模型系统构成挑战。事实上，在孵化的肌肉中缺乏循环系统意味着基质（例如氧气和营养物质）的输送完全取决于肌肉纤维与周围环境之间的简单扩散。关于这一点，重要的是，孵化的肌肉小而薄，因此，在孵育过程中代表较少的氧扩散屏障15。特别是在长时间孵育数小时期间，缺氧状态可能由于氧气供应不足导致肌肉能量消耗而发展15。尽管先前已经报道了孵化大鼠肌肉中代谢活力的各种标志物以及有助于维持大鼠肌肉活力的重要变量的鉴定15，但仍然需要对小孵化小鼠肌肉中的代谢活力进行全面评估。因此，目前，糖原含量已主要被用作培养小鼠骨骼肌16，17中代谢活力的标志物。
在这里，我们描述了一个详细的方案，以测量使用放射性标记的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇作为细胞外标志物的小鼠分离和孵育的比目鱼和EDL肌肉中的基础，胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取。在本研究中，在10分钟内测量葡萄糖摄取，并且该方法使用亚最大和最大有效胰岛素浓度以及单一收缩方案。然而，本文中描述的方案可以很容易地在孵育时间、胰岛素剂量和电刺激方案方面进行修改。此外，我们还对孵育的比目鱼和EDL小鼠肌肉中的代谢活力的各种标志物进行了彻底的表征。结果表明，向孵育缓冲液补充葡萄糖对于保持孵育肌肉1小时的代谢活力至关重要。
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Protocol
涉及研究动物的程序应根据相关准则和当地立法进行。用于本研究的所有动物实验均符合《欧洲保护脊椎动物公约》，用于实验和其他科学目的，并得到丹麦动物实验监察局的批准。
1.实验装置和缝合环的制备
注意：对于本研究，使用带有定制孵育钩的集成肌肉条肌图系统来孵育孤立的小鼠骨骼肌（图1）。该系统允许肌肉在具有连续氧合（95%O2 和5%CO2）和恒定温度下的生理溶液中沐浴。肌肉组织浴与力传感器耦合，用于测量收缩过程中的肌肉力产生。为了在收缩期间引发和记录肌力学反应，请分别使用电脉冲刺激器和数据收集程序。刺激孵化的肌肉通过位于肌肉中央和两侧的铂电极收缩。
- 打开肌电图系统和加热室至30°C。 与肌电图系统兼容的开放式数据收集软件，并校准力传感器，以确保数据集之间的可比性。
- 首先切割约16厘米的不可吸收的手术尼龙缝合线。使用镊子从单股线形成直径约0.4厘米的环。重复此操作，直到生成足够的循环。每块肌肉需要两个环 - 一个用于近端，一个用于远端肌腱。
2. 溶液和培养基的制备
- 基础孵育培养基的制备
- 准备以下储备溶液：2.5 M 氯化钠（NaCl，250 mL），0.5 M 碳酸氢钠（NaHCO3，250 mL），0.5 M 氯化钾（KCl，50 mL），0.25 M 氯化钙（CaCl2，50 mL），0.25 M 磷酸二氢钾（KH2PO4，50 mL），0.25 M 硫酸镁（MgSO4，50 mL），110 mM 丙酮酸钠（Na-丙酮酸钠， 100 mL），500 mM D-甘露醇（100 mL），1 M 2-脱氧-D-葡萄糖（4 mL），15%的牛血清白蛋白（BSA）溶液透析克雷布斯 - 林格 - 亨赛利特（KRH）缓冲液（在下面的步骤4中描述）（100 mL）。
注意：需要两种解决方案来测量静息和收缩刺激的葡萄糖摄取。此外，用于评估胰岛素刺激的葡萄糖摄取的每种胰岛素浓度都需要两种溶液。因此，总共需要六种不同的解决方案来测量孤立的小鼠骨骼肌中的基础，次最大胰岛素，最大胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取。在下文中，“基础孵育培养基”是指不含胰岛素或放射性示踪剂的培养基。“培养基”是指含有胰岛素的培养基。“葡萄糖摄取孵育培养基”是指除胰岛素外还含有2-脱氧-D-葡萄糖和放射性示踪剂的培养基，其浓度与“培养基”中使用的浓度相同。 - 通过添加超纯水（ddH2O）与NaCl（117 mM），NaHCO3（24.6 mM），KCl（4.7 mM），CaCl2（2.5 mM），KH2PO4（1.2 mM）和MgSO4（1.2 mM）来制备KRH缓冲液。随后，用95%O 2和5%CO 2向KRH缓冲液加气至少10分钟。在30°C时，KRH缓冲液的所需pH值应在7.35-7.45之间。 如果在室温下进行pH调节，KRH缓冲液的pH值应在7.25-7.35之间。
- 将BSA（0.1%），丙酮酸钠（2mM）和D-甘露醇（8mM）添加到气体和pH调节的KRH缓冲液中，以完成基础孵育培养基。将基础孵育培养基储存在密封容器中，以尽量减少O2 和CO2 的脱气，并将培养基置于30°C。
注意：通常，KRH补充剂（即丙酮酸钠，D-甘露醇和D-葡萄糖）的渗透压在整个实验中保持恒定，以避免肌肉细胞的收缩或扩张。这里描述的方案使用10mM的渗透压作为KRH补充剂。如果需要含葡萄糖的缓冲液，请更换KRH补充剂以满足需求，例如5 mM D-葡萄糖和5 mM D-甘露醇。 - 为避免孵育缓冲液中可能存在的BSA相关污染物，请针对KRH透析BSA。
- 要使15%的BSA储备溶液透析到KRH缓冲液中，首先将300g分析级无脂BSA溶解在900mL KRH缓冲液中。接下来，将透析管在重新蒸馏的水中煮沸，直到管子变软。
- 用BSA-KRH溶液填充管道并固定管道末端。将带有BSA-KRH的管子置于5L KRH缓冲液中，并在4°C下过夜。 第二天更换KRH缓冲液，并将管道与BSA-KRH在KRH缓冲液中以4°C过夜。
- 最后，从管道中收集BSA-KRH溶液，并将KRH缓冲液加入最终体积为2 L（即15%BSA-KRH储备溶液）。将15%BSA-KRH储备溶液分成等分试样，并储存在〜-20°C的冰箱中。
- 准备以下储备溶液：2.5 M 氯化钠（NaCl，250 mL），0.5 M 碳酸氢钠（NaHCO3，250 mL），0.5 M 氯化钾（KCl，50 mL），0.25 M 氯化钙（CaCl2，50 mL），0.25 M 磷酸二氢钾（KH2PO4，50 mL），0.25 M 硫酸镁（MgSO4，50 mL），110 mM 丙酮酸钠（Na-丙酮酸钠， 100 mL），500 mM D-甘露醇（100 mL），1 M 2-脱氧-D-葡萄糖（4 mL），15%的牛血清白蛋白（BSA）溶液透析克雷布斯 - 林格 - 亨赛利特（KRH）缓冲液（在下面的步骤4中描述）（100 mL）。
- 含胰岛素的培养基的制备
- 对于含有亚最大有效胰岛素浓度的培养基，每mL基础培养基（100μU / mL胰岛素）加入1μL1μL胰岛素储备溶液。
- 对于含有最大有效胰岛素浓度的孵育培养基，每mL基础培养基（10 mU / mL胰岛素）加入1μL 10 U / mL胰岛素储备溶液。
- 葡萄糖摄取孵育培养基的制备
注意：只有授权人员才能在限制和控制区域内处理放射性物质，一些大学、研究机构和公司可能需要获得“放射性使用许可证”。材料和废物必须按照适当的当地程序，准则和法规进行处理。- 按照第 2.1.2 节中所述的相同过程操作。
- 将BSA（0.1%），丙酮酸钠（2mM），D-甘露醇（7mM）和2-脱氧-D-葡萄糖（1mM）添加到气体和pH调节的KRH缓冲液中。
- 将[3H]2-脱氧-D-葡萄糖（0.028 MBq / mL）和[14C]甘露醇（0.0083 MBq / mL）加入补充的KRH缓冲液中，以完成葡萄糖摄取孵育培养基。储存在30°C。 如果将[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇溶解在乙醇中，则在使用前通过N2 介导的蒸发除去乙醇。
- 对于含有低于最大有效胰岛素浓度的葡萄糖摄取孵育培养基，每mL葡萄糖摄取孵育培养基（100μU / mL胰岛素）加入1μL1μL胰岛素储备溶液。
- 对于含有最大有效胰岛素浓度的葡萄糖摄取孵育培养基，每mL葡萄糖摄取孵育培养基（10 mU / mL胰岛素）加入1μL 10 U / mL胰岛素储备溶液。
3.动物和小鼠比目鱼和EDL肌肉的解剖进行孵育
注意：涉及研究动物的程序应根据相关指南和当地立法进行。所描述的程序可用于各种菌株和遗传背景的内部繁殖或市售的雄性和雌性小鼠。为喂养的雌性C57Bl / 6J小鼠提供以下程序。平均而言，小鼠年龄为19周，体重为25克。将小鼠维持在12：12小时的明暗循环中，自由获得标准的啮齿动物食物和水。动物实验于当地时间约9：00开始，所有动物在2小时内处死。
- 向每个孵育室中加入4 mL预热（30°C）基础孵育培养基，并确保基础培养基用95%O2 和5%CO2连续氧化。
- 腹腔注射戊巴比妥（10mg / 100g体重）或其他可用的麻醉剂（例如三溴乙醇）麻醉小鼠。
注意：请注意，在某些国家/地区，可能需要获得处理戊巴比妥和其他麻醉药物的许可证。在开始肌肉解剖之前，必须正确诱导每只动物的麻醉。为了确保这一点，对尾巴和腿部反射进行了测试。为了获得最佳效果，应进行良好的解剖练习，以避免在切除过程中损伤肌肉。 - 将麻醉的小鼠俯卧在解剖托盘（例如聚苯乙烯泡沫塑料盖）上，并根据需要使用针头固定前爪和后爪。
- 从小腿上取下皮肤，并确保跟腱和膝关节都可见。
- 对于比目鱼肌的解剖，首先将单个缝合环连接到跟腱上。将镊子固定在缝合环远端的跟腱上，并进行切割以从爪子中释放比目鱼和腓肠肌。小心地将豌豆镊子滑过小鼠，从而暴露出比目鱼肌。
- 固定下豌豆镊子，并在比目鱼肌的近端肌腱周围放置第二个缝合环。接下来，切除近端肌腱并解剖没有腓肠肌的比目鱼（包括两个连接的缝合环）。通过将每个缝合环连接到各自的钩子上，将比目鱼肌快速放置在孵育室中。
- 使用镊子移除覆盖 胫骨分枝前 （TA）的筋膜。如果操作正确，TA和EDL肌肉的远端肌腱应清晰可见白色;并彼此分离。
- 切除TA肌的远端肌腱并解剖肌肉以进行后续分析（例如基因分型）。使用镊子，轻轻地将EDL肌肉从周围组织中解放出来，但保持肌肉完整，不要切断肌腱。在EDL的远端肌腱周围放置一个缝合环，在EDL的近端肌腱周围放置第二个缝合环。
- 接下来，用两个连接的缝合环切割释放EDL肌肉的肌腱，并通过将每个缝合环连接到各自的钩子来快速将肌肉置于孵育室中。为了在孵育期间，特别是在电诱导的比目鱼和EDL肌肉收缩期间失去张力，用紧密的结固定肌腱周围的缝合环非常重要。
- 最后，通过例如宫颈脱位对动物实施安乐死。
- 当肌肉被解剖并放置在孵育室中时，将每块肌肉的静息张力调整至〜5mN，并在启动实验方案之前将肌肉预孵育至少10分钟。
4. 胰岛素刺激的葡萄糖摄取在分离的小鼠骨骼肌中
- 在步骤3.9之后，将基础孵育培养基替换为不含胰岛素的孵育培养基（基础孵育培养基），次最大有效胰岛素浓度或最大有效胰岛素浓度并在孵育室中放置20分钟。将每个孵育室间隔1分钟，从而为随后收获肌肉腾出时间。
- 在20分钟刺激期结束时，用含有相同浓度胰岛素的葡萄糖摄取培养基替换孵育培养基，并在孵育室中放置10分钟，每个孵育室之间再次间隔1分钟。
- 在葡萄糖摄取培养基中孵育10分钟后，轻轻地从孵育室中除去肌肉，并在冰冷的基础孵育培养基中洗涤它们。随后，在去除缝合环并将肌肉冻结在液氮中之前，在滤纸上快速干燥肌肉。如果人们还希望研究除葡萄糖摄取之外的各种细胞内代谢物和蛋白质信号传导，则必须快速收获孵化的肌肉。
- 从每个孵育室收集100μL葡萄糖摄取孵育培养基并将其储存在-20°C。 这些样品中的放射性量将包括在肌肉葡萄糖摄取的计算中。
5. 孤立小鼠骨骼肌收缩刺激葡萄糖摄取
注意：为了诱导孤立的小鼠骨骼肌收缩，请使用以下方案：1个训练/ 15秒，每个训练1秒长，由以100 Hz传递的0.2 ms脉冲组成。然而，其他类似的方案引发孤立的小鼠骨骼肌的收缩也可能起作用。重要的是，应调整电压以产生孵化肌肉的最大力发展，这取决于实验设置。如果不能确保这一点，您可能会面临并非所有肌肉纤维都在收缩的风险。反过来，这可能会在数据集中引起偏差。
- 在步骤3.9之后，将铂电极放在肌肉的中心和两侧。用葡萄糖摄取孵育培养基替换基础孵育培养基后立即开始肌肉收缩。如果可能，将每个孵育室间隔1分钟，从而为随后收获肌肉腾出时间。请记住记录每个孵化肌肉的力产生。
- 在葡萄糖摄取孵育培养基中收缩10分钟后，除去铂电极，轻轻地从孵育室收集肌肉，并在冰冷的基础孵育培养基中洗涤它们。随后，在去除缝合环并将肌肉冻结在液氮中之前，在滤纸上快速干燥肌肉。整个肌肉采集过程应尽可能快地进行。
- 从每个孵育室收集100μL葡萄糖摄取孵育培养基并将其储存在-20°C。 这些样品中的放射性量将包括在肌肉葡萄糖摄取的计算中。
6. 骨骼肌均质化与加工
注意：下面给出的肌肉均质化程序可以通过同一组肌肉样品中的蛋白质印迹来确定葡萄糖摄取和肌细胞信号传导。
- 在400μL冰冷缓冲液中匀浆每个肌肉，其中pH 7.5含有10%甘油，20mM焦磷酸钠，1%IGEPAL CA-630（NP-40），2mM苯基甲基磺酰氟（溶解在异丙醇中），150mM NaCl，50mM HEPES，20mM β甘油磷酸盐，10mM氟化钠（NaF），1mM乙二胺四乙酸（EDTA），1mM乙二胺四乙酸（EGTA），10μg/ ml抑肽酶， 10 μg/mL leupeptin、3 mM 苯甲脒和 2mM 正钒酸钠，使用钢珠和组织分析器（30 Hz 下 2 x 45 s）。在4°C下端对端旋转所有匀浆1小时，之后在4°C下以16，000× g 离心20分钟。 收集裂解物（上清液），用于确定肌肉葡萄糖摄取。
7. 放射性标记的2-脱氧葡萄糖和甘露醇的测定
- 从每个孵育室中加入150μL每个肌肉裂解物和25μL葡萄糖摄取孵育培养基，以分离含有2mL液体闪烁液的液体闪烁计数小瓶。此外，制备两个仅含有3 mL液体闪烁液的盲控瓶。关闭所有小瓶，并通过涡旋每个小瓶约5秒彻底混合。
- 将小瓶置于液体闪烁计数器中，并根据制造商的指南测量[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇的放射性。记录每个液体闪烁小瓶的DPM（每分钟崩解次数）。
8. 肌肉葡萄糖摄取率的计算
- 使用步骤6.1中的裂解物，使用标准蛋白质定量方法（例如，比辛可宁酸或布拉德福德测定）测量每个肌肉样品中的总蛋白质浓度。计算添加到每个闪烁小瓶中的蛋白质（mg）的量。
注意：每个肌肉样本的葡萄糖摄取速率是通过从肌肉样品中[3H]2-脱氧-D-葡萄糖的总量中减去位于细胞外空间的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖的量来计算的，使用[14C]甘露醇作为细胞外标志物。假设[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇在孵育期间在肌肉组织内表现出相似的扩散特性。执行以下计算： - 首先从所有肌肉和培养基样本中减去盲对照样本的 [3H] 和 [14C] DPM。
- 确定以μL（μL-ECS）为单位的肌肉细胞外空间：
[14摄氏度]DPM肌肉 / （[14C]DPM媒体 / M卷） - 计算肌肉细胞外空间（[3H]DPMECS）中[3H]DPM的量：
μL-ECS × （[3H]DPM介质 / M体积） - 计算肌肉细胞内空间（[3H]DPMICS）中[3H]DPM的量：
[3小时]DPM肌肉− [3H]DPM弹性体 - 计算肌肉葡萄糖摄取率（μmol/g蛋白质/小时）：
[3小时]DPMICS / （[3H]DPM培养基 / Mvol） / [2-脱氧-D-葡萄糖]）） / mg 蛋白） / Th
注：对于上述所有方程，
[14摄氏度]DPM肌肉是肌肉 样品中[14C]甘露醇放射性的量;
[14摄氏度]DPM培养基是培养 基样品中[14C]甘露醇放射性的量;
[3小时]DPM肌肉是肌肉 样品中[3H]2-脱氧-D-葡萄糖放射性的量;
[3小时]DPM培养基是培养基样品中[3H]2-脱氧-D-葡萄糖放射性的量;
[3小时]DPMECS 是肌肉细胞外空间中[3H]2-脱氧-D-葡萄糖放射性的量;
[3小时]DPMICS 是肌肉细胞内空间中[3H]2-脱氧-D-葡萄糖放射性的量;
μL-ECS是μL中的肌肉细胞外空间;
Mvol 是用于闪烁计数的孵育培养基的体积（μL）（例如，如上所述的'25'）;
Th 是用于计算每小时摄取率的时间因子（即，当用葡萄糖摄取培养基孵育肌肉 10 分钟时，“1/6”） - 请考虑此示例计算。盲对照样品（分别为17和6）的[3H]和[14C]DPM已从下面提到的DPM值中减去。
[14摄氏度]DPM肌肉： 343
[14摄氏度]DPM媒体： 11846
[3小时]DPM肌肉： 4467
[3小时]媒体：39814
M卷： 25
mg蛋白质：0.396（在150μL肌肉蛋白质裂解物中）
[2-脱氧-D-葡萄糖]： 1 （mM）
Th： 1/6 （h）
μL-ECS = 343 DPM / （11846 DPM / 25 μL） = 0.724 μL
[3小时]DPMECS： 0.724 μL × （39814 DPM / 25 μL） = 1153 DPM
[3小时]DPMICS： 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
葡萄糖摄取： （（3314 DPM / （39814 DPM / 25 μL） / 1 mmol/L） / 0.396 mg 蛋白质） / （1/6 小时） = 31.53 μmol / g 蛋白质 / 小时
9. SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
- 在Laemmli缓冲液中制备比目鱼和EDL肌肉裂解物，并在96°C下加热5分钟。
- 在自铸凝胶上通过SDS-PAGE分离等量的肌肉蛋白，并通过半干转将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。
- 随后，在含有0.05%吐温20和2%脱脂牛奶和探针膜的Tris缓冲盐水中孵育膜，并与相关的一抗和二抗一抗和探针膜。
- 通过化学发光检测蛋白质，并通过数字成像系统对其进行可视化。
10.肌肉糖原、核苷酸、乳酸、肌酸和磷酸肌酸
- 使用高氯酸提取EDL和比目鱼肌肉样品。
- 随后，中和样品并分析它们的乳酸，肌酸和磷酸肌酸，如前所述18。
- 在高氯酸中提取后，通过反相HPLC分析EDL和比目鱼肌中的核苷酸含量。
- 通过如前所述18的荧光法测定酸水解后整个肌肉中糖原匀浆的肌肉糖原含量。
11. 统计
- 使用统计分析软件执行统计分析。
- 使用双向方差分析 （ANOVA） 检验来评估 表 1 中所示值之间的统计差异。
- 使用未成对的学生 t 检验来评估 图2中每组中EDL和比目鱼之间葡萄糖摄取的统计差异。将数据显示为均值±均值标准误差 （SEM）。P < 0.05 被认为具有统计学意义。
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Representative Results
如图2所示，从雌性小鼠分离出的比目鱼和EDL肌之间的基础葡萄糖摄取率相似。在12，13，19，20之前也曾多次报告。在比目鱼和EDL肌肉中，葡萄糖摄取增加约0.8和〜0.6倍，分别达到12和9μmol / g蛋白质/ h，以响应低于最大有效胰岛素浓度（100μU / mL）。当肌肉受到最大有效胰岛素浓度（10 mU / mL）的刺激时，这种增加甚至更高（在比目鱼和EDL肌肉中分别达到33和19μmol / g蛋白质/ h的约4倍和〜2倍）。此外，在比目鱼肌中，亚最大和最大胰岛素刺激的葡萄糖摄取均显着较高，表明与EDL肌相比，比目鱼肌表现出增强的胰岛素敏感性和反应性。这可能与葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）以及胰岛素信号转导换能蛋白蛋白激酶B（Akt）在比目鱼肌中的较高表达有关，而不是EDL肌肉10，21，22，23，24。
与比目鱼肌相比，EDL肌肉中收缩诱导的葡萄糖摄取显着更高（图2），以前也报告了13，19。因此，在比目鱼和EDL肌肉中，葡萄糖摄取增加了约2倍和约2.5倍，分别达到14和22μmol / g蛋白质/ h，以响应电诱导的收缩。 图3 显示了在10分钟刺激期间比目鱼和EDL肌肉的最大肌肉力量产生。如所见且先前报道的19所示，EDL肌肉在刺激期的初始阶段产生更大的力（EDL为225 mN，而比目鱼座为150 mN）。另一方面，与后期的比目鱼肌相比，EDL肌肉在力产生方面表现出更快的下降。这些发现可能是由于比目鱼（1型>2型）和EDL（2型>1型）肌肉25 之间的纤维类型分布差异，因为2型纤维产生更大的力，但与1型纤维相比，疲劳更快26，27。
为了评估胰岛素和收缩对分离的比目鱼和EDL肌肉细胞内信号传导的影响，通过蛋白质印迹技术对Akt Thr308，TBC1结构域成员4（TBC1D4）Ser588，AMPKα Thr172和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）Ser212进行磷酸化（图4）。正如预期的那样，亚最大和最大有效胰岛素浓度诱导Akt Thr308和TBC1D4 Ser588的磷酸化增加，而收缩诱导AMPKα Thr172和ACC Ser212的磷酸化增加。胰岛素和收缩均未导致比目鱼和EDL肌肉中Akt2，TBC1D4，AMPKα2和ACC的总蛋白含量发生变化（图4）。
通过检查孵化比目鱼和EDL肌肉代谢活力的各种标志物，我们观察到与未孵化的肌肉相比，无论肌肉是否在丙酮酸盐或葡萄糖存在下孵育，腺苷核苷酸（ATP，ADP，AMP）（〜15-25%）和肌酸（〜10-35%）的水平总体上降低（表1).另一方面，如果肌肉与葡萄糖一起孵育，则在与丙酮酸盐一起孵育的比目鱼和EDL肌肉中观察到的糖原水平的下降是可以防止的。有趣的是，我们观察到肌苷单磷酸盐（IMP）水平增加了几倍，但仅在孵化的比目鱼肌中。在严重的代谢应激期间，肌肉的IMP水平通常会增加，因为肌肉试图通过将AMP转化为IMP来防止AMP积累，以维持ATP / ADP比28。这表明在孵育期间，与EDL肌肉相比，比目鱼肌的代谢压力更大。这一观点也得到了与丙酮酸盐一起孵育的比目鱼肌中AMPKα Thr172和ACC Ser212磷酸化升高的研究结果的支持（图5）。重要的是，当比目鱼肌与葡萄糖一起孵育时，观察到的IMP水平以及AMPKα Thr172和ACC Ser212磷酸化的增加减少。因此，在含葡萄糖的缓冲液中孵育分离的骨骼肌似乎是有利的，以尽量减少腺苷核苷酸的波动，并防止肌肉长时间孵育时肌肉糖原的下降。关于2-脱氧葡萄糖摄取，我们有证据表明，在丙酮酸存在下孵育肌肉6至8小时将增加基础/静息葡萄糖摄取率。在含有葡萄糖的培养基中孵育肌肉似乎可以防止葡萄糖摄取的这种增加（未发表的数据）。
图1：孵育系统。 （A）具有四个单一孵育室的肌图系统。（二）定制孵化钩。 请点击此处查看此图的大图。
图2：小鼠分离的成熟骨骼肌中的葡萄糖摄取。在 分离的比目鱼（黑条）和EDL（灰条）肌肉中测定2-脱氧葡萄糖摄取，以响应于最低有效胰岛素浓度（100μU / mL），最大有效胰岛素浓度（10 mU / mL）和电诱导收缩（0.2 ms脉冲，100 Hz，1 s / 15s， 30 V，10 分钟）。通过每组学生 t 检验对数据进行分析。###p<0.001， ##p<0.01 vs. soleus 肌肉。值是 SEM ±均值。n = 每组 4-6 个。h，小时。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：响应电诱导收缩的肌肉力量曲线。 计算电刺激期间比目鱼（黑点）和EDL（灰点）肌肉的峰值力产生。每个值对应于每个1-s刺激期最后500 ms的平均值。值是 SEM ±均值。n = 每组 5-6 个。秒，秒。mN，毫牛顿。 请点击此处查看此图的大图。
图 4： Akt Thr308、TBC1D4 Ser588、AMPKα Thr172 和 ACC Ser212 磷酸化以及 Akt2、TBC1D4、AMPKα2 和 ACC 蛋白的代表性蛋白质印迹。 对 图2中描述的小鼠比目鱼和EDL肌肉样品进行蛋白质印迹分析。B，基底。S，亚最大有效胰岛素。M，最大有效胰岛素。C、收缩。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：AMPKα Thr172 和 ACC Ser212 磷酸化以及 AMPKα2 和 ACC 蛋白的代表性蛋白质印迹。 对表1中描述的小鼠比目鱼和EDL肌肉样品进行蛋白质印迹分析。 请点击此处查看此图的大图。
| 非孵育 | 与丙酮酸盐一起孵育1h | 与葡萄糖一起孵育1h | 主要功效 | 互动 | ||||
| 比目鱼 | 断续器 | 比目鱼 | 断续器 | 比目鱼 | 断续器 | |||
| 授乳 | 1.00 ± 0.01 | 1.00 ± 0.02 | 0.96 ± 0.03 | 0.98 ± 0.02 | 1.05 ± 0.01 | 0.99 ± 0.01 | - | - |
| 铬 | 1.00 ± 0.04 | 1.00 ± 0.06 | 0.64 ± 0.07### | 0.76 ± 0.05### | 0.76 ± 0.07## | 0.88 ± 0.09## | p < 0.001 | - |
| 断续器 | 1.00 ± 0.19 | 1.00 ± 0.06 | 0.80 ± 0.12 | 1.13 ± 0.14 | 0.65 ± 0.31 | 0.75 ± 0.08 | - | - |
| 铬/（铬 + 铬） | 1.00 ± 0.20 | 1.00 ± 0.07 | 1.17 ± 0.11 | 1.25 ± 0.12 | 0.78 ± 0.36 | 0.92 ± 0.11 | - | - |
| 断续器 | 1.00 ± 0.03 | 1.00 ± 0.02 | 0.72 ± 0.03 ###，§§§ | 0.99 ± 0.03 * | 0.81 ± 0.06### | 0.85 ± 0.04## | - | p < 0.001 |
| 断续器 | 1.00 ± 0.04 | 1.00 ± 0.04 | 0.75 ± 0.05### | 0.92 ± 0.03### | 0.84 ± 0.04## | 0.86 ± 0.03## | p < 0.001 | - |
| 放大 器 | 1.00 ± 0.11 | 1.00 ± 0.12 | 0.85 ± 0.15 | 0.79 ± 0.13 | 0.84 ± 0.18 | 0.75 ± 0.13 | - | - |
| 小鬼 | 1.00 ± 0.17 | 1.00 ± 0.30 | 4.43 ± 0.67 ###，§§§ | 0.72 ± 0.29 | 3.33 ± 1.25 ##，§ | 1.08 ± 0.01 | - | p < 0.001 |
| 安培/三磷酸腺苷比 | 1.00 ± 0.12 | 1.00 ± 0.13 | 1.18 ± 0.22 | 0.81 ± 0.16 | 1.06 ± 0.23 | 0.90 ± 0.19 | - | - |
| 糖原 | 1.00 ± 0.08 | 1.00 ± 0.12 | 0.74 ± 0.07 （#），* | 0.80 ± 0.12 （#），* | 1.12 ± 0.10 | 1.10 ± 0.03 | p = 0.035 | - |
| pAMPK Thr172 / AMPKα2 | 1.00 ± 0.10 | 1.00 ± 0.12 | 3.26 ± 0.58 ###，***，§§§ | 1.55 ± 0.27 | 1.68 ± 0.19# | 1.36 ± 0.19 | - | p = 0.002 |
| pACC Ser212 / ACC | 1.00 ± 0.18 | 1.00 ± 0.12 | 2.22 ± 0.58 ###，**，§§ | 0.96 ± 0.21 | 0.99 ± 0.15 | 0.83 ± 0.09 | - | p = 0.030 |
表1：在2mM丙酮酸或5mM葡萄糖存在下孵育1小时的小鼠比目鱼和EDL肌肉的代谢活力比较。 在液氮中冷冻之前，从未孵育的肌肉从麻醉和喂养的动物中解剖。将单独的肌肉在补充了BSA（0.1%），丙酮酸钠（2mM）和D-甘露醇（8mM）的KRH缓冲液中孵育1小时，而其他肌肉则在补充了BSA（0.1%），D-葡萄糖（5mM）和D-甘露醇（5mM）的KRH缓冲液中孵育1小时，然后冷冻在液氮中。将数据转换为相对单位，以突出显示观察到的各种代谢活力标志物的变化。下面给出了来自非孵育小鼠比目鱼和EDL肌肉的绝对值。乳酸盐（毫摩尔/公斤w）：137.53比目鱼;139.05EDL.铬（毫摩尔/千克宽）：9.35比目鱼;8.98EDL.PCr（毫摩尔/千克宽）：1.50比目鱼;5.20EDL.PCr/（PCr+Cr）： 13.98比目鱼;37.30EDL.ATP （毫摩尔/公斤 w.w）： 3.07比目鱼;4.24EDL.ADP （毫摩尔/公斤 w.w）： 0.60比目鱼;0.51EDL.安培（毫摩尔/公斤宽）：0.18比目鱼;0.08EDL.英制（毫摩尔/公斤宽）：0.07比目鱼;0.14EDL.安培/ATP比值： 0.06比目鱼;0.02EDL.糖原（pmol/μg蛋白）：77.01比目鱼;67.56EDL.通过每组内的双向方差分析数据。###p<0.001、##p<0.01 和 #p<0.05 与非孵化。p<0.001，**p<0.01和*p<0.05与葡萄糖一起孵育1小时。§§§p<0.001、§§p<0.01 和 §p<0.05 与 EDL。值是SEM±均值，n = 12在未孵化组中，n = 4-6在孵化组中。铬，肌酸;PCr，磷酸肌酸;w.w， 湿重;h，小时。
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Discussion
骨骼肌葡萄糖摄取的完全调节对于保持整体健康很重要1.因此，在评估各种改变健康的干预措施时，对肌肉葡萄糖摄取的研究通常作为主要读数。在这里，我们描述了一种离体方法，用于测量小鼠分离和孵育的比目鱼和EDL肌肉中葡萄糖摄取，以响应胰岛素和电诱导的收缩。该方法快速可靠，可以精确控制孵化肌肉的周围环境，从而可以准确研究从血液中可以找到的激素和底物的潜在混杂影响中分离出来的肌肉葡萄糖摄取率。该方法已在许多研究中使用了数年，并被肌肉研究界广泛采用。
离体孵育模型通常被认为是一种评估骨骼肌中葡萄糖转运能力而不是葡萄糖摄取的方法。潜伏肌肉中的葡萄糖转运能力可以通过测量一段时间内累积的D-葡萄糖来确定。然而，这带来了一个问题，因为D-葡萄糖在摄取后在肌肉细胞中迅速代谢。为了规避这个问题，葡萄糖类似物3-O-甲基-D-葡萄糖（3-MG）已被广泛用于评估葡萄糖转运能力，因为3-MG在通过细胞表面膜转运后不会在细胞内进一步代谢。因此，细胞内积累的3-MG的初始速率作为细胞葡萄糖转运能力 本身 的指标，因为它不受葡萄糖代谢途径中其他步骤的影响。然而，使用3-MG可能构成一个问题，因为3-MG会积聚从而降低3-MG的跨膜梯度，并随后减少进一步的摄取。因此，为了获得膜转运能力的测量，必须估计3-MG摄取的初始速率。特别是当运输能力高时，由于3-MG从肌肉29，30外流，这可能会造成问题。使用2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）可以避免3-MG外排的潜在问题。转运到骨骼肌后，2-DG被己糖激酶II磷酸化为2-脱氧-D-葡萄糖-6-磷酸（2-DG-6P）。由于骨骼肌缺乏葡萄糖-6-噬菌酶，而GLUT4不能运输磷酸化的2-DG，2-DG-6P将被困在肌肉细胞内。与葡萄糖-6-磷酸相反，2-DG-6P是己糖激酶II30 的非常弱的变构抑制剂，有助于维持2-DG的跨膜梯度。因此，观察表明，在孵化（大鼠）肌肉中的2-DG摄取保持线性，直到细胞内2-DG-6P浓度超过30mM，该浓度降低己糖激酶II活性30。此外，在孵育的小鼠骨骼肌中，当孵育缓冲液的温度为37°C或更低时，2-DG摄取保持线性约30分钟31。这表明2-DG可用于测量孵育肌肉中的葡萄糖转运能力而不是葡萄糖摄取，除非2-DG-6P浓度变得非常高（例如，在孵育期间观察到>2小时，其中1 mM 2-DG和最大胰岛素浓度为29，30）。2-DG摄取可能反映葡萄糖转运能力的观点也得到了研究结果的支持，这些研究结果表明，在野生型小鼠和过度表达己糖激酶II32的小鼠的孵育肌肉中，最大胰岛素刺激的2-DG摄取是相似的。在收缩期间使用2-DG进行肌肉葡萄糖转运测量时，一个潜在的问题是由于糖原分解速率升高而导致的细胞内葡萄糖-6-磷酸盐浓度的增加。然而，由于在29的收缩过程中观察到（大鼠）肌肉2-DG摄取的线性增加，这表明在收缩期间糖原分解产生的葡萄糖-6-磷酸积累不会干扰己糖激酶II活性，因此2-DG摄取率。基于此，考虑到3-MG的局限性，2-DG似乎非常适合测量胰岛素和收缩期间孤立骨骼肌中的葡萄糖转运。
虽然通常认为2-DG在己糖激酶II磷酸化后不会进一步代谢，但据报道，一些2-DG被定向并掺入肌肉糖原中。因此，在大鼠的正常血糖药高胰岛素钳夹中，骨骼肌吸收的2-DG的约30%被掺入糖原33中。因此，如果忽略糖原中2-DG的积累，则可以推断出胰岛素刺激的2-DG在潜伏骨骼肌中的摄取率被低估。我们已经确定，本文中描述的关于如何制备肌肉裂解物（上清液）的方案，用于先前孵育骨骼肌中2-DG摄取率的后续分析不受2-DG掺入糖原中的可能性的影响。可以说，当离心整个肌肉匀浆物以产生用于2-DG摄取测量的裂解物时，糖原积聚在颗粒中。然而，当比较胰岛素刺激的全肌肉匀浆与裂解物的放射性水平时，我们没有检测到任何显着差异（未发表的数据）。这表明在1 mM的2-DG中孵育小鼠肌肉10分钟不会导致2-DG在糖原中可检测到的积累。
在不考虑2-DG分布在细胞外和细胞内空间的情况下测定骨骼肌2-DG摄取将导致2-DG摄取的高估。为了避免这种情况，L-葡萄糖应用作细胞外标志物，因为它不会通过细胞膜运输，而是表现出与D-葡萄糖相似的性质，包括质量，溶解度，被动扩散，结合等。由于制造成本过高，因此购买L-葡萄糖，甘露醇通常用作细胞外标志物，因为甘露醇不被肌肉细胞吸收，相对便宜，并且估计具有与葡萄糖和2-DG34相似的细胞外分布体积。
内在细胞和分子钟似乎对全身代谢和能量稳态的调节起着至关重要的作用35.已经观察到，核心时钟基因 Bmal1 的肌肉特异性敲除损害了孤立的小鼠骨骼肌36中胰岛素刺激的葡萄糖摄取。此外，孤立骨骼肌的次最大胰岛素刺激葡萄糖摄取表现出昼夜节律，在明暗期中间分别表现出最低和最高的胰岛素反应，分别为37。因此，基于这些发现，将动物犧牲的时间纳入实验设计中以提高数据的可重复性非常重要。
离体法的一个主要缺点是孤立的肌肉中缺乏毛细血管流动。这意味着各种基质的输送和去除完全取决于肌肉纤维与周围环境之间的简单扩散。因此，对分离的离体孵育肌肉的代谢活力的验证一直集中在氧气对浅表和深层肌肉纤维的扩散限制上。因此，孵育肌肉，特别是高代谢的小鼠肌肉，倾向于发展缺氧核心，其中糖原发生分解16，17，38。在Bonen及其同事15的详细综述中，建议当孵育肌肉太厚而无法适当氧化时，特别是在≥37°C的温度下孵育时，可能会形成孵化肌肉的缺氧核心。 这导致建议仅使用薄而圆柱形的小鼠肌肉（例如比目鱼和EDL）在25-30°C下孵育，以避免缺氧核心的发展。这表明厚度和几何形状而不是质量是孵育小鼠骨骼肌时要考虑的重要因素。此外，建议应测量孵育温度、肌肉厚度以及ATP、磷酸肌酸和糖原含量和/或乳酸释放，并常规报告，以评估孵育肌肉的活力15。据我们所知，这种对孵化肌肉的完整分析主要报道了针对大鼠肌肉39，40，41，42 ，并且仅在有限程度上报告了针对小鼠肌肉的16，17。为了更深入地了解孵化小鼠骨骼肌中各种代谢标志物的活力，我们评估了在葡萄糖或丙酮酸补充的KRH缓冲液中孵育1小时后，比目鱼和EDL肌肉中乳酸，肌酸，磷酸肌酸，腺苷核苷酸，糖原和AMPK信号传导的细胞内含量的可能变化。与先前在孵育小鼠比目鱼和EDL肌肉17中的发现类似，我们观察到当肌肉在无葡萄糖培养基中孵育时，糖原水平降低。这表明孵育期间葡萄糖的缺乏促进糖原分解和随后葡萄糖-6-磷酸进入糖酵解，这可能起到确保ATP产生的作用，特别是在氧气供应不足的情况下。此外，我们发现孵育比目鱼和EDL肌肉中ATP和ADP核苷酸池的整体减少。这可能意味着氧气供应在存在和不存在葡萄糖的情况下都不完全足以满足孵育小鼠肌肉的需求。由于与糖酵解EDL肌肉相比，氧化比目鱼皮肌更多地依赖氧气产生ATP，这表明比目鱼肌肉受到孵育过程的影响更大。一致地，我们发现在没有葡萄糖的情况下孵育时，与EDL肌肉相比，比目鱼的IMP和AMPK信号传导的细胞内水平显着增加。这意味着比目鱼肌在孵育期间表现出更高程度的代谢应激，在评估来自离体小鼠肌肉模型的数据时必须考虑到这一点。
培养的肌肉细胞，包括永生化的L6和C2C12以及原代人肌管，通常用作成熟骨骼肌的替代品，以研究各种遗传和药理学操作对胰岛素刺激的肌肉葡萄糖摄取的影响。然而，在几个方面，培养的肌肉细胞不像成熟的骨骼肌，并且当比较两个模型系统时，许多差异变得明显。这些包括蛋白质表达，尺寸结构，周围环境，增殖和分化状态，纤维类型组成，代谢过程和功能特性43 的差异，所有这些都可能影响肌肉细胞如何调节葡萄糖摄取以响应各种刺激。通常，与培养的肌肉细胞44 相比，在成熟骨骼肌中观察到胰岛素对葡萄糖摄取率的相对影响更大，这可能表明培养的肌肉细胞在某种程度上缺乏负责调节葡萄糖摄取率的机制，包括胰岛素敏感葡萄糖转运蛋白GLUT4的高水平表达43.考虑到与使用培养的肌肉细胞和分离的骨骼肌相关的局限性和警告，因此在研究各种肌肉代谢过程（例如葡萄糖摄取）时，采取联合方法可能是有利的。
Soleus和EDL肌肉通常分别被认为是慢抽搐和快速抽搐肌肉的代表。因此，这些肌肉类型非常适合寻求研究影响肌肉力量和疲劳发展的干预措施的机械研究。此外，据报道，与EDL肌肉相比，比目鱼肌通常具有增强的胰岛素敏感性和反应性，因此，针对肌肉胰岛素敏感性的干预措施可能对比目鱼和EDL的影响不同。此外，不同AMPK复合物在比目鱼和EDL肌肉之间的相对分布不同，这似乎会影响AMPK激活化合物增加肌肉葡萄糖摄取的能力。因此，如果在使用离体孵育模型进行实验期间同时使用比目鱼和EDL肌肉，则可能实现对肌肉葡萄糖摄取调节的最大见解。
本文中描述的方法涉及葡萄糖摄取到匀浆后测定的每个肌肉样品中总蛋白质丰度的量。根据我们的经验，当将每量肌肉蛋白质的葡萄糖摄取量而不是肌肉重量联系起来时，变异会减少（未发表的数据）。此外，在用于各种生化测定的缓冲液中对肌肉样品进行均质化使得在同一样品制备45，46中可以测定葡萄糖摄取，肌细胞信号传导和酶活性。这通常会减少用于研究的小鼠数量。然而，在骨骼肌样品中可以很容易地测定葡萄糖摄取，这些骨骼肌样品通过加热氢氧化钠（NaOH）溶解，然后用氯化氢20中和。由于用NaOH治疗肌肉会干扰总肌肉蛋白浓度的测量，因此通过该程序测量的葡萄糖运输必须与肌肉重量有关。
基于各种优化，我们的葡萄糖摄取孵育缓冲液含有0.028 MBq / mL的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和0.0083 MBq / mL的[14C]甘露醇的比活性。一方面，这降低了裂解物的量（400μL中的150），以获得足够可靠的放射性测量。另一方面，它增加了每个实验所需的放射性[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇的量，这增加了实验成本。因此，对于任何实验设置，都可以调节葡萄糖摄取孵育培养基中使用的放射性量以适应特定要求。然而，必须注意不要将孵育缓冲液中的放射性降低到使放射性测量不可靠的程度。这是通过将样品中的放射性保持在高于所用液体闪烁计数机械的指定检测限来确保的。
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Disclosures
作者无事可披露
Acknowledgments
这项工作得到了丹麦医学科学独立研究委员会（FSS8020-00288B）和诺和诺德基金会（NNF160C0023046）的资助。这项工作还得到了丹麦糖尿病学院向Rasmus Kjøbsted提供的研究资助，该基金由诺和诺德基金会资助，拨款编号为NNF17SA0031406。作者要感谢Karina Olsen，Betina Bolmgren和Irene Bech Nielsen（哥本哈根大学理学院营养，运动和运动系）提供熟练的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
References
- DeFronzo, R., Tripathy, D. Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes. Diabetes Care. 32, suppl_2 157-163 (2009).
- Coyle, E. F., et al. Carbohydrate feeding during prolonged strenuous exercise can delay fatigue. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 55 (1), Pt 1 230-235 (1983).
- Kim, J. K. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivity in vivo. Methods in Molecular Biology. 560, 221-238 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiological Reviews. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Sanders, C. A., Levinson, G. E., Abelmann, W. H., Freinkel, N. Effect of exercise on the peripheral utilization of glucose in man. The New England Journal of Medicine. 271, 220-225 (1964).
- Barrington, S. F., Maisey, M. N. Skeletal muscle uptake of fluorine-18-FDG: effect of oral diazepam. Journal of Nuclear Medicine Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 37 (7), 1127-1129 (1996).
- Fentz, J., et al. AMPKα is critical for enhancing skeletal muscle fatty acid utilization during in vivo exercise in mice. FASEB Journal. 29 (5), 1725-1738 (2015).
- Maarbjerg, S. J., et al. Genetic impairment of AMPKalpha2 signaling does not reduce muscle glucose uptake during treadmill exercise in mice. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 297 (4), 924-934 (2009).
- Stöckli, J., et al. The RabGAP TBC1D1 plays a central role in exercise-regulated glucose metabolism in skeletal muscle. Diabetes. 64 (6), 1914-1922 (2015).
- Jørgensen, S. B., et al. Knockout of the alpha2 but not alpha1 5'-AMP-activated protein kinase isoform abolishes 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-4-ribofuranosidebut not contraction-induced glucose uptake in skeletal muscle. The Journal of Biological Chemistry. 279 (2), (2004).
- Kjøbsted, R., et al. Prior AICAR stimulation increases insulin sensitivity in mouse skeletal muscle in an AMPK-dependent manner. Diabetes. 64 (6), 2042-2055 (2015).
- Lantier, L., et al. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity, and skeletal muscle integrity. FASEB Journal. 28 (7), 3211-3224 (2014).
- Cokorinos, E. C., et al. Activation of skeletal muscle AMPK promotes glucose disposal and glucose lowering in non-human primates and mice. Cell Metabolism. 25 (5), 1147-1159 (2017).
- Bonen, A., Clark, M. G., Henriksen, E. J. Experimental approaches in muscle metabolism: hindlimb perfusion and isolated muscle incubations. The American Journal of Physiology. 266, 1-16 (1994).
- van Breda, E., Keizer, H. A., Glatz, J. F., Geurten, P. Use of the intact mouse skeletal-muscle preparation for metabolic studies. Evaluation of the model. The Biochemical Journal. 267 (1), 257-260 (1990).
- Sogaard, P., et al. Effects of fibre type and diffusion distance on mouse skeletal muscle glycogen content in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (6), 1189-1197 (2009).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V. Typical fluorometric procedures for metabolite assays. A Flexible System of Enzymatic Analysis. , 68-92 (1972).
- Jensen, T. E., et al. Contraction-stimulated glucose transport in muscle is controlled by AMPK and mechanical stress but not sarcoplasmatic reticulum Ca(2+) release. Molecular Metabolism. 3 (7), 742-753 (2014).
- Kristensen, J. M., Treebak, J. T., Schjerling, P., Goodyear, L., Wojtaszewski, J. F. P. Two weeks of metformin treatment induces AMPK-dependent enhancement of insulin-stimulated glucose uptake in mouse soleus muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (10), 1099-1109 (2014).
- Szekeres, F., et al. The Rab-GTPase-activating protein TBC1D1 regulates skeletal muscle glucose metabolism. AJP: Endocrinology and Metabolism. 303 (4), 524-533 (2012).
- Pehmøller, C., et al. Genetic disruption of AMPK signaling abolishes both contraction- and insulin-stimulated TBC1D1 phosphorylation and 14-3-3 binding in mouse skeletal muscle. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297 (3), 665-675 (2009).
- Ryder, J. W., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., Zierath, J. R. Skeletal muscle reprogramming by activation of calcineurin improves insulin action on metabolic pathways. The Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44298-44304 (2003).
- Long, Y. C., Glund, S., Garcia-Roves, P. M., Zierath, J. R. Calcineurin regulates skeletal muscle metabolism via coordinated changes in gene expression. The Journal of Biological Chemistry. 282 (3), 1607-1614 (2007).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PloS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
- Tullson, P. C., Terjung, R. L. Adenine nucleotide metabolism in contracting skeletal muscle. Exercise and Sport Sciences Reviews. 19, 507-537 (1991).
- Wojtaszewski, J. F., Jakobsen, A. B., Ploug, T., Richter, E. A. Perfused rat hindlimb is suitable for skeletal muscle glucose transport measurements. The American Journal of Physiology. 274 (1), Pt 1 184-191 (1998).
- Hansen, P. A., Gulve, E. A., Holloszy, J. O. Suitability of 2-deoxyglucose for in vitro measurement of glucose transport activity in skeletal muscle. Journal of AppliedPhysiology. 76 (2), 979-985 (1994).
- Watson-Wright, W. M., Tan, M. H., Bonen, A. Insulin binding and 2-deoxy-D-glucose uptake in fast- and slow-twitch mouse skeletal muscle at 18 and 37 degrees C. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 62 (12), 1460-1465 (1984).
- Hansen, P. A., Marshall, B. A., Chen, M., Holloszy, J. O., Mueckler, M. Transgenic overexpression of hexokinase II in skeletal muscle does not increase glucose disposal in wild-type or Glut1-overexpressing mice. The Journal of Biological Chemistry. 275 (29), (2000).
- Virkamäki, A., Rissanen, E., Hämäläinen, S., Utriainen, T., Yki-Järvinen, H. Incorporation of [3-3H]glucose and 2-[1-14C]deoxyglucose into glycogen in heart and skeletal muscle in vivo: implications for the quantitation of tissue glucose uptake. Diabetes. 46 (7), 1106-1110 (1997).
- Bhave, G., Neilson, E. G. Body fluid dynamics: back to the future. Journal of the American Society of Nephrology JASN. 22 (12), 2166-2181 (2011).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Metabolism and the circadian clock converge. Physiological Reviews. 93 (1), 107-135 (2013).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Molecular Metabolism. 3 (1), 29-41 (2014).
- Basse, A. L., et al. Skeletal muscle insulin sensitivity show circadian rhythmicity which is independent of exercise training status. Frontiers in Physiology. 9, 1198 (2018).
- Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 248 (3), 265-270 (1985).
- Wallberg-Henriksson, H. Glucose transport into skeletal muscle. Influence of contractile activity, insulin, catecholamines and diabetes mellitus. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 564, 1-80 (1987).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
- Cleland, P. J., Rattigan, S., Clark, M. G. Glucose-induced loss of exercise-mediated 3-0-methyl glucose uptake by isolated rat soleus and epitrochlearis muscles. Hormone and Metabolic Research. 22 (2), 121-122 (1990).
- Gulve, E. A., Cartee, G. D., Holloszy, J. O. Prolonged incubation of skeletal muscle in vitro: prevention of increases in glucose transport. The American Journal of Physiology. 261 (1), Pt 1 154-160 (1991).
- Deshmukh, A. S., et al. Deep proteomics of mouse skeletal muscle enables quantitation of protein isoforms, metabolic pathways, and transcription factors. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 841-853 (2015).
- Rudich, A., Klip, A. Push/pull mechanisms of GLUT4 traffic in muscle cells. Acta physiologica Scandinavica. 178 (4), 297-308 (2003).
- Kjøbsted, R., et al. Enhanced muscle insulin sensitivity after contraction/exercise is mediated by AMPK. Diabetes. 66 (3), 598-612 (2017).
- Kjøbsted, R., et al. TBC1D4 is necessary for enhancing muscle insulin sensitivity in response to AICAR and contraction. Diabetes. 68 (9), 1756-1766 (2019).
