Summary
筋肉グルコース取り込みの無傷の調節は、全身グルコース恒常性を維持するために重要である。このプロトコルは、全身のグルコース代謝に対する様々な生理学的介入の影響を描写する際に、単離およびインキュベートされた成熟骨格筋におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みの評価を提示する。
Abstract
骨格筋はインスリン応答性組織であり、典型的には食事後に血液に入るグルコースの大部分を吸収する。また、骨格筋は、運動中に血液からのグルコースの抽出を安静時に比べて最大50倍に増加させることが報告されている。運動およびインスリン刺激中の筋肉グルコース取り込みの増加は、細胞内区画から筋細胞表面膜へのグルコーストランスポーター4(GLUT4)の転座、ならびにヘキソキナーゼIIによるグルコースのグルコース-6-リン酸へのリン酸化に依存する。ミレやm.エクステンサー・デジトルム・ロンガス(EDL)などのマウス筋肉の単離とインキュベーションは、成熟骨格筋におけるグルコース取り込みに対するインスリンおよび電気的に誘発された収縮(運動のためのモデル)の影響を研究するための適切なエクスビボモデルである。したがって、ex vivoモデルは、筋インスリン感受性の評価を可能にし、収縮中の筋力産生を一致させ、筋グルコース取り込みの測定中に筋線維の均一な動員を保証することを可能にする。さらに、記載されたモデルは、筋インスリン感受性に影響を与え得るか、または骨格筋グルコース取り込みの調節的複雑さを描写しようとする際に有用であり得る薬理学的化合物試験に適している。
ここでは、放射性標識された[3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールを細胞外マーカーとして用いて、マウスから単離およびインキュベートしたヒラメおよびEDL筋肉調製物におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みを測定する方法に関する詳細なプロトコールを記載および提供する。これにより、無傷の動物モデルに干渉し得る交絡因子の非存在下での成熟骨格筋におけるグルコース取り込みの正確な評価が可能になる。さらに、我々は、インキュベートされたマウス骨格筋の代謝生存率に関する情報を提供し、筋肉エネルギー代謝を研究する際に、適用された方法が特定の条件下でいくつかの注意点を有することを示唆している。
Introduction
骨格筋は、インスリンおよび運動に応答して細胞外空間から大量のグルコースを抽出する能力を有する。これは、全身のグルコース恒常性を維持するのに役立ち、高いエネルギー需要の時にグルコース供給を確保します。骨格筋グルコース取り込みの無傷の調節が全体的な健康および身体能力にとって重要であることが示されているので1,2、様々な状態における筋肉グルコース取り込みの測定は多くの注目を集めている。ヒトおよび動物において、高インスリン血症 - 正常血糖クランプは、インビボでのインスリン感受性を評価するためのゴールドスタンダード技術として使用されている3,4。経口糖負荷試験から得られた所見とは対照的に、高インスリン血糖 - 正常血糖クランプ技術は、無傷の胃腸機能または膵臓からのインスリン分泌を必要としないため、胃腸および/または膵臓機能に変動を示す被験者間でインスリン応答を比較することを可能にする。ヒトにおける運動中の生体内での筋肉グルコース取り込みの測定は、1960年代から頻繁に行われてきた5。最初に動静脈平衡技術6の使用によって、そして後に陽電子放出グルコース類似体例えば18F−フルオロデオキシグルコース7と組み合わせた陽電子放出断層撮影(PET)画像化の使用による。げっ歯類において、運動刺激筋肉インビボでのグルコース取り込みは、典型的には、放射性または安定同位体標識グルコース類似体8、9、10の使用によって行われる。
インビボでの筋肉グルコース取り込みの測定に相補的な方法は、げっ歯類から小筋肉を単離およびインキュベートし、続いて放射性または安定同位体標識グルコース類似体を用いてグルコース取り込みを測定することである11、12、13。この方法は、成熟骨格筋におけるグルコース取り込み速度の正確かつ信頼性の高い定量を可能にし、様々なインスリン濃度の存在下で、および電気刺激によって誘発される収縮中に行うことができる。さらに重要なことに、単離およびインキュベートされた骨格筋におけるグルコース取り込みの測定は、様々な介入(例えば栄養、身体活動、感染、治療薬)を受けたマウスの筋肉代謝表現型を調査する際に関連性がある。単離された骨格筋モデルは、グルコース取り込み自体に影響を及ぼし、および/またはインスリン感受性を変化させる可能性のある薬理学的化合物試験のための適切なツールでもある12,14。このようにして、筋肉グルコース代謝を調節するように設計された化合物の有効性を、前臨床動物モデルにおけるその後のin vivo試験の前に、高度に制御された環境で試験および評価することができる。
いくつかの条件下では、代謝生存率は、単離およびインキュベートされた骨格筋モデル系において課題を提起し得る。実際、インキュベートされた筋肉における循環系の欠如は、基質(例えば酸素および栄養素)の送達が筋線維と周囲の環境との間の単純な拡散に完全に依存することを伴う。これに関して、インキュベートされた筋肉が小さくて薄く、したがって、インキュベーション中の酸素拡散のための障壁が少ないことが重要である15。特に数時間の長時間のインキュベーション中に、酸素供給が不十分で筋肉エネルギーが枯渇するため、低酸素状態が発症することがあります15。インキュベートされたラット筋肉における代謝生存率の様々なマーカーが、ラット筋肉の生存率を維持するのに役立つ重要な変数の同定とともに以前に報告されているが15、小さなインキュベートされたマウス筋肉における代謝生存率の包括的な評価は依然として正当化される。したがって、現在のところ、グリコーゲン含量は、主にインキュベートされたマウス骨格筋における代謝生存率のマーカーとして使用されている16、17。
ここでは、放射性標識された[3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールを細胞外マーカーとして用いて、マウスから単離およびインキュベートしたヒラメ筋およびEDL筋における基礎、インスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みを測定するための詳細なプロトコールについて説明する。本研究では、グルコース取り込みを10分間に測定し、この方法は、サブ最大および最大に有効なインスリン濃度ならびに単一の収縮プロトコールの使用を提示する。しかしながら、本明細書に記載されるプロトコルは、インキュベーション時間、インスリン投与量、および電気刺激プロトコルに関して容易に変更することができる。さらに、インキュベートされたヒラメおよびEDLマウス筋肉における代謝生存率の様々なマーカーの徹底的な特徴付けを提供する。この結果は、インキュベーションバッファーへのグルコース補給が、1時間インキュベートした筋肉の代謝生存率を維持するために不可欠であることを示している。
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Protocol
研究動物に関する手続きは、関連するガイドラインおよび現地の法律に従って実施されるべきである。この研究に使用されたすべての動物実験は、実験的およびその他の科学的目的に使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約に準拠しており、デンマーク動物実験検査官によって承認されました。
1. 実験装置及び縫合ループの作製
注:この研究では、カスタマイズされたインキュベーションフックを備えた統合筋ストリップ筋電図システムを使用して、単離されたマウス骨格筋をインキュベートします(図1)。このシステムは、筋肉が連続的な酸素化(95%O2および5%CO2)および一定の温度で生理学的溶液に浸すことを可能にする。筋組織浴は、収縮中の筋力産生の測定のための力トランスデューサに結合される。収縮中の筋力学的応答を惹起して記録するには、それぞれ電気パルス刺激装置およびデータ収集プログラムを使用する。インキュベートした筋肉を刺激し、筋肉の中央と両側に配置された白金電極によって収縮させます。
- ミオグラフシステムをオンにし、チャンバーを30°Cに温めます。 筋電計システムと互換性のあるオープンデータ収集ソフトウェアと力トランスデューサを較正して、データセット間の比較可能性を確保します。
- まず、約16cmの非吸収性外科用ナイロン縫合糸を切断することから始めます。鉗子を使用して、1本のストランドから直径約0.4cmのループを作成します。十分なループが生成されるまで、これを繰り返します。各筋肉には2つのループが必要です - 1つは近位用、もう1つは遠位腱用です。
2. 溶液およびインキュベーション培地の調製
- 基礎インキュベーション培地の調製
- 2.5 M 塩化ナトリウム (NaCl, 250 mL), 0.5 M 炭酸水素ナトリウム (NaHCO3, 250 mL), 0.5 M 塩化カリウム (KCl, 50 mL), 0.25 M 塩化カルシウム (CaCl 2, 50 mL), 0.25 M リン酸二水素カリウム (KH2 PO 4, 50 mL), 0.25 M 硫酸マグネシウム (MgSO4, 50 mL), 110 mM ピルビン酸ナトリウム (Na-ピルビン酸, 100mL)、500mM D−マンニトール(100mL)、1M 2−デオキシ−D−グルコース(4mL)、クレブス・リンガー・ヘンゼライト(KRH)緩衝液(ステップ4で後述)に対してウシ血清アルブミン(BSA)の15%溶液(100mL)を透析した。
注:安静時および収縮刺激グルコース取り込みを測定するには、2つの溶液が必要です。さらに、インスリン刺激グルコース取り込みを評価するために使用される各単一インスリン濃度は、2つの溶液を必要とする。したがって、単離されたマウス骨格筋における基礎、極小インスリン、最大インスリン、および収縮刺激グルコース取り込みを測定するには、合計6つの異なる溶液が必要である。以下において、「基礎インキュベーション培地」とは、インスリンまたは放射性トレーサーを含まない培地をいう。「インキュベーション培地」は、インスリンを含有する培地を指す。「グルコース取り込みインキュベーション培地」は、「インキュベーション培地」で使用されるものと同じ濃度でインスリンに加えて2−デオキシ−D−グルコースおよび放射性トレーサーを含有する培地を指す。 - 超純水(ddH2O)にNaCl(117 mM)、NaHCO3(24.6mM)、KCl(4.7 mM)、CaCl 2(2.5 mM)、KH 2PO 4(1.2 mM)、および MgSO 4 (1.2 mM) を補充して KRH バッファーを調製します。続いて、KRH緩衝液を95%O2および5%CO2で少なくとも10分間ガス化する。KRH緩衝液の所望のpHは、30°Cで7.35〜7.45の間であるべきである。 pH調整を室温で行う場合、KRH緩衝液のpHは7.25〜7.35の範囲でなければなりません。
- BSA(0.1%)、ピルビン酸Na(2 mM)、およびD-マンニトール(8 mM)をガス化およびpH調整KRH緩衝液に加え、基礎インキュベーション培地を完成させた。基礎インキュベーション培地を密閉容器に保管して、O2 およびCO2 の脱気を最小限に抑え、培地を30°Cで配置する。
注:典型的には、KRHサプリメント(すなわち、Na-ピルビン酸、D-マンニトール、およびD-グルコース)の浸透圧は、筋肉細胞の収縮または膨張を避けるために、実験全体にわたって一定に保たれる。本明細書に記載のプロトコルは、KRHサプリメントに対して10mMのオスモル濃度を使用する。グルコース含有緩衝液が必要な場合は、KRHサプリメントをニーズに合わせて交換してください(例:5 mM D-グルコースおよび5 mM D-マンニトール)。 - インキュベーションバッファー中のBSA関連汚染物質の可能性を回避するために、KRHに対してBSAを透析します。
- KRH緩衝液に対して透析して15%BSAストック溶液を作るには、まず300gの分析グレードの無脂肪BSAを900mLのKRH緩衝液に溶解します。次に、透析チューブを再蒸留水でチューブが柔らかくなるまで沸騰させます。
- チューブにBSA-KRH溶液を充填し、チューブの端部を固定します。BSA-KRHを含むチューブを5LのKRHバッファーに入れ、4°Cで一晩放置する。 翌日、KRH緩衝液を交換し、チューブをBSA-KRHと共にKRH緩衝液中に4°Cで一晩放置した。
- 最後に、チューブからBSA-KRH溶液を収集し、KRH緩衝液を最終容量2L(すなわち、15%BSA-KRHストック溶液)に添加する。15%BSA-KRHストック溶液をアリコートに分割し、〜-20°Cの冷凍庫に保管する。
- 2.5 M 塩化ナトリウム (NaCl, 250 mL), 0.5 M 炭酸水素ナトリウム (NaHCO3, 250 mL), 0.5 M 塩化カリウム (KCl, 50 mL), 0.25 M 塩化カルシウム (CaCl 2, 50 mL), 0.25 M リン酸二水素カリウム (KH2 PO 4, 50 mL), 0.25 M 硫酸マグネシウム (MgSO4, 50 mL), 110 mM ピルビン酸ナトリウム (Na-ピルビン酸, 100mL)、500mM D−マンニトール(100mL)、1M 2−デオキシ−D−グルコース(4mL)、クレブス・リンガー・ヘンゼライト(KRH)緩衝液(ステップ4で後述)に対してウシ血清アルブミン(BSA)の15%溶液(100mL)を透析した。
- インスリンを含有するインキュベーション培地の調製
- 最大以下の有効インスリン濃度を含むインキュベーション培地の場合、基礎インキュベーション培地(100 μU/mLインスリン)の1 mLあたり100 mU/mLインスリンストック溶液を1 μL加えます。
- 最大有効インスリン濃度を含むインキュベーション培地の場合、基礎インキュベーション培地(10 mU/mLインスリン)1 mLあたり10 U/mLインスリンストック溶液を1 μL加えます。
- グルコース取り込みインキュベーション培地の調製
注意:放射性物質の取り扱いは、許可された職員によって制限および管理された地域でのみ許可されており、一部の大学、研究機関、企業では「放射能使用許可証」の取得が必要な場合があります。材料と廃棄物は、適切な現地の手順、ガイドライン、および法律に従って処理する必要があります。- セクション 2.1.2 で説明されているのと同じ手順に従います。
- BSA(0.1%)、ピルビン酸Na(2mM)、D-マンニトール(7mM)、および2-デオキシ-D-グルコース(1mM)をガス化およびpH調整KRH緩衝液に加える。
- 補充されたKRH緩衝液に[3H]2-デオキシ-D-グルコース(0.028 MBq/mL)および[14C]マンニトール(0.0083 MBq/mL)を加え、グルコース取り込みインキュベーション培地を完成させる。30°Cで保存してください。 [3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールがエタノールに溶解している場合は、使用前にN2 媒介蒸発によりエタノールを除去する。
- 最大以下の有効インスリン濃度を含むグルコース取り込みインキュベーション培地の場合、グルコース取り込みインキュベーション培地(100 μU/mLインスリン)の1 mLあたり100 mU/mLのインスリンストック溶液を1 μL加えます。
- 最大有効インスリン濃度を含むグルコース取り込みインキュベーション培地の場合、グルコース取り込みインキュベーション培地(10 mU/mLインスリン)1 mLあたり10 U/mLインスリンストック溶液を1 μL加える。
3.動物および孵卵のためのマウスヒラメおよびEDL筋肉の解剖
注:研究動物に関する手続きは、関連するガイドラインおよび現地の法律に従って行う必要があります。記載された手順は、様々な系統および遺伝的背景を有する自家飼育または市販の雄および雌マウスと共に使用することができる。以下の手順は、給餌された雌性C57Bl/6Jマウスに対して提供される。平均して、マウスは19週齢であり、体重は25gであった。マウスは、標準的なげっ歯類のチャウおよび水への自由なアクセスを伴う12:12時間の明暗サイクルで維持された。動物実験は現地時間の午前9時~で開始され、すべての動物を2時間以内に屠殺した。
- 4 mLの予備加温(30°C)基礎インキュベーション培地を各インキュベーションチャンバーに追加し、基礎インキュベーション培地が95%O2 および5%CO2で連続的に酸素化されていることを確認します。
- ペントバルビタール(10mg / 100g体重)または他の利用可能な麻酔(例えばトリブロモエタノール)の腹腔内注射でマウスを麻酔する。
注:一部の国では、ペントバルビタールやその他の麻酔薬を取り扱うためのライセンスが必要な場合があります。筋肉解剖を開始する前に、各動物の麻酔を適切に誘導しなければならない。これを確実にするために、尾と脚の反射がテストされます。最適な結果を得るためには、除去中に筋肉を傷つけないように解剖をよく実践する必要があります。 - 麻酔をかけやすいマウスを解剖トレイ(例えば発泡スチロールの蓋)の上に置き、必要に応じて針を使用して前足と後足を固定する。
- 下肢から皮膚を取り除き、アキレス腱と膝関節の両方が見えることを確認します。
- ヒラメ筋の解剖のために、アキレス腱に単一の縫合ループを取り付けることから始める。縫合ループの遠位にあるアキレス腱にエンドウ豆の鉗子を固定し、切断して足からヒラメと腓腹筋を解放します。マウスを横切ってエンドウ豆の鉗子を慎重にスライドさせ、ヒラメの筋肉を露出させます。
- エンドウ豆の鉗子をピン留めし、ヒラメの近位腱の周りに2回目の縫合ループを置きます。次に、近位腱を切断し、腓腹筋のないヒラメ(取り付けられた2つの縫合ループを含む)を解剖する。各縫合ループをそれぞれのフックに取り付けることによって、ヒラメ筋をインキュベーションチャンバーに素早く配置する。
- 鉗子を用いて 前脛骨 炎(TA)を覆う筋膜を除去する。正しく行われれば、TAおよびEDL筋肉の遠位腱は白色で透明で見えるはずである。そして互いに分離した。
- TA筋の遠位腱を切断し、後の分析(例えば、遺伝子型決定)のために筋肉を解剖する。鉗子を使用して、EDL筋肉を周囲の組織から穏やかに解放するが、筋肉をそのまま残し、腱を切らさない。遠位腱の周りに1つの縫合ループを配置し、EDLの近位腱の周りに2番目の縫合ループを配置する。
- 次に、EDL筋を解放する腱を2つの縫合ループで切断し、各縫合ループをそれぞれのフックに取り付けて筋肉をインキュベーションチャンバーに素早く配置します。孵卵中、特にヒラメおよびEDL筋肉の電気的に誘発された収縮中に緊張を失わないためには、腱の周りの縫合ループをタイトな結び目で固定することが非常に重要です。
- 最後に、例えば子宮頸部脱臼によって動物を安楽死させる。
- 筋肉を解剖し、インキュベーションチャンバーに入れたら、各筋肉の安静時張力を〜5mNに調整し、実験プロトコールを開始する前に筋肉を少なくとも10分間プレインキュベートする。
4. 単離されたマウス骨格筋におけるインスリン刺激グルコース取り込み
- ステップ3.9に続いて、基礎インキュベーション培地をインスリンを含まないインキュベーション培地(基礎インキュベーション培地)、最大効果以下のインスリン濃度または最大有効インスリン濃度と交換し、インキュベーションチャンバーに20分間放置する。各インキュベーションチャンバを1分間間隔を空け、それによって筋肉のその後の収穫のための時間を作る。
- 20分間の刺激期間の終わりに、インキュベーション培地を同一濃度のインスリンを含むグルコース取り込みインキュベーション培地と交換し、インキュベーションチャンバ内に10分間放置し、再度各インキュベーションチャンバ間に1分間間隔をあけて放置する。
- グルコース取り込みインキュベーション培地中での10分間のインキュベーションの後、インキュベーションチャンバから筋肉を穏やかに除去し、氷冷基礎インキュベーション培地で洗浄する。その後、縫合ループが除去され、筋肉が液体窒素で凍結される前に、ろ紙上の筋肉を素早く乾燥させる。グルコース取り込みに加えて、様々な細胞内代謝産物およびタンパク質シグナル伝達を調査したい場合は、インキュベートされた筋肉を迅速に採取することが不可欠である。
- 各インキュベーションチャンバーから100 μLのグルコース取り込みインキュベーション培地を収集し、-20°Cで保存します。 これらのサンプル中の放射能の量は、筋肉グルコース取り込みの計算に含まれるであろう。
5. 単離されたマウス骨格筋における収縮刺激グルコース取り込み
注:孤立したマウス骨格筋の収縮を誘導するには、次のプロトコルを使用します:1列車/15秒、各列車1秒の長さは100Hzで送達される0.2msパルスからなる。しかし、単離されたマウス骨格筋の収縮を誘発する他の同様のプロトコルも同様に機能する可能性が高い。重要なことに、インキュベートされた筋肉の最大力発達を生成するように電圧を調整する必要があり、これは実験セットアップに依存する。これが保証されていない場合、筋肉のすべての繊維が収縮しているわけではないというリスクがあります。その結果、データセットにバイアスが発生する可能性があります。
- ステップ3.9に続いて、白金電極を中央および筋肉の両側に配置する。基礎インキュベーション培地をグルコース取り込みインキュベーション培地で交換した直後に筋肉の収縮を開始する。可能であれば、各インキュベーションチャンバを1分間間隔を空け、その後の筋肉の収穫のための時間を作る。インキュベートされた各筋肉からの力の生産を記録することを忘れないでください。
- グルコース取り込みインキュベーション培地で10分間収縮した後、白金電極を取り外し、インキュベーションチャンバから筋肉を静かに集め、氷冷基礎インキュベーション培地で洗浄する。その後、縫合糸ループが除去され、筋肉が液体窒素で凍結する前に、ろ紙上の筋肉を素早く乾燥させる。筋肉採取手順全体は、できるだけ早く実行する必要があります。
- 各インキュベーションチャンバーから100 μLのグルコース取り込みインキュベーション培地を収集し、-20°Cで保存します。 これらのサンプル中の放射能の量は、筋肉グルコース取り込みの計算に含まれるであろう。
6. 骨格筋の均質化と処理
注:筋肉の均質化のために以下に与えられる手順は、筋肉サンプルの同じセットにおけるウェスタンブロッティングによってグルコース取り込みおよび筋細胞シグナル伝達の両方を決定することを可能にする。
- 10%グリセロール、20 mM ピロリン酸ナトリウム、1% IGEPAL CA-630 (NP-40)、2 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド (イソプロパノールに溶解)、150 mM NaCl、50 mM HEPES、20 mM β-グリセロリン酸、10 mM フッ化ナトリウム (NaF)、1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 (EGTA)、10 μg/ml アプロチニンを含む pH 7.5 で各筋肉をホモジナイズし、 10 μg/mL のロイペプチン、3 mM ベンズアミジン、および 2 mM ナトリウム - オルトバナジン酸塩をスチールビーズと組織溶解装置 (30 Hz で 2 x 45 s) を使用。すべてのホモジネートを4°Cで1時間エンドオーバーエンド回転させた後、16,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 筋肉のグルコース取り込みを決定するために使用される溶解液(上清)を収集します。
放射性標識2-デオキシグルコースおよびマンニトールの測定
- 各インキュベーションチャンバから150 μLの各筋肉溶解物および25 μLのグルコース取り込みインキュベーション培地を、2 mLの液体シンチレーション流体を含む別々の液体シンチレーション計数バイアルに加える。さらに、3mLの液体シンチレーション液のみを含む2つのブラインドコントロールバイアルを調製する。すべてのバイアルを閉じ、各バイアルを約5秒間ボルテックスして徹底的に混合します。
- バイアルを液体シンチレーションカウンターに入れ、[3H]2-デオキシ-D-グルコースと[14C]マンニトールの放射能をメーカーのガイドラインに従って測定します。各液体シンチレーションバイアルのDPM(1分あたりの崩壊)を記録します。
8. 筋肉のグルコース取り込み率の計算
- ステップ6.1からの溶解物を使用して、標準的なタンパク質定量法(例えば、ビシンコニン酸またはブラッドフォードアッセイ)を使用して、各筋肉サンプル中の総タンパク質濃度を測定する。各シンチレーションバイアルに添加するタンパク質量(mg)を計算する。
注:各筋肉サンプルのグルコース取り込み率は、[14C]マンニトールを細胞外マーカーとして用いた筋肉サンプル中の[3H]2-デオキシ-D-グルコースの総量から細胞外空間に位置する[3H]2-デオキシ-D-グルコースの量を差し引くことによって計算される。[3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールは、インキュベーション中に筋肉組織内で同様の拡散特性を示すと推定される。次の計算を実行します。 - まず、すべての筋肉および培地サンプルから盲検対照サンプルの[3H]および[14C]DPMを差し引くことから始めます。
- 筋肉細胞外空間をμL(μL-ECS)で決定する:
[14C]DPM筋肉 / ([14C]DPMメディア / Mボリューム) - 筋肉細胞外空間における[3H]DPMの量を計算する([3H]DPMECS):
μL-ECS × ([3H]DPM培地 / Mvol) - 筋肉細胞内空間における[3H]DPMの量を計算する([3H]DPMICS):
[3時間]DPM筋肉− [3時間] DPMECS - 筋肉グルコース取り込み速度(μmol/gタンパク質/時間)を計算する:
[3時間]DPMICS / ([3H]DPM培地 / Mvol) / [2-デオキシ-D-グルコース])) / mg タンパク質) / Th
注: 上記のすべての方程式について、
[14C]DPM筋 は、筋肉サンプル中の[14C]マンニトール放射能の量である。
[14C]DPM培地は、培地 サンプル中の[14C]マンニトール放射能の量である。
[3時間]DPM筋 は、筋肉サンプル中の[3H]2-デオキシ-D-グルコース放射能の量である。
[3時間]DPM培地は、培地サンプル中の[3H]2-デオキシ-D-グルコース放射能の量である。
[3時間]DPMECS は、筋肉細胞外空間における[3H]2-デオキシ-D-グルコース放射能の量である。
[3時間]DPMICS は、筋肉細胞内空間における[3H]2-デオキシ-D-グルコース放射能の量である。
μL-ECSは、μLにおける筋肉細胞外空間である。
Mvolは、シンチレーション計数に使用されるインキュベーション培地の体積(μL)である(例えば、上述のように'25')。
Th は、1時間あたりの取り込み速度を計算するために使用される時間係数です(すなわち、筋肉をグルコース取り込み培地で10分間インキュベートしたときの「1/6」)。 - この計算例を考慮してください。盲検対照試料(それぞれ17および6)の[3H]および[14C]DPMを、以下に述べるDPM値から差し引いた。
[14C]DPMの筋肉: 343
[14C]DPMメディア: 11846
[3時間]DPMの筋肉: 4467
[3時間]DPMメディア: 39814
M巻:25
mgタンパク質:0.396(150μL筋肉タンパク質溶解液中)
[2-デオキシ-D-グルコース]:1(mM)
T h: 1/6 (h)
μL-ECS = 343 DPM / (11846 DPM / 25 μL) = 0.724 μL
[3時間]DPMECS: 0.724 μL × (39814 DPM / 25 μL) = 1153 DPM
[3時間]DPMICS: 4467 DPM - 1153 DPM = 3314 DPM
グルコース取り込み:((3314 DPM/(39814 DPM/25 μL)/1 ミリモル/L)/0.396 mgタンパク質)/(1/6時間)=31.53 μmol/gタンパク質/時間
9. SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析
- ヒラメおよびEDL筋溶解物をLaemmli緩衝液中で調製し、96°Cで5分間加熱する。
- セルフキャストゲル上のSDS-PAGEによって等量の筋肉タンパク質を分離し、セミドライブロッティングによってタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に転写する。
- 続いて、0.05%Tween 20および2%スキムミルクおよびプローブ膜を含むトリス緩衝生理食塩水中で膜を関連する一次抗体および二次抗体と共にインキュベートする。
- 化学発光でタンパク質を検出し、デジタルイメージングシステムで可視化します。
10.筋肉グリコーゲン、ヌクレオチド、乳酸塩、クレアチン、およびホスホクレアチン
- 過塩素酸を使用してEDLおよびヒラメ筋サンプルを抽出します。
- 続いて、サンプルを中和し、前述のように乳酸塩、クレアチン、およびホスホクレアチンについて分析する18。
- 過塩素酸での抽出後の逆相HPLCによりEDLおよびヒラメ筋中のヌクレオチド含有量を分析する。
- 18に記載した蛍光法によって酸加水分解後のグリコシル単位として全筋ホモジネート中の筋グリコーゲン含量を決定する。
11. 統計
- 統計分析ソフトウェアで統計分析を実行します。
- 二元配置分散分析(ANOVA)検定を使用して、 表1に示す値間の統計的差を評価します。
- 不対の学生 t検定 を使用して、 図2に示す各グループ内のEDLとヒラメの間のグルコース取り込みの統計的差を評価します。平均の標準誤差(SEM)±手段としてデータを提示する。P<0.05は統計的に有意であると考えられる。
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Representative Results
図2に示すように、基礎グルコース取り込み速度は、雌マウスから単離されたヒラメとEDL筋との間で類似していた。これはまた、12、13、19、20の前に数回報告されています。グルコース取り込みは、最大以下の有効インスリン濃度(100μU/mL)に応答して、ヒラメ筋およびEDL筋においてそれぞれ12および9μmol/gタンパク質/ hに達し、〜0.8倍および〜0.6倍増加した。この増加は、筋肉が最大有効インスリン濃度(10mU/mL)で刺激された場合、さらに高かった(ヒラメ筋およびEDL筋でそれぞれ約4倍および約2倍に達し、それぞれ33および19μmol/gタンパク質/hに達する)。さらに、最大以下および最大インスリン刺激グルコース取り込みの両方がヒラメ筋において有意に高かったことは、ヒラメ筋がEDL筋と比較してインスリン感受性および応答性亢進を示すことを示している。これは、EDL筋10、21、22、23、24と比較して、ヒラメ筋におけるグルコーストランスポーター4(GLUT4)ならびにインスリンシグナル伝達トランスデューサプロテインキナーゼB(Akt)のより高い発現に関連している可能性がある。
収縮誘導グルコース取り込みは、以前に報告されたようにヒラメ筋と比較してEDL筋において有意に高かった(図2)。したがって、グルコース取り込みは、電気的に誘発された収縮に応答して、ヒラメ筋およびEDL筋においてそれぞれ14および22μmol/gタンパク質/ hに達する〜2および〜2.5倍増加した。図3は、10分間の刺激期間中のヒラメおよびEDL筋における最大筋力産生を示す。観察され、以前に報告された19のように、EDL筋肉は刺激期間の初期により多くの力(EDLでは225mN対ヒラメでは150mN)を生成する。一方、EDL筋は、刺激期間の後半においてヒラメ筋と比較して、より速い力産生の低下を示す。これらの知見は、ヒラメ(タイプ1>タイプ2)とEDL(タイプ2>タイプ1)筋25との間の繊維タイプ分布の違いによるものと考えられ、タイプ2繊維はより多くの力を生成するが、疲労はタイプ1繊維26,27と比較して速い。
単離されたヒラメおよびEDL筋における細胞内シグナル伝達に対するインスリンおよび収縮の効果を評価するために、Akt Thr308、TBC1ドメインファミリーメンバー4(TBC1D4)Ser588、AMPKα Thr172およびアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)Ser212のリン酸化をウェスタンブロッティング技術によって行った(図4)。予想されたように、最大かつ最大に有効なインスリン濃度は、Akt Thr308およびTBC1D4 Ser588のリン酸化の増加を誘導し、収縮はAMPKα Thr172およびACC Ser212のリン酸化の増加を誘導した。インスリンも収縮も、ヒラメおよびEDL筋におけるAkt2、TBC1D4、AMPKα2およびACCの総タンパク質含有量の変化をもたらさなかった(図4)。
インキュベートされたヒラメおよびEDL筋肉の代謝生存率の様々なマーカーを調べると、筋肉がピルビン酸またはグルコースの存在下でインキュベートされたかどうかにかかわらず、アデノシンヌクレオチド(ATP、ADP、AMP)(〜15〜25%)およびクレアチン(〜10〜35%)のレベルの全体的な低下が非インキュベート筋肉と比較して観察された(表1).一方、ピルビン酸と共にインキュベートされたヒラメおよびEDL筋肉において観察されるグリコーゲンレベルの低下は、筋肉をグルコースと共にインキュベートした場合に防止された。しかし興味深いことに、イノシン一リン酸(IMP)レベルは数倍に増加したが、インキュベートされたヒラメ筋でのみ増加したことが観察された。筋肉がATP/ADP比を維持するためにAMPをIMPに変換することによってAMP蓄積を防止しようとするので、IMPレベルは典型的には重度の代謝ストレスの間に筋肉において増加する28。これは、ヒラメ筋がインキュベーション中のEDL筋と比較して幾分代謝的にストレスを受けていることを示している。この概念は、ピルビン酸と共にインキュベートされたヒラメ筋におけるAMPKα Thr172およびACC Ser212リン酸化の上昇の知見によっても支持される(図5)。重要なことに、IMPレベルの観察された増加ならびにAMPKα Thr172およびACC Ser212リン酸化は、ヒラメ筋をグルコースと共にインキュベートすると減少する。したがって、単離された骨格筋をグルコース含有緩衝液中でインキュベートして、アデノシンヌクレオチドの変動を最小限に抑え、筋肉を長期間インキュベートしたときに筋肉グリコーゲンの低下を防止することが有利と思われる。2-デオキシグルコースの取り込みに関しては、ピルビン酸の存在下で筋肉を6〜8時間インキュベートすると、基礎/安静時のグルコース取り込み速度が増加することを示唆する証拠があります。グルコースを含む培地中で筋肉をインキュベートすることは、グルコース取り込みのそのような増加を防ぐようである(未発表データ)。
図1:インキュベーションシステム。 (A)4つの単一のインキュベーションチャンバを有するマイオグラフシステム。(B)カスタマイズされたインキュベーションフック。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マウスから単離された成熟骨格筋におけるグルコース取り込み 2-デオキシグルコース取り込みは、最大以下有効インスリン濃度(100μU/mL)、最大有効インスリン濃度(10mU/mL)、および電気的に誘導された収縮(0.2msパルス、100Hz、1s/15s、 30 V、10 分)。データは、各グループ内の学生t検定によって分析された。###p<0.001, ##p<0.01 vs. ヒラメの筋肉。値はSEM±平均であり、n=1群あたり4~6である。h、時間。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:電気的に誘発された収縮に応答した筋力曲線。 電気刺激時のピーク力産生は、ヒラメ(黒点)およびEDL(灰色の点)筋について計算した。各単一値は、各1-s刺激期間の最後の500msの平均に対応する。値はSEM±平均であり、n=1グループあたり5〜6である。s、2番目。mN、ミリニュートン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4: Akt Thr308、TBC1D4 Ser588、AMPKα Thr172およびACC Ser212リン酸化ならびにAkt2、TBC1D4、AMPKα2およびACCタンパク質の代表的なウェスタンブロット。 ウェスタンブロット分析は、 図2に記載のマウスヒラメおよびEDL筋サンプルについて実施した。B、基底。Sは、最大限に有効なインスリンである。M、最大限に有効なインスリン。C、収縮。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:AMPKα Thr172およびACC Ser212リン酸化ならびにAMPKα2およびACCタンパク質の代表的なウェスタンブロット。 ウェスタンブロット分析は、表1に記載のマウスヒラメおよびEDL筋肉サンプルについて実施した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 非インキュベート | ピルビン酸と1時間インキュベート | グルコースと共に1時間インキュベート | 主な効果 | 相互作用 | ||||
| ヒラメ | ティッカー | ヒラメ | ティッカー | ヒラメ | ティッカー | |||
| 乳酸 | 1.00 ± 0.01 | 1.00 ± 0.02 | 0.96 ± 0.03 | 0.98 ± 0.02 | 1.05 ± 0.01 | 0.99 ± 0.01 | - | - |
| クロム | 1.00 ± 0.04 | 1.00 ± 0.06 | 0.64 ± 0.07### | 0.76 ± 0.05### | 0.76±0.07## | 0.88 ± 0.09## | p < 0.001 | - |
| パソコン | 1.00 ± 0.19 | 1.00 ± 0.06 | 0.80±0.12 | 1.13 ± 0.14 | 0.65±0.31 | 0.75 ± 0.08 | - | - |
| PCr/(Cr + PCr) | 1.00 ± 0.20 | 1.00 ± 0.07 | 1.17 ± 0.11 | 1.25 ± 0.12 | 0.78±0.36 | 0.92±0.11 | - | - |
| ティッカー | 1.00 ± 0.03 | 1.00 ± 0.02 | 0.72 ± 0.03 ###,§§§ | 0.99 ± 0.03 * | 0.81±0.06### | 0.85 ± 0.04## | - | p < 0.001 |
| ティッカー | 1.00 ± 0.04 | 1.00 ± 0.04 | 0.75 ± 0.05### | 0.92 ± 0.03### | 0.84 ± 0.04## | 0.86±0.03## | p < 0.001 | - |
| アンプ | 1.00 ± 0.11 | 1.00 ± 0.12 | 0.85±0.15 | 0.79±0.13 | 0.84 ± 0.18 | 0.75±0.13 | - | - |
| 邪鬼 | 1.00 ± 0.17 | 1.00 ± 0.30 | 4.43 ± 0.67 ###,§§§ | 0.72±0.29 | 3.33 ± 1.25 #,§ | 1.08 ± 0.01 | - | p < 0.001 |
| アンプ/ATP比 | 1.00 ± 0.12 | 1.00 ± 0.13 | 1.18 ± 0.22 | 0.81±0.16 | 1.06 ± 0.23 | 0.90±0.19 | - | - |
| グリコーゲン | 1.00 ± 0.08 | 1.00 ± 0.12 | 0.74 ± 0.07 (#),* | 0.80 ± 0.12 (#),* | 1.12 ± 0.10 | 1.10 ± 0.03 | p = 0.035 | - |
| pAMPK Thr172 / AMPKα2 | 1.00 ± 0.10 | 1.00 ± 0.12 | 3.26 ± 0.58 ###,***,§§§ | 1.55 ± 0.27 | 1.68 ± 0.19# | 1.36 ± 0.19 | - | p = 0.002 |
| pACC Ser212 / ACC | 1.00 ± 0.18 | 1.00 ± 0.12 | 2.22 ± 0.58 ##,**,§§ | 0.96±0.21 | 0.99±0.15 | 0.83 ± 0.09 | - | p = 0.030 |
表1:2mMピルビン酸または5mMグルコースの存在下で1時間インキュベートしたマウスヒラメおよびEDL筋肉の代謝生存率の比較。 非インキュベートされた筋肉は、液体窒素中で凍結される前に麻酔および給餌動物から解剖された。別々の筋肉をBSA(0.1%)、ピルビン酸Na(2mM)およびD-マンニトール(8mM)を添加したKRH緩衝液中で1時間インキュベートし、他の筋肉は液体窒素で凍結する前にBSA(0.1%)、D-グルコース(5mM)およびD-マンニトール(5mM)を添加したKRH緩衝液中で1時間インキュベートした。データを相対単位に変換して、代謝生存率の様々なマーカーで観察された変化を強調した。非インキュベートマウスヒラメおよびEDL筋肉からの絶対値を以下に示します。乳酸塩(ミリモル/ kgワット):137.53ヒラメ;139.05EDLです。Cr (ミリモル/キログラムw.w): 9.35ヒラメ;8.98EDL.PCr (ミリモル/キロワット): 1.50ヒラメ;5.20EDLPCr/(PCr+Cr): 13.98ヒラメ;37.30EDL.ATP (ミリモル/キロワット): 3.07ヒラメ;4.24EDL.ADP (ミリモル/キロワット): 0.60ヒラメ;0.51EDL です。AMP (ミリモル/キロワット): 0.18ヒラメ;0.08EDLです。IMP (ミリモル/キロワット): 0.07ヒラメ;0.14EDL です。AMP / ATP比:0.06ヒラメ;0.02EDLです。グリコーゲン(pmol/μgタンパク質):77.01ヒラメ;67.56EDLです。データは、各グループ内の二元配置分散分析によって分析された。###p<0.001、##p<0.01、および#p<0.05対非インキュベート。p<0.001、**p<0.01、および*p<0.05対グルコースと共に1時間インキュベートした。§§§p<0.001、§§p<0.01、および§p<0.05対EDL。値はSEM±平均であり、非インキュベート群ではn=12、インキュベート群ではn=4〜6である。Cr、クレアチン;PCr, ホスホクレアチン;w.w, 湿った重量;h、時間。
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Discussion
骨格筋におけるグルコース取り込みの無傷の調節は、全体的な健康を維持するために重要である1。したがって、筋肉のグルコース取り込みの調査は、様々な健康を変える介入を評価する際の主要な読み出しとしてしばしば役立つ。ここで我々は、インスリンおよび電気的に誘導された収縮に応答してマウスから単離およびインキュベートされたヒラメおよびEDL筋肉におけるグルコース取り込みを測定するためのex vivo方法を説明する。この方法は迅速かつ信頼性が高く、インキュベートされた筋肉の周囲の環境を正確に制御することができ、血液中に見出すことができるホルモンおよび基質の潜在的に交絡する影響から単離された筋肉グルコース取り込み速度の正確な調査を可能にする。この方法は、多くの研究で数年間使用されており、筋肉研究コミュニティによって広く採用されています。
エクスビボインキュベーションモデルは、一般に、骨格筋におけるグルコース取り込みではなくグルコース輸送能を評価する方法と考えられてきた。インキュベートされた筋肉におけるグルコース輸送能力は、一定期間にわたって蓄積されたDグルコースを測定することによって決定することができる。しかし、これはDグルコースが取り込み後に筋細胞内で速やかに代謝されるため、問題となる。この問題を回避するために、グルコース類似体3−O−メチル−D−グルコース(3−MG)は、3−MGが細胞表面膜を横切って輸送された後、細胞内でさらに代謝されないので、グルコース輸送能を評価するために広く使用されている。このように、細胞内に蓄積された3-MGの初期速度は、グルコース代謝経路における他の工程の影響を受けないため、細胞内のグルコース輸送能自体の指標となる。しかしながら、3−MGの使用は、3−MGが蓄積し、それによって3−MGの膜貫通勾配を減少させ、続いてさらなる取り込みを減少させるので、問題を構成し得る。したがって、膜輸送能力の尺度を得るためには、3−MG取り込みの初期速度を推定しなければならない。特に輸送能力が高い場合には、筋肉29、30からの3-MGの流出による問題を提起し得る。3-MG流出の潜在的な問題は、2-デオキシ-D-グルコース(2-DG)を使用して回避することができます。骨格筋への輸送に続いて、2−DGはヘキソキナーゼIIによって2−デオキシ−D−グルコース−6−リン酸(2−DG−6P)にリン酸化される。骨格筋はグルコース-6-ホファターゼを欠いており、GLUT4はリン酸化された2-DGを輸送できないため、2-DG-6Pは筋肉細胞内に捕捉されることになる。グルコース-6-リン酸とは対照的に、2-DG-6PはヘキソキナーゼII30の非常に弱いアロステリック阻害剤であり、2-DGの膜貫通勾配を維持するのに役立ちます。したがって、観察結果は、細胞内2-DG-6P濃度が30mMを超えるまで、インキュベートされた(ラット)筋肉における2-DG取り込みが線形のままであることを示しており、ヘキソキナーゼII活性を低下させる濃度は30である。さらに、インキュベートされたマウス骨格筋では、インキュベーションバッファーの温度が37°C以下の場合、2-DGの取り込みは30分間直線的に保たれます。これは、2-DG-6P濃度が非常に高い状況(例えば、1mM 2-DGおよび最大インスリン濃度29,30で>2時間のインキュベーション中に観察される)を除いて、インキュベートされた筋肉におけるグルコース取り込みではなくグルコース輸送能力を測定するために2-DGを使用することができることを示唆している。2-DGの取り込みがグルコース輸送能を反映している可能性が高いという考えは、最大インスリン刺激2-DGの取り込みが、野生型マウスおよびヘキソキナーゼII32を過剰発現するマウスからのインキュベートされた筋肉において類似していることを示す知見によっても支持される。収縮中の筋肉グルコース輸送測定に2-DGを使用する場合の潜在的な懸念は、グリコーゲン分解速度の上昇による細胞内グルコース-6-リン酸濃度の増加である。しかし、(ラット)筋肉2-DG取り込みの線形増加が経時的な収縮中に観察されるので29、これは収縮中のグリコーゲンの分解からのグルコース-6-リン酸の蓄積がヘキソキナーゼII活性、ひいては2-DG取り込み速度を妨げないことを示している。これに基づいて、2-DGは、3-MGの限界を考慮すると、インスリンおよび収縮中の単離された骨格筋におけるグルコース輸送の測定によく適していると思われる。
ヘキソキナーゼIIによるリン酸化後、2-DGはそれ以上代謝されないことが一般に想定されているが、一部の2-DGが筋グリコーゲンに向けられ、取り込まれることが報告されている。したがって、ラットにおける2時間の正常血糖高インスリン血症クランプの間に、骨格筋によって取り込まれた2−DGの〜30%がグリコーゲン33に取り込まれる。したがって、グリコーゲン中の2-DGの蓄積が無視されると、インキュベートされた骨格筋におけるインスリン刺激2-DGの取り込み速度が過小評価されると推論され得る。我々は、インキュベート前の骨格筋における2-DG取り込み速度のその後の分析のために筋肉溶解物(上清)を調製する方法に関する本明細書に記載されたプロトコールは、グリコーゲンへの2-DGの潜在的な取り込みの影響を受けないことを決定した。グリコーゲンは、筋肉全体のホモジネートを遠心分離して2-DG取り込み測定用の溶解物を生成するときにペレット中に蓄積すると主張することができる。しかし、インスリン刺激全筋ホモジネートとライセートの放射能レベルを比較した場合、有意差は検出されません(未発表データ)。このことは、マウス筋肉を1mMの2-DG中で10分間インキュベートしても、グリコーゲン中に2-DGの検出可能な蓄積を引き起こさないことを示唆している。
2−DGが細胞外および細胞内空間の両方に分布していることを考慮しない骨格筋2−DG取り込みの決定は、2−DG取り込みの過大評価につながるであろう。これを回避するために、L-グルコースは細胞膜を横切って輸送されないが、質量、溶解性、受動拡散、結合などを含むD-グルコースと同様の特性を示すため、細胞外マーカーとして使用する必要がある。マンニトールは筋肉細胞に取り込まれず、比較的安価であり、グルコースおよび2-DG34と幾分類似した細胞外分布量を有すると推定されるため、マンニトールは、製造およびL-グルコースの購入の過剰なコストのために、典型的には細胞外マーカーとして使用される。
固有の細胞時計と分子時計は、全身代謝とエネルギー恒常性の調節に不可欠な役割を果たしているようです35。コアクロック遺伝子 Bmal1 の筋肉特異的ノックアウトが、単離されたマウス骨格筋36におけるインスリン刺激グルコース取り込みを損なうことが観察されている。さらに、単離された骨格筋の最大以下のインスリン刺激グルコース取り込みは、明期および暗期の中間においてそれぞれ最も低いおよび最も高いインスリン応答を有する概日リズムを示す37。したがって、これらの知見に基づいて、データの再現性を高めるためには、動物の犠牲の時間を実験計画に組み込むことが重要です。
エキソビボ法の主な欠点は、単離された筋肉における毛細血管流の欠如である。これは、様々な基質の送達および除去が、筋線維と周囲の環境との間の単純な拡散に完全に依存することを意味する。その結果、エキソビボでインキュベートされた単離された筋肉の代謝生存率の検証は、表面的および深部筋線維への酸素の拡散制限に焦点を当ててきた。したがって、インキュベートされた筋肉、特に代謝性の高いマウス筋肉は、グリコーゲンの分解が起こる低酸素コアを発達させる傾向がある16、17、38。Bonenら15による詳細なレビューでは、インキュベートされた筋肉の低酸素コアは、特に≥37°Cの温度でインキュベートするときに、適切に酸素化されるには厚すぎる筋肉をインキュベートするときに発症する可能性が高いことが示唆された。 これは、ヒラメやEDLなどの薄くて円筒形のマウス筋肉のみを、低酸素コアの発達を避けるために25〜30°Cでの孵化に使用するべきであるという勧告につながった。これは、質量ではなく厚さと幾何学的形状がマウスの骨格筋をインキュベートする際に考慮すべき重要な要素であることを示しています。さらに、インキュベーションされた筋肉の生存率を評価するために、インキュベーション温度、筋肉の厚さ、ならびにATP、ホスホクレアチン、およびグリコーゲン含量および/または乳酸塩の放出を日常的に測定および報告することが推奨された15。我々の知る限りでは、インキュベートされた筋肉のこのような完全な分析は、主にラットの筋肉39、40、41、42について報告されており、マウスの筋肉16、17について報告されたのは限られた程度にすぎない。インキュベートされたマウス骨格筋における生存率の様々な代謝マーカーへの洞察を高めるために、我々は、グルコースまたはピルビン酸補充KRH緩衝液中での1時間のインキュベーション後のヒラメおよびEDL筋肉における乳酸、クレアチン、ホスホクレアチン、アデノシンヌクレオチド、グリコーゲン、およびAMPKシグナル伝達の細胞内含有量の可能な変化を評価した。インキュベートされたマウスヒラメおよびEDL筋肉17における以前の所見と同様に、筋肉をグルコース非含有培地でインキュベートするとグリコーゲンレベルが低下することが観察された。これは、インキュベーション中にグルコースが存在しないことがグリコーゲンの分解を促進し、その後のグルコース-6-リン酸の解糖系への侵入を促進し、特に酸素供給が不十分な場合にATP産生を確保するように作用する可能性があることを示している。さらに、インキュベートされたヒラメおよびEDL筋肉におけるATPおよびADPヌクレオチドプールの全体的な減少を見出した。これは、酸素供給がグルコースの存在下および非存在下の両方でインキュベートされたマウス筋肉の需要を満たすのに十分ではないことを暗示し得る。酸化ヒラメ筋は解糖系EDL筋と比較してATP産生のために酸素に多く依存しているので、これはヒラメ筋がインキュベーション手順によってより大きな影響を受けることを示唆するであろう。一致して、我々は、グルコースの非存在下でインキュベートした場合、IMPおよびAMPKシグナル伝達の細胞内レベルがEDL筋肉と比較してヒラメにおいて顕著に増加することを見出した。これは、ヒラメ筋が孵化中により高い程度の代謝ストレスを示すことを意味し、これはex vivoマウス筋肉モデルからのデータを評価する際に考慮されなければならない。
不死化L6およびC2C12ならびに初代ヒト筋管細胞を含む培養筋細胞は、インスリン刺激筋グルコース取り込みに対する様々な遺伝的および薬理学的操作の影響を研究するために、成熟骨格筋の代理として一般的に使用されている。しかし、いくつかの点で、培養筋細胞は成熟した骨格筋に似ておらず、2つのモデル系を比較すると多くの違いが明らかになる。これらには、タンパク質発現、次元構造、周囲環境、増殖および分化状態、繊維型組成、代謝プロセスおよび機能特性43 の違いが含まれ、これらはすべて、筋肉細胞が様々な刺激に応答してグルコース取り込みを調節する方法に影響を及ぼし得る。典型的には、培養筋肉細胞44 と比較して成熟骨格筋においてグルコース取り込み速度に対するインスリンのより大きな相対的効果が観察され、これは、培養筋肉細胞が、インスリン感受性グルコーストランスポーターGLUT4の高レベルの発現を含む、グルコース取り込み速度を調節する機構をある程度欠いていることを示している可能性がある43.培養筋細胞および単離された骨格筋のいずれかの使用に関連する制限および警告を考慮すると、したがって、グルコース取り込みなどの様々な筋肉代謝プロセスを研究する際に、組み合わせたアプローチをとることが有利である可能性が高い。
ヒラメ筋およびEDL筋は、典型的には、それぞれ遅筋および速筋の代表とみなされる。したがって、これらの筋肉タイプは、筋力および疲労発達に影響を及ぼす介入を調査しようとする機械的研究にとって理想的である。さらに、ヒラメ筋は、典型的には、EDL筋と比較してインスリン感受性および応答性を増強したと報告されており、したがって、筋肉インスリン感受性を標的とする介入は、ヒラメおよびEDLに異なる影響を及ぼす可能性がある。さらに、異なるAMPK複合体の相対分布は、ヒラメとEDL筋の間で異なり、AMPK活性化化合物が筋肉グルコース取り込みを増加させる能力に影響を及ぼすようである。したがって、筋肉グルコース取り込みの調節に関する最大の洞察は、ヒラメ筋とEDL筋肉の両方がエクスビボインキュベーションモデルでの実験中に使用される場合に達成される可能性が高い。
本明細書に記載の方法は、均質化後の各筋肉試料において決定された総タンパク質存在量に対するグルコース取り込みに関する。筋肉の体重ではなく、筋肉タンパク質の量あたりのグルコース取り込みを関連付けると、変動が減少するというのが私たちの経験です(未発表のデータ)。さらに、様々な生化学的アッセイに使用される緩衝液中の筋肉試料の均質化は、同じ試料調製物45、46におけるグルコース取り込み、筋細胞シグナル伝達および酵素活性の両方を決定することを可能にする。これはしばしば研究に使用されるマウスの量を減らすでしょう。それにもかかわらず、グルコース取り込みは、水酸化ナトリウム(NaOH)中で加熱し、続いて塩化水素20で中和することによって溶解される骨格筋サンプルにおいて容易に決定され得る。NaOHによる筋肉の治療は総筋肉タンパク質濃度の測定を妨げるので、この手順によって測定されるグルコース輸送は筋肉重量に関連しなければならない。
さまざまな最適化に基づいて、当社のグルコース取り込みインキュベーションバッファーには、[3H]2-デオキシ-D-グルコースの比活性0.028 MBq/mLと[14C]マンニトールの0.0083 MBq/mLが含まれています。一方では、これは十分で信頼性の高い放射能測定を得るために必要な溶解液の量(400μLのうち150)を減少させる。一方、実験ごとに必要な放射性[3H]2-デオキシ-D-グルコースと[14C]マンニトールの量が増加し、実験コストが増加します。したがって、任意の実験セットアップについて、グルコース取り込みインキュベーション培地に使用される放射能の量を特定の要件に合うように調節することができる。ただし、インキュベーションバッファー内の放射能量を放射能測定を信頼できない程度に減少させないように注意する必要があります。これは、サンプル中の放射能を、使用される液体シンチレーション計数機の指定された検出限界よりも高く保つことによって保証される。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません
Acknowledgments
この研究は、デンマーク独立研究医学評議会(FSS8020-00288B)とノボノルディスク財団(NNF160C0023046)からの助成金によって支援されました。この研究は、ノボノルディスク財団の助成金番号NNF17SA0031406からデンマーク糖尿病アカデミーからラスムス・キョブステッドへの研究助成金によっても支援されました。著者らは、カリーナ・オルセン、ベティナ・ボルムグレン、アイリーン・ベック・ニールセン(コペンハーゲン大学理学部栄養・運動・スポーツ学科)の熟練した技術支援に感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
References
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